來曲唑配合高脂膳食誘導胰島素抵抗多囊卵巢綜合征大鼠代謝表型的實驗研究*

林鶯，張宏，黃鳴清，于志文，紀峰，黃黎珊，楊娟，許金榜（.廣州中醫(yī)藥大學，廣東廣州50006；.福建中醫(yī)藥大學，福建福州50；.福建省婦幼保健院，福建福州5000）

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來曲唑配合高脂膳食誘導胰島素抵抗多囊卵巢綜合征大鼠代謝表型的實驗研究*

林鶯1，張宏1，黃鳴清2，于志文2，紀峰2，黃黎珊2，楊娟3，許金榜3
（1.廣州中醫(yī)藥大學，廣東廣州510006；2.福建中醫(yī)藥大學，福建福州350122；3.福建省婦幼保健院，福建福州350001）

摘要：目的建立來曲唑及高脂飼料誘導的大鼠多囊卵巢綜合征（PCOS）胰島素抵抗（IR）動物模型，探討其生殖內(nèi)分泌異常及代謝表型特征。方法將24只3周齡雌性SD大鼠隨機分為PCOS-IR組、PCOS組、高脂組、對照組，每組6只。PCOS-IR組予高脂飼料喂養(yǎng)12周，第6周齡時開始每日灌胃來曲唑羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液，連續(xù)9周；PCOS組常規(guī)飼料喂養(yǎng)12周，第6周齡時開始每日灌胃來曲唑CMC-Na溶液，連續(xù)9周；高脂組予高脂飼料喂養(yǎng)12周，第6周齡時開始每日灌胃0.5%CMC-Na溶液，連續(xù)9周；對照組常規(guī)飼料喂養(yǎng)12周，第6周齡時開始每日灌胃0.5%CMC-Na溶液，連續(xù)9周。觀察體重和卵巢組織學變化，測定血脂水平、糖耐量、胰島素耐量、空腹血糖（FPG）和空腹胰島素（FINS）濃度，并計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）。結(jié)果PCOS-IR組和PCOS組卵巢呈多囊樣改變，卵巢閉鎖卵泡增多，閉鎖卵泡的直徑較大，顆粒細胞層數(shù)有所減少，未見黃體分布；高脂組及對照組卵巢分布有各級卵泡，可見較多黃體分布。與對照組比較，PCOS-IR組的體重增加（P=0.000），總膽固醇升高（P＜0.05），低密度脂蛋白升高（P＜0.01），糖耐量曲線下面積（AUC）增加（P＜0.05），胰島素耐量AUC增加（P＜0.01），F(xiàn)INS升高（P＜0.01），HOMA-IR升高（P＜0.05）。結(jié)論來曲唑合并高脂膳食可成功誘導胰島素抵抗PCOS大鼠典型的代謝表型。

關鍵詞：來曲唑；高脂飲食；糖脂代謝；胰島素抵抗；多囊卵巢綜合征

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS），育齡期婦女常見的婦科內(nèi)分泌疾病，以持續(xù)性無排卵、雄激素過多和胰島素抵抗為特征，患病率高達6%～8%，也是女性不孕癥的主要病因之一[1]。PCOS不僅影響女性的生殖功能，越來越多的循證醫(yī)學研究表明，PCOS患者2型糖尿病、代謝綜合征及心腦血管疾病等遠期并發(fā)癥的發(fā)病風險亦明顯高于一般人群并可持續(xù)到絕經(jīng)后，這些均與PCOS的胰島素抵抗（insulin resistance，IR）、肥胖和血脂異常等有關。諸多臨床研究也發(fā)現(xiàn)PCOS普遍存在胰島素抵抗[2]。胰島素抵抗是PCOS的核心病理機制，是導致PCOS患者超重和肥胖的主要原因，同時超重和肥胖也加重了PCOS的內(nèi)分泌和代謝紊亂[3-4]。PCOS胰島素抵抗已成為近年來的研究熱點，建立多囊卵巢綜合征胰島素抵抗動物模型對該病的深入研究具有深遠的意義。

多囊卵巢綜合征的造模方法有多種，但迄今為止，尚無一種公認的標準方法。目前，較常用的PCOS造模方法是皮下注射雄激素，如脫氫表雄酮或丙酸睪丸酮等。本課題組預實驗研究表明皮下注射給藥大鼠卵巢多囊樣表型不明顯，且卵巢條索化明顯，與臨床上PCOS患者卵巢增大的表型有著顯著區(qū)別。故在既往來曲唑造模的基礎上，結(jié)合高脂飼料喂養(yǎng)，成功誘導了大鼠胰島素抵抗及卵巢多囊樣表型。

