晚期非小細(xì)胞肺癌中上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型和表皮生長(zhǎng)因子受體的檢測(cè)及其相關(guān)性研究

柴春香，王曉敏，郭文君，孫永紅（濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院.醫(yī)務(wù)科，.病理科，山東濰坊6000）

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晚期非小細(xì)胞肺癌中上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型和表皮生長(zhǎng)因子受體的檢測(cè)及其相關(guān)性研究

柴春香1，王曉敏2，郭文君2，孫永紅2
（濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院1.醫(yī)務(wù)科，2.病理科，山東濰坊261000）

摘要：目的探討非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型（EMT）與表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）的相關(guān)性。方法免疫組織化學(xué)法（EnVision）檢測(cè)78例晚期NSCLC組織和16例正常肺組織中的EGFR、E-鈣黏素（E-cadherin）和波蛋白（Vimentin）的表達(dá)。EGFR 18～21號(hào)外顯子聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增及基因測(cè)序。結(jié)果78例NSCLC中，EGFR、E-cadherin和Vimentin在NSCLC中陽(yáng)性表達(dá)率分別為61.5%（48/78）、43.6% （34/78）和56.4%（44/78），EGFR基因突變率為24.4%（19/78），正常組為陰性。EGFR野生型組的EMT發(fā)生率高（67.8% vs 21.1%），EGFR蛋白與EMT呈正相關(guān)性（r=0.236，P=0.037）。結(jié)論E-cadherin降低或全部丟失及EGFR通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)通路可以促進(jìn)EMT的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：晚期非小細(xì)胞肺癌；上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型；表皮生長(zhǎng)因子受體

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是目前較常見的腫瘤相關(guān)死亡原因，晚期NSCLC患者發(fā)生淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療效果及預(yù)后較差。腫瘤細(xì)胞的侵襲性是腫瘤轉(zhuǎn)移主要因素之一，研究表明，上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在腫瘤細(xì)胞侵襲過(guò)程中起重要作用，EMT的發(fā)生與多種蛋白分子和信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)，以E-鈣黏素（E-cadherin）表征上皮型指標(biāo)蛋白的喪失以及波蛋白（Vimentin）表征間質(zhì)型指標(biāo)蛋白的獲得為主要特征。表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路在NSCLC的研究中較熱門，尤其是基因檢測(cè)及靶向治療中的應(yīng)用價(jià)值被廣泛認(rèn)可。本實(shí)驗(yàn)對(duì)78例發(fā)生轉(zhuǎn)移的晚期NSCLC患者腫瘤組織中EGFR進(jìn)行基因測(cè)序，E-cadherin、Vimentin和EGFR蛋白進(jìn)行免疫組織化學(xué)法檢測(cè)，分析3者在晚期NSCLC中的臨床意義及內(nèi)在聯(lián)系。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2010年1月-2013年1月在濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院行穿刺或支氣管鏡活檢的晚期NSCLC患者的腫瘤組織。根據(jù)2009年第七版的肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，78例患者臨床分期為Ⅳ期（包括淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）。其中，男性54例，女性24例；年齡＜60 歲30例，≥60歲48例，平均62.5歲；有吸煙史52例，無(wú)吸煙史26例；肺腺癌57例，鱗癌21例。正常肺組織標(biāo)本16例作為對(duì)照組。

