慢病毒介導磷酸二酯酶7A基因沉默細胞株的構建及三磷酸腺苷結合盒轉運體A1的表達變化*

向樂，唐菀澤，張志珍，馬衛(wèi)列（廣東醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，廣東東莞523808）

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慢病毒介導磷酸二酯酶7A基因沉默細胞株的構建及三磷酸腺苷結合盒轉運體A1的表達變化*

向樂，唐菀澤，張志珍，馬衛(wèi)列
（廣東醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，廣東東莞523808）

摘要：目的利用慢病毒介導構建磷酸二酯酶7A（PDE7A）基因沉默人單核巨噬細胞（THP-1）株，并分析沉默細胞株的三磷酸腺苷結合盒轉運體A1（ABCA1）的表達變化。方法以PDE7A基因為靶點，設計合成3 段shRNA片段，與慢病毒載體PmiRzip連接，構建重組質粒。測序鑒定后進行病毒包裝，感染THP-1細胞，實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）進行分析，確定最佳干擾片段。嘌呤霉素篩選得到PDE7A基因沉默穩(wěn)轉細胞株。qPCR和Western blot檢測鑒定所構建的細胞株，將其誘導成為泡沫細胞后鑒定ABCA1基因的表達。結果轉染shRNA1、shRNA2、shRNA3細胞的PDE7A相對表達量分別為（0.480±0.028）、（0.561±0.016）和（0.377±0.013），故選擇shRNA3作為干擾PDE7A基因的最佳片段。采用1.4 g/L嘌呤霉素成功篩選出PDE7A沉默細胞株，qPCR和Western blot檢測PDE7A基因的干擾效率，其抑制效率>70%。將其誘導成巨噬泡沫細胞后，Western blot檢測顯示，ABCA1的表達量增加40%。結論成功構建PDE7A shRNA慢病毒干擾載體，并篩選出PDE7A基因沉默的THP-1細胞株，且ABCA1的表達量增加。

關鍵詞：磷酸二酯酶7A；RNA干擾；慢病毒；三磷酸腺苷結合盒轉運體A1

膽固醇在巨噬細胞中積累是動脈粥樣硬化形成的關鍵因素，促進細胞中膽固醇的逆向轉運（reverse cholesterol transport，RCT）是防治動脈粥樣硬化的有效方法[1-2]。三磷酸腺苷結合盒轉運體A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）主要轉運細胞內(nèi)膽固醇至貧脂的載脂蛋白A-1（apolipoprotein A-1，apoA-1），通過增加高密度脂蛋白來啟動RCT，促進細胞中膽固醇外排。

磷酸二酯酶7A（phosphodiesterase 7A，PDE7A）作為環(huán)腺苷一磷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）特異性蛋白水解酶，可降低細胞中cAMP濃度[3-4]。cAMP作為第二信使，通過cAMP/PKA信號通路上調ABCA1表達，促進細胞內(nèi)膽固醇外流[5-6]。因此，干擾細胞PDE7A的表達，使細胞內(nèi)cAMP濃度增加而上調ABCA1表達，進而促進膽固醇外流。為研究PDE7A在促進細胞內(nèi)膽固醇外流中的作用，需要構建合適的細胞模型。本實驗以人單核巨噬細胞（human acute monocytic leukemia cell line，THP-1）為研究對象，通過慢病毒介導的shRNA干擾技術構建PDE7A基因沉默細胞株，為后續(xù)研究PDE7A基因功能及巨噬細胞內(nèi)膽固醇逆向轉運提供實驗基礎。

1　材料與方法

1.1細胞株與主要試劑

THP-1細胞購自湘雅醫(yī)學院細胞庫，HEK-293FT細胞、HEK-293T細胞及慢病毒包裝系統(tǒng)由中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所免疫生物學室惠贈，Lipofectine2000購自美國Life公司，改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基（dulbecco modified eagle medium，DMEM）、洛斯維-1640（roswell park memorial institute 1640，RPMI 1640）培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Gibco公司，嘌呤霉素購自美國Sigma公司，聚凝胺（Polybrene）購自上海翊圣生物科技有限公司，佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）購自美國Promega公司，ac-LDL購自上海經(jīng)科化學科技有限公司，apoA-1購自美國Sigma公司，無內(nèi)毒素質粒大提試劑盒購自北京天根生物公司，熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒購自大連寶生生物工程有限公司。兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗購自杭州至賢生物公司，兔抗PDE7A一抗購自英國Abcam公司，兔抗ABCA1一抗購自美國Sigma公司，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋公司。