1　材料與方法

1.1實驗動物

3周齡Sprague Dawley SPF級雌大鼠24只，由上海斯萊克實驗動物責任有限公司提供，合格證號：2007000571938，體重68～90 g不等，按體重由小到大編號，用隨機數(shù)字表隨機分為PCOS-IR組、PCOS組、高脂組、對照組，每組6只。

1.2實驗條件

實驗場所為福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF實驗室。實驗動物使用許可證號為：SYXK（閩）2014-0005，溫度22～23℃，濕度50%～60%，清潔飼養(yǎng)，給水充分，環(huán)境安靜，實驗室環(huán)境符合清潔級動物飼養(yǎng)要求。

1.3藥物和試劑

來曲唑（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，產(chǎn)品批號：15011956，國藥準字H19991001），羧甲基纖維素鈉（sodium carboxyl methyl cellulose，CMC-Na，美國Sigma-Aldrich公司，批號：1002004956），高脂飼料（D12492）[5.24 kal/g（1 kal=4.184 kJ），供能比：蛋白20%，碳水化合物20%，脂肪60%]，對照飼料（D12450-B）（3.85 kal/g，供能比：蛋白20%，碳水化合物70%，脂肪10%）由廣東省醫(yī)學實驗動物中心加工配送，胰島素放免試劑盒（天津市協(xié)和醫(yī)藥科技有限公司），拜耳1455型血糖儀（德國拜耳有限公司）。

1.4實驗方法

所有大鼠適應性喂養(yǎng)3 d，PCOS-IR組予高脂飼料喂養(yǎng)12周，第6周齡時開始每日灌胃來曲唑溶液[來曲唑1 mg/（kg·d）溶于0.5%CMC-Na中]，連續(xù)9周；PCOS組常規(guī)飼料喂養(yǎng)12周，第6周齡時開始每日灌胃來曲唑溶液，連續(xù)9周；高脂組高脂飼料喂養(yǎng)12周，第6周齡時開始每日灌胃0.5%CMC-Na溶液，連續(xù)9周；對照組常規(guī)飼料喂養(yǎng)12周，第6周齡時開始每日灌胃0.5% CMC-Na溶液，連續(xù)9周。

1.5檢測指標

1.5.1陰道涂片大鼠灌胃7周后每天早上陰道涂片，10%甲醛固定，HE染色，鏡檢。連續(xù)10 d。

1.5.2卵巢組織學檢查卵巢組織4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，以4μm厚度切片，常規(guī)脫蠟、水化后蘇木素染色5～10 min，1%鹽酸酒精分化，1%伊紅溶液染色，脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察各組大鼠卵巢組織學變化。

1.5.3糖耐量試驗灌胃9周后，20：00開始禁食，次日晨8：00鼠尾采血，利用拜耳1455型血糖儀測空腹血糖值，腹腔注射50%葡萄糖注射液（2 g/kg），鼠尾采血測量注射后15、30、45、60和120 min血糖值。Med Calc 11.4.2.0統(tǒng)計軟件分析對比曲線下面積（area under the curve，AUC）。

1.5.4胰島素耐量試驗灌胃9周后，晨8∶00開始禁食2 h，鼠尾采血，測血糖值，腹腔注射胰島素溶液（0.75 u/kg），鼠尾采血測量注射后15、30、45、60、90 和120 min血糖值。MedCalc 11.4.2.0統(tǒng)計軟件分析對比AUC。

1.5.5血脂及胰島素抵抗指數(shù)糖耐量檢測結(jié)束后第3天，20∶00開始禁食，次日晨8∶00鼠尾采血，測空腹血糖值（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG），以2%戊巴比妥鈉（0.2 ml/100 g）腹腔注射麻醉后，腹主動脈采血5～8 ml，離心后收集血清，BECMAN全自動生化分析儀檢測血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（Triglycerides，TG）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）；放射免疫法檢測胰島素（insulin released test，INS）。計算胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model of assessment for insulin resistence index，HOMA-IR），HOMA-IR=空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）×FPG/22.5。

1.6統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1陰道涂片

PCOS-IR組與PCOS組陰道涂片染色鏡檢結(jié)果顯示大鼠均處于動情間期時相，僅見大量白細胞，偶見少量角化細胞，提示無排卵。高脂組與對照組仍保持規(guī)律的動情周期。

2.2卵巢病理切片

對照組與高脂組卵巢可見多個黃體以及不同發(fā)育階段的卵泡，顆粒細胞多層，排列整齊。與對照組比較，PCOS-IR組與PCOS組卵巢的閉鎖卵泡增多，且閉鎖卵泡的直徑較大，卵巢呈多囊樣改變，顆粒細胞層數(shù)有所減少，白膜增厚。見圖1。