1.2方法

將NSCLC組織行石蠟包埋，4μm厚度切片，蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色。

1.2.1DNA提取和聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，RT-PCR）石蠟切片的DNA提?。孩賹?～10個(gè)切片10 000 r/min離心1 min，加入250ul Buffer TL收集管A，90℃孵育1h。②室溫放置1min，12 000 r/min離心2 min，移液器吸取200μl組織液體至1.5ml收集管B中，加入20μl Omega Business蛋白酶（蛋白酶K 20 mg/ml），55℃水浴，過(guò)夜消化。③加入250μl Buffer BL于過(guò)夜消化的液體中，加入4μl助沉劑，70℃水浴箱內(nèi)水浴10 min，期間進(jìn)行DNA吸附柱平衡準(zhǔn)備。④DNA吸附柱中純化，洗脫液體，循環(huán)2次。將吸附柱裝至新的無(wú)菌Eppendorf管中，加入70℃預(yù)熱的Elution Buffer，靜置＞3 min，12 000 r/min離心2 min。對(duì)提取的DNA進(jìn)行質(zhì)量鑒定。PCR擴(kuò)增EGFR 18～21號(hào)外顯子。將PCR產(chǎn)物送至大連寶生生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與正?；蛐蛄羞M(jìn)行比對(duì)分析。1.2.2免疫組織化學(xué)（EnVision）法常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)處理，滴加一抗（EGFR、E-cadherin、Vimentin），37℃培養(yǎng)箱孵育45 min，滴加二抗（K5007），二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸酒精分化，自來(lái)水反藍(lán)，脫水透明，中性樹脂封固。陽(yáng)性對(duì)照采用北京中杉生物科技有限公司提供的陽(yáng)性片，陰性對(duì)照采用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）液代替一抗。判讀方法：陽(yáng)性為細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色顆粒，陰性為無(wú)顯色。E-cadherin、Vimentin和EGFR陽(yáng)性著色在細(xì)胞膜和/或細(xì)胞漿。根據(jù)其染色程度及細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行染色評(píng)分判讀，陽(yáng)性細(xì)胞評(píng)分法：陰性為0分，陽(yáng)性細(xì)胞比例＜25%為1分，陽(yáng)性細(xì)胞比例25%～50%為2分，陽(yáng)性細(xì)胞比例51%～75%為3分，陽(yáng)性細(xì)胞比例＞75%為4分。細(xì)胞染色程度評(píng)分法：腫瘤細(xì)胞不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。上述兩項(xiàng)之和即為腫瘤細(xì)胞的染色評(píng)分，總分0分為陰性（-），1～2分為弱陽(yáng)性（+），3～6分為陽(yáng)性（++），7～12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，率的比較用χ2檢驗(yàn)，1≤T＜5時(shí)，采用校正公式；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析，P＜0.05為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1EGFR、E-cadherin和Vimentin在NSCLC組織中的表達(dá)

78例NSCLC患者基因突變率為24.4% （19/78）。EGFR、E-cadherin和Vimentin陽(yáng)性表達(dá)率分別為61.5%（48/78）、43.6%（34/78）和56.4% （44/78），78例患者的EMT發(fā)生率為56.4%。16例正常肺組織EGFR、E-cadherin和Vimentin為陰性。見圖1～8和表1。

2.2NSCLC組織中EGFR和EMT的表達(dá)及其與臨床病理因素的相關(guān)性

78例NSCLC患者中，腺癌EGFR基因突變率高于鱗癌（50% vs 0%），經(jīng)假設(shè)檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），EGFR基因突變與年齡、性別及吸煙史無(wú)關(guān)（P＞0.05）。鱗癌患者EGFR陽(yáng)性表達(dá)率（81%）高于腺癌患者（54.4%），經(jīng)假設(shè)檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與患者的性別、年齡及吸煙史無(wú)關(guān)（P＞0.05）。男性EMT發(fā)生率（66.7%）高于女性（33.3%），經(jīng)假設(shè)檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；EMT發(fā)生率與組織類型、吸煙史及年齡無(wú)關(guān)（P＞0.05）。見表2。

圖1　E-cadherin在NSCLC腫瘤細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中表達(dá)（EnVision×200）

圖2　Vimentin陰性（EnVision×200）

圖3　Vimentin在NSCLC腫瘤細(xì)胞漿中表達(dá)（EnVision×200）

圖4　E-cadherin陰性（EnVision×200）

圖5　外顯子19雜合缺失突變（DelL747-S752）正向測(cè)序圖

圖6　外顯子19雜合缺失突變（DelL747-S752）反向測(cè)序圖

圖7　外顯子21 858密碼子雜合點(diǎn)突變（CTG>CGG）正向測(cè)序圖

圖8　外顯子21 858密碼子雜合點(diǎn)突變（CTG>CGG）反向測(cè)序圖

2.3EGFR基因型與晚期NSCLC中EMT的相關(guān)性

晚期NSCLC存在EGFR基因突變的EMT發(fā)生率（21.1%）明顯低于無(wú)EGFR基因突變的EMT發(fā)生率（67.8%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P =0.000）。

表1　EGFE和EMT在晚期NSCLC及正常肺組織中的表達(dá)例

表2　臨床病理因素與晚期NSCLC組織中EGFE和EMT表達(dá)的相關(guān)性例

2.4EGFR蛋白與NSCLC中EMT的相關(guān)性

Spearman秩和相關(guān)性分析顯示，78例晚期NSCLC組織中44例發(fā)生EMT，其中32例EGFR陽(yáng)性表達(dá)，12例EGFR陰性表達(dá)；34例未發(fā)生EMT的晚期NSCLC患者中，20例EGFR陽(yáng)性表達(dá)，14例EGFR陰性表達(dá)。對(duì)EMT和EGFR的表達(dá)狀態(tài)進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩指標(biāo)有相關(guān)性（r=0.236，P =0.037）。