1.2方法

1.2.1shRNA設計合成根據(jù)GenBank中PDE7A mRNA全序列（NM_002603）及短發(fā)夾RNA（shRNA）設計原則，分別設計合成3條靶序列和陰性對照序列的shRNA寡核苷酸單鏈：①5′-GGCCATGCACTG TTACTTAAA-3′；②5′-GAAATAGTCTAGTAAGCTTA A-3′；③5′-GATCGTCACACTGAATCTATT-3′；④NC：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′，由上海吉泰生物技術有限公司合成。

1.2.2慢病毒干擾載體構建及慢病毒包裝①慢病毒干擾載體構建：將設計合成的3條靶序列和陰性對照序列連接到慢病毒載體Pmi Rzip中，構建重組質粒PmiRzip-shRNA1、PmiRzip-shRNA2、Pmi RzipshRNA3、Pmi Rzip-shRNA-NC；將重組質粒轉化為大腸桿菌DH5α，篩選得到單菌落，挑取單菌落擴大培養(yǎng)，提取質粒用EcoⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，實驗重復＞3次。將酶切鑒定結果一致的質粒，送上海吉泰生物技術有限公司進行測序。②慢病毒包裝：HEK-293FT細胞鋪10 cm培養(yǎng)皿，37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)至細胞密度約為85%時，更換無抗生素、無血清的DMEM培養(yǎng)基。取10.0ml離心管，加入1.5 ml無血清、無雙抗DMEM，按pMD 2.0∶psPAX2∶Pmi Rzip-shRNA=1∶1∶2加入24μg質粒進行稀釋。取1.5 ml Ep管，各加1.5μl無血清、無雙抗DMEM，加入48μl Lipofectamine 2000，輕輕混勻，靜置5 min；將稀釋的Lipofectamine 2000與稀釋質粒混勻，靜置15 min后制備成轉染復合物。將質粒與Lipofectamine 2000的復合物加入培養(yǎng)皿中，輕輕震蕩，使復合物均勻地分散在細胞中；37℃、5% CO2培養(yǎng)6 h后更換新鮮無抗生素的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后在熒光顯微鏡下觀察轉染效率，收集病毒，用0.45μm濾器過濾，4℃、4 500裝，置入-80℃冰箱冷凍保存。病毒包裝實驗重復＞3次。③慢病毒滴度的測定：將HEK-293T細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，經(jīng)胰酶消化后，按8×103個細胞/孔，接種96孔板，待細胞長至30%～50%密度時，更換含病毒的完全培養(yǎng)基，病毒用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基進行梯度稀釋。48 h后去除含慢病毒的培養(yǎng)基，加入100μl完全培養(yǎng)基。96 h后在熒光顯微鏡下觀察各孔熒光細胞數(shù)，病毒滴度為表達熒光的細胞數(shù)乘以相應稀釋倍數(shù)。

1.2.3慢病毒shRNA干擾效果鑒定接種THP-1細胞于24孔板，每孔1×105個細胞，加入聚凝胺（Polybrene）至濃度8 g/L。12 h后用RPMI 1640完全培養(yǎng)基將病毒濃縮液稀釋5倍，加入Polybrene至濃度8 g/L，棄24孔板的培養(yǎng)基，加入含病毒的RPMI 1640完全培養(yǎng)基。24 h后更換新鮮RPMI 1640完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h后實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR）鑒定最佳干擾片段。

1.2.4沉默細胞株的構建①嘌呤霉素最佳濃度確定：將THP-1細胞接種至24孔板，1×105個細胞/孔，置37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別用0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 g/L嘌呤霉素對正常THP-1細胞進行篩選預實驗，14 d后觀察細胞全部死亡的最小濃度作為最佳篩選濃度。②建立PDE7A沉默細胞株：接種THP-1細胞至6孔板，2×106個細胞/孔，加入Polybrene至濃度8g/L。12h后用RPMI 1640完全培養(yǎng)基將最佳干擾片段shRNA3病毒上清液稀釋5倍，加入Polybrene至濃度8 g/L，棄6孔板的培養(yǎng)基，加入含病毒的RPMI 1640完全培養(yǎng)基。24 h后更換新鮮RPMI 1640完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后用0.4 g/L嘌呤霉素RPMI 1640完全培養(yǎng)基篩選細胞，正常THP-1細胞做對照組，逐漸增加嘌呤霉素的濃度至最佳篩選濃度1.4 g/L，直至無細胞死亡。連續(xù)培養(yǎng)50代后，采用qPCR和Western blot檢測鑒定PDE7A的表達。