圖1　4組大鼠卵巢病理切片

2.3體重

4組大鼠實驗前體重無明顯差異，PCOS-IR組大鼠的體重在高脂喂養(yǎng)至8周開始明顯增加，喂養(yǎng)至15周時增加明顯，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）。見圖2和表1。

表1　4組大鼠體重比較（n=6，g±s）

表1　4組大鼠體重比較（n=6，g±s）

注：1）與對照組比較，P=0.000；2）與對照組比較，P＜0.05

組別　實驗前　實驗后　F值　t值　P值PCOS-IR組84.58±4.76　519.95±42.341）　1.523 7.424 0.000 PCOS組　79.58±6.11　406.05±22.612）　0.085 2.250 0.048高脂組　82.4±6.84　403.60±50.29　6.111 1.130 0.288對照組　80.6±4.27　378.58±19.56

圖2　4組大鼠體重增長趨勢圖

2.4糖耐量及胰島素耐量情況

PCOS-IR組大鼠的糖耐量曲線下面積與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），PCOS-IR組大鼠的胰島素耐量曲線下面積與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表2。

2.5胰島素抵抗指數(shù)

與對照組比較，PCOS-IR組大鼠的空腹血糖差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），空腹胰島素差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），胰島素抵抗指數(shù)與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

2.6血脂水平

PCOS-IR組大鼠的血清TC水平與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），血清LDL水平與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與對照組比較，PCOS-IR組大鼠的血清TG、HDL水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

表2　4組大鼠糖耐量及胰島素耐量AUC比較（n=6，±s）

表2　4組大鼠糖耐量及胰島素耐量AUC比較（n=6，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與對照組比較，P＜0.01

組別　糖耐量AUC　F值　t值　P值　胰島素耐量AUC　F值　t值　P值PCOS-IR組　1 518.75±212.201）　0.107　2.742　0.021　545.33±147.072）　2.176　3.331　0.008 PCOS組　1 238.00±234.53　0.001　0.554　0.592　407.92±65.05　0.003　2.186　0.054高脂組　1 418.55±186.91　0.184　1.955　0.082　382.15±126.24　1.450　0.895　0.394對照組　1 162.63±237.02　331.21±56.20

表3　4組大鼠胰島素抵抗指數(shù)比較（n=6，±s）

表3　4組大鼠胰島素抵抗指數(shù)比較（n=6，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.01；2）與對照組比較，P＜0.05

組別　FINS/（mIU/L）　FPG/（mmol/L）　HOMA-IR PCOS-IR組　35.19±9.191）　5.57±0.56　8.83±2.952）F值　0.008　2.224　0.597 t值　3.244　1.280　3.127 P值　0.009　0.229　0.011 PCOS組　27.31±10.69　4.95±0.46　5.93±2.15 F值　0.558　0.011　0.015 t值　1.551　1.100　1.354 P值　0.152　0.298　0.206高脂組　38.71±11.041）　5.40±0.84　9.34±3.182）F值　1.938　2.040　2.830 t值　3.420　0.486　3.232 P值　0.008　0.638　0.010對照組　18.69±8.41　5.22±0.37　4.33±1.93

表4　4組大鼠血脂水平比較（n=6，mmol/L±s）

表4　4組大鼠血脂水平比較（n=6，mmol/L±s）

組別　TG　TC　HDL　LDL PCOS-IR組　0.54±0.17　2.30±0.191）　1.40±0.10　0.46±0.062）F值　1.593　0.103　1.028　1.370 t值　1.098　2.904　1.286　5.754 P值PCOS組F值0.000 0.34±0.05 0.031 t值P值0.298 1.46±0.401）0.191 0.016 2.08±0.31 2.075 0.227 1.27±0.25 3.82 3.041 0.012 0.640 0.537 0.300 0.770 2.313 0.043

續(xù)表4

3　討論

PCOS是女性最常見的內(nèi)分泌代謝異常性疾病，約50%～70%的PCOS患者存在胰島素抵抗[5]，10%的PCOS患者伴有糖尿病[6]。近20年來，越來越多的研究表明，胰島素代謝異?；蛞葝u素信號傳導途徑異常是PCOS發(fā)病機制的核心。PCOS常表現(xiàn)為IR及代償性高胰島素血癥。

來曲唑是一種芳香化酶抑制劑，本研究采用來曲唑造模法建立PCOS動物模型。該造模的主要機制是通過抑制芳香化酶的生物學作用，減少雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化，降低雌激素水平，消除雌激素對下丘腦的負反饋抑制，從而導致垂體促性腺激素分泌增加，高水平、失去脈沖的黃體生成素作用于卵泡膜細胞，生成過多的雄激素，體內(nèi)雄激素堆積，特別是卵巢局部雄激素增加，導致排卵障礙和卵巢多囊樣改變。本研究PCOS-IR組與PCOS組卵巢的閉鎖卵泡增多，且閉鎖卵泡的直徑較大，卵巢呈多囊樣改變，顆粒細胞層數(shù)有所減少，白膜增厚，與國內(nèi)外研究相一致[7-9]。