3　討論

EMT是上皮細(xì)胞在與周圍間質(zhì)的相互作用過(guò)程中，逐漸獲得某些間質(zhì)細(xì)胞特有性狀的現(xiàn)象，以E-cadherin陽(yáng)性、Vimentin陰性為表征上皮型；以E-cadherin陰性、Vimentin陽(yáng)性為表征間質(zhì)型。Hazan等[1]報(bào)道，E-cadherin及Vimentin細(xì)胞膜或細(xì)胞漿染色與Western blot檢測(cè)結(jié)果有較好的一致性，免疫組織化學(xué)法結(jié)果可以表征EMT狀態(tài)。EMT的發(fā)生涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和上皮表型蛋白丟失[1]，因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析EMT與EGFR的相關(guān)性，初步探討EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能否誘導(dǎo)EMT的形成。

78例NSCLC患者中EGFR基因突變率為24.4%（19/78），腺癌高于鱗癌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），EGFR突變與吸煙及性別無(wú)關(guān)（P＞0.05）。國(guó)內(nèi)報(bào)道，中國(guó)人EGFR突變率為19.2%～33.3%[2-4]。EGFR蛋白在許多腫瘤中過(guò)表達(dá)，在肺癌的表達(dá)率為53%～69%，其與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5]，在本實(shí)驗(yàn)中，NSCLC組織中EGFR蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為61.5%（48/68），腺癌的患者EGFR陽(yáng)性表達(dá)率低于鱗癌患者（P＜0.05），與患者的性別、年齡及吸煙史無(wú)關(guān)，與Pastorino等[6]EGFR蛋白在鱗癌中過(guò)表達(dá)發(fā)生率較高的觀點(diǎn)相同。

本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)NSCLC中E-cadherin和Vimentin的表達(dá)，陽(yáng)性率分別為43.6%和56.4%。本研究發(fā)現(xiàn)，男性EMT發(fā)生率高于女性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），國(guó)內(nèi)部分文獻(xiàn)報(bào)道，E-cadherin和Vimentin的表達(dá)與患者年齡、性別、組織類型及TNM分期無(wú)關(guān)[7-8]，但有待提高樣本量進(jìn)一步分析。E-cadherin和Vimentin的表達(dá)具有較好的一致性。本實(shí)驗(yàn)中EMT的發(fā)生率為56.4%，較田茗源等[9]的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)偏高，筆者分析與本研究對(duì)象為晚期NSCLC患者有關(guān)，腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移，說(shuō)明EMT與NSCLC腫瘤細(xì)胞發(fā)生原位侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究進(jìn)一步證實(shí)來(lái)源于上皮組織的惡性腫瘤中E-cadherin降低或全部丟失，Vimentin表達(dá)升高，細(xì)胞間的粘附力降低，從而促進(jìn)腫瘤組織發(fā)生EMT。

很多細(xì)胞外信號(hào)的生長(zhǎng)因子與EMT的發(fā)生相關(guān)，如HGF、EGF、VEGF等，可以通過(guò)不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)發(fā)生EMT[10-11]，Voon等[12]提出EMT誘導(dǎo)胃干細(xì)胞分化和促進(jìn)腫瘤發(fā)生與EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，78例NSCLC組織中EGFR表達(dá)與EMT發(fā)生相關(guān)（P＜0.05）。在細(xì)胞水平上，EGFR和E-cadherin共同存在于細(xì)胞間的黏著小帶，與β-catenin相連。當(dāng)EGFR過(guò)表達(dá)，與細(xì)胞外的配體結(jié)合，受體自身的酪氨酸發(fā)生磷酸化，使E-cadherin從肌動(dòng)蛋白絲上解離下來(lái)，細(xì)胞間的黏附力下降，促使腫瘤發(fā)生EMT。鄧沁芳等[13]研究發(fā)現(xiàn)，EGFR突變患者的NSCLC上皮表型高于EGFR未突變患者（77.7% vs 18.2%，P＜0.05）。本研究結(jié)果與鄧沁芳等[13]的相反，筆者發(fā)現(xiàn)，晚期NSCLC存在EGFR基因突變的EMT發(fā)生率低于無(wú)EGFR基因突變的EMT發(fā)生率（P＜0.05）。筆者分析，EGFR發(fā)生基因突變時(shí)其介導(dǎo)的信號(hào)通路與誘導(dǎo)EMT發(fā)生的能力減弱。

本實(shí)驗(yàn)可以得出，E-cadherin降低或全部丟失及EGFR通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)通路可以促進(jìn)EMT發(fā)生。同時(shí)，聯(lián)合檢測(cè)EGFR和EMT的表型蛋白有利于判斷腫瘤的惡性程度，為臨床治療及預(yù)后提供更有效的依據(jù)。預(yù)測(cè)EMT的發(fā)生受EGFR基因突變的影響，突變型患者腫瘤不易發(fā)生EMT，而野生型患者易出現(xiàn)間質(zhì)型轉(zhuǎn)化，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Hazan RB, Phillips GR, Qiao RF, et al. Exogenous expression of E-cadherin in breast cancer induces cell migration, invasion and metastasis[J]. J Cell Biol, 2000, 148(4): 779-790.