1.2.5PDE7A沉默細胞株的鑒定①PDE7A基因沉默細胞株的qPCR鑒定：分別取THP-1細胞、PDE7A沉默的THP-1細胞和shRNA-NC-THP-1細胞，按RNA提取試劑盒說明書進行提取各細胞的總RNA，逆轉錄成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，使用Light Cycler@96實時熒光定量PCR儀檢測THP-1細胞和各組THP-1基因沉默細胞PDE7A基因的相對表達，實驗重復3次。②PDE7A蛋白表達分析，分別取THP-1細胞、PDE7A沉默的THP-1細胞和shRNA-NC-THP-1細胞，800 r/min離心5 min去培養(yǎng)基，加入細胞裂解液置冰上裂解40 min；12 000 r/min離心10 min；加入5×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）上樣緩沖液，沸水浴中變性5 min；進行10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白電轉至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，5%牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉2 h；分別用PDE7A和GAPDH抗體4℃孵育過夜；TBST緩沖液（tris buffered saline with tween-20，TBST）洗膜5次，每次5 min，加入二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜5次，每次5 min，加入增強化學發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）化學發(fā)光試劑后進行成像，并用蛋白灰度分析軟件分析結果，實驗重復3次。

1.2.6Western blot檢測PDE7A沉默的巨噬泡沫細胞中ABCA1的表達取6孔板，1.5×106個細胞/孔，實驗分4組。第1、2組接種THP-1細胞；第3組接種shRNA-NC-THP-1細胞，第4組接種PDE7A沉默的THP-1細胞。加入PMA至終濃度160 nmol/L，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h，使懸浮細胞分化為貼壁巨噬細胞。加入含0.2%BSA和37.5 g/LAc-LDL的1640完全培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h，使巨噬細胞變?yōu)榕菽毎＜尤牒?0 g/L apoA-1的1640完全培養(yǎng)基，12 h提取蛋白，Western blot檢測分析泡沫細胞中ABCA1的表達。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，用單因素方差（Oneway，ANOVA）分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1慢病毒干擾載體的構建

根據(jù)PDE7A的基因序列設計3段寡核苷酸片段，構建慢病毒重組質粒，用EcoⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定（見圖1）。將陽性重組質粒測序，證實插入的核酸序列與前期設計完全一致（見圖2），提示PDE7A基因shRNA慢病毒表達載體構建成功。

2.2慢病毒包裝

如圖3所示，按pMD2.0∶psPAX2∶Pmi RzipshRNA=1∶1∶2共轉染HEK-293FT細胞，37℃、5% CO2培養(yǎng)6 h，更換新鮮無抗生素的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后在熒光顯微鏡下觀察轉染有效率＞90%。

圖1　慢病毒重組質粒的雙酶切鑒定

2.3慢病毒滴度測定

圖2　慢病毒重組質粒測序圖譜

將HEK-293T細胞按8×103個細胞/孔，接種96孔板，待細胞長至30%～50%的密度時，更換含病毒的完全培養(yǎng)基，病毒用含有10% FBS的細胞培養(yǎng)液梯度稀釋至1×10-2～1×10-8。48 h后去除含慢病毒的培養(yǎng)基，加入100μl完全培養(yǎng)基。96 h后在熒光顯微鏡下觀察各孔熒光細胞數(shù)，病毒滴度為1×108TU/ml。見圖4。

圖3　共轉染48 h后HEK-293FT細胞熒光顯微鏡觀察結果（×100）

2.4shRNA片段的干擾效果分析

3個干擾片段和陰性對照組病毒稀釋液感染THP-1細胞，72 h后熒光顯微鏡下觀察，感染有效率達90%（見圖5）。通過qPCR分析，感染shRNA1、shRNA2和shRNA3片段慢病毒細胞的PDE7A相對表達量分別為（0.480±0.028）、（0.561±0.016）和（0.377±0.013），提示shRNA3片段對PDE7A干擾效果較好，故后續(xù)實驗選擇shRNA3片段作為干擾片段。