高脂膳食是用于誘導肥胖癥和胰島素抵抗的常用方法，楊宇峰等[10]研究表明，高脂飲食能直接降低胰島素作用下骨骼肌和脂肪組織對葡萄糖的吸收作用，同時提高肝臟葡萄糖的生成，改變對胰島素敏感組織的葡萄糖的轉(zhuǎn)變規(guī)律，從而導致整個機體糖代謝紊亂和胰島素抵抗。

雖然來曲唑造模法建立起來的PCOS大鼠模型表現(xiàn)出和人類PCOS相類似的代謝特征，包括體重增加、脂肪增多、腸系膜脂肪細胞增寬及一定程度胰島素抵抗，但是仍不夠典型，如本研究PCOS組糖耐量與胰島素耐量曲線下面積、FINS以及HOMA-IR等指標較對照組高，但差異無統(tǒng)計學意義。故本研究在來曲唑造模的基礎上，配合高脂膳食誘導法，成功誘導出與臨床上PCOS胰島素抵抗相類似的代謝表型：肥胖；糖耐量與胰島素耐量曲線下面積增高，空腹胰島素與胰島素抵抗指數(shù)升高；脂質(zhì)代謝紊亂，膽固醇與低密度脂蛋白升高等，上述指標PCOS-IR組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義。

綜上所述，來曲唑配合高脂膳食誘導法模型大鼠同時具有排卵障礙和卵巢多囊樣改變、高雄激素血癥、肥胖及胰島素抵抗等PCOS的典型特征，較適合用于研究PCOS胰島素抵抗動物模型。

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（申海菊編輯）

Glucose and lipid metabolism in Letrozole and high-fat diet induced PCOS-IR rats*

Ying Lin1, Hong Zhang1, Ming-qing Huang2, Zhi-wen Yu2, Feng Ji2, Li-shan Huang2, Juan Yang3, Jin-bang Xu3
(1. Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou, Guangdong 510006, China; 2. Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou, Fujian 350122, China; 3. Fujian Maternity and Children Health Hospital, Fuzhou, Fujian 350001, China)

Abstract:Objective To investigate glucose and lipid metabolism in Letrozole and high-fat diet (HFD) induced polycystic ovary syndrome-insulin resistance (PCOS-IR) rats. Methods Twenty-four female SD rats of 3 weeks were randomly divided into 4 groups: control group, HFD group, PCOS group and PCOS-IR group. The rats in the HFD group and the PCOS-IR group were fed with high-fat diet for 12 weeks, while those of the control group and PCOS group were fed with normal diet. At the age of 6 weeks, the PCOS and PCOSIR groups received Letrozole intragastric administration for 9 weeks. The changes in weight and ovarian mor－book=10,ebook=16phology were observed; blood lipid, blood fasting plasma glucose (FPG), blood fasting insulin (FINS) and homeostasis model of assessment for insulin resistence index (HOMA-IR) were determined; and intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) and insulin tolerance test were conducted in all the groups. Results Compared with the control and HFD groups, the PCOS and PCOS-IR groups showed polycystic ovaries with high incidence of atretic follicle and ovarian cyst together with decreased layers of granulosa cells and no corpora lutea. Compared with the control group, the PCOS-IR group exhibited increased weight (P= 0.000) with higher total cholesterol concentration (P＜0.05) and low-density lipoprotein concentration (P＜0.01), and increased AUC of IPGTT (P＜0.05) and AUC of insulin tolerance (P＜0.01). The PCOS-IR group also showed higher FINS concentration (P＜0.01) and increased HOMA-IR(P＜0.05). Conclusions Letrozole and high-fat diet can successfully induce typical metabolic phenotypes of insulin resistance in PCOS-IR rats.

Keywords:Letrozole; high-fat diet; glucose and lipid metabolism; insulin resistance; polycystic ovary syndrome

[通信作者]許金榜，E-mail：jinbangxu@yahoo.com

*基金項目：國家自然科學基金（No：81302998）；福建省科技計劃項目（No：2015Y0002）；福建省中醫(yī)藥科研項目（No：wzfg201304）；福建省衛(wèi)生計生委青年科研課題（No：2014-1-20）

收稿日期：2015-07-08

文章編號：1005-8982（2016）03-0009-05

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.03.002

中圖分類號：R711.75

文獻標識碼：A