[2]王瓊,呂亞莉,鐘梅,等.非小細(xì)胞肺癌中的EGFR和K-ras基因突變檢測(cè)分析與病理特征[J].診斷病理學(xué)雜志, 2012, 19(2): 144-147.

[3]欒煥玲,孫蕾娜,董娜,等.非小細(xì)胞肺癌中的EGFR和K-ras基因突變與蛋白表達(dá)相關(guān)性的研究[J].中國(guó)癌癥雜志,2010,20(7):486-491.

[4] Mu XL, Li LY, Zhang XT, et al. Gefitinib-sensitive mutations of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase domain in Chinese patients with non-small cell lung cancer[J]. Clin Cancer Res, 2005, 11(12): 4289-4294.

[5] Jeon YK, Sung SW, Chung JH, et al. Clinico-pathologic features and prognostic implications of epidermal growth factor receptor (EGFR) gene copy number and protine expression in non-small cell lung cancer[J]. Lung Cancer, 2006, 54(3): 387-398.

[6] Pastorino U, Anderola S, Tagliabue E, et al. Immunocytochemical markers in stageⅠlung cancer: relevance to prognosis[J]. J Clin Oncol, 1997, 15(8): 2858-2865.

[7] Thiery JP. Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression[J]. Nat Rev Cancer, 2002, 2(6): 442-454.

[8]石永利,吳鴻雁,等.上皮-間葉轉(zhuǎn)變相關(guān)蛋白在NSCLC中的表達(dá)及其預(yù)后意義[J].中國(guó)癌癥雜志, 2011, 21(5): 342-347.

[9]田茗源,王林輝,等.肺癌組織中E-cadherin和Vimentin的表達(dá)及其上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的相關(guān)性[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2011,24(9): 1068-1071.

[10] Lu KV, Chang JP, Parachoniak CA, et al. VEGF inhibits tumor cell invasion and mesenchymal transition through a MET/VEGFR2 complex[J]. Cancer Cell, 2012, 22(1): 21-35.

[11] Tanahashi T, Osada S, Yamada A, et al. Extracellular signal-regulated kinase and Akt activation play a critical role in the process of hepatocyte growth factor-induced epithelial-mesenchymal transition[J]. Int J Oncol, 2013, 42(2): 556-564.

[12] Voon DC, Wang H, Koo JK, et al. EMT-induced stemness and tumorigenicity are fueled by the EGFR/Ras pathway[J]. PLoS One, 2013, DOI: 10.1371/journal.pone.0070427.

[13]鄧沁芳,周彩存,蘇春霞,等.非小細(xì)胞肺癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化與EGFR突變以及臨床病理特征之間的關(guān)系[J].癌癥防治研究,2008, 35(4): 258-262.

（童穎丹編輯）

Relationship between EGFR and EMT in advanced non-small cell lung cancer

Chun-xiang Chai1, Xiao-min Wang2, Wen-jun Guo2, Yong-hong Sun2
(1. Medical Department, 2. Department of Pathology, the Affilited Hospital of
Weifang Medical University, Weifang, Shandong 261000, China)

Abstract:Objective To investigate the relationship of epithelial-mesenchymal transition (EMT) and epidermal growth factor receptor (EGFR) in non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods Immunohistochemistry (EnVision method) was used to detect the expressions of EGFR, E-cadherin and vimentin. Exons 18-21 of EGFR were detected by PCR and gene sequencing. Results The positive expression rate of EGFR, E-cadherin and vimentin was 61.5% (48/78), 43.6% (34/78), 56.4% (44/78) respectively in the 78 cases of NSCLC; while they were not expressed in the normal group. The mutation rate of EGFR gene was 24.4%(19/78) in the NSCLC group. The incidence of EMT was higher in the EGFR wild-type group than in the mutation group (67.8% vs 21.1%). There was a positive correlation between EGFR protein expression and EMT (r= 0.236, P= 0.037). Conclusions Lost E-cadherin and EGFR signaling pathways could promote the formation of EMT.

Keywords:non-small cell lung cancer; epithelial-mesenchymal transition; epidermal growth factor receptor

[通信作者]王曉敏，E-mail：wangxiaomin1986@sina.cn

收稿日期：2014-01-07

文章編號(hào)：1005-8982（2016）03-0034-05

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.03.007

中圖分類號(hào)：R734.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A