圖4　病毒稀釋液感染HEK-293T細胞的熒光圖（×100）

圖5　慢病毒感染THP-1細胞72h后熒光顯微鏡下觀察結果（×100）

2.5嘌呤霉素最佳濃度確定

本實驗分別用0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 g/L嘌呤霉素對正常THP-1細胞進行篩選，14 d 后0.4 g/L少部分細胞死亡，0.8 g/L大部分細胞死亡，1.4 g/L細胞幾乎全部死亡，故確定嘌呤霉素最佳濃度為1.4 g/L。

2.6PDE7A沉默細胞株的鑒定

連續(xù)培養(yǎng)50代后，qPCR結果表明，shRNA- NC-THP-1和shRNA3- THP-1細胞中PDE7A mRNA相對表達量分別為（0.859±0.016）和（0.293±0.032），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）（見圖6和表1）。Western blot檢測THP-1細胞、shRNA- NC-THP-1和shRNA3- THP-1細胞中PDE7A蛋白表達（見圖7和表2）。蛋白灰度分析軟件分析表明，shRNA3-THP-1細胞中PDE7A蛋白的相對表達量為（0.153±0.025），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）。

圖6　PDE7A mRNA相對表達水平

圖7　PDE7A蛋白相對表達水平

表2　PDE7A蛋白在THP-1、shRNA-NC-THP-1 和shRNA3-THP-1的相對表達水平方差分析

2.7PDE7A沉默的巨噬泡沫細胞中ABCA1蛋白相對表達水平

Western blot檢測巨噬泡沫細胞各組中ABCA1的相對表達量（見圖8和表3），與apoA-1處理組比較，shRNA3處理組ABCA1蛋白相對表達量為（1.400±0.023），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）。

表3　不同處理組的ABCA1蛋白相對表達水平的方差分析

圖8　不同處理組ABCA1蛋白的相對表達量

3　討論

cAMP作為第二信使在細胞內(nèi)有重要作用，當其含量變化時會使細胞內(nèi)信號通路、細胞的增殖及新陳代謝等生理活動受影響。細胞內(nèi)cAMP含量受腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cyclase，AC）和磷酸二酯酶（phosphodiesteras，PDEs）的動態(tài)調節(jié)，通過專一性抑制PDEs活性，可減少細胞內(nèi)cAMP降解，促進細胞內(nèi)過量膽固醇流出，PDEs抑制劑用于抗動脈粥樣硬化形成受到關注[7]。細胞內(nèi)cAMP特異性PDEs主要為PDE4和PDE7[8]。臨床上，現(xiàn)有的PDE4抑制劑有明顯的副作用，如嘔吐、痙攣[9]，所以需要尋找新的PDEs抑制劑。PDE7家族有兩種亞型即PDE7A和磷酸二酯酶7B（phosphodiestera 7B，PDE7B），主要分布在免疫和炎癥細胞中，已有多種合成抑制劑[10]。PDE7B廣泛分布于人體不同組織器官，而PDE7A則局限于心臟等器官，且PDE7A表達水平比PDE7B高出約10倍，通過cAMP/PKA通路調節(jié)ABCA1介導的膽固醇流出，可作為新的心血管疾病治療靶點。

本實驗選擇人單核THP-1細胞作為靶細胞，針對PDE7A基因設計干擾片段，與慢病毒載體連接構建重組質粒，經(jīng)轉化、質粒抽提后，電泳與基因測序鑒定慢病毒PDE7A干擾載體構建成功。PDE7A慢病毒干擾載體與病毒包裝質粒共轉染HEK-293FT，熒光顯微鏡下觀察到大量綠色熒光蛋白表達，顯示慢病毒成功包裝。慢病毒感染THP-1細胞后經(jīng)嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定的干擾細胞株，qPCR和Western blot檢測證實PDE7A的干擾效率可達70%。ABCA1作為主要體內(nèi)轉運體將細胞內(nèi)膽固醇排出至apoA-1，是高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）顆粒形成的關鍵過程。apoA-1與ABCA1結合后促進細胞膽固醇流出，促使貧脂的apoA-1形成富含膽固醇的HDL進入RCT循環(huán)[11-13]。實驗結果顯示，apoA-1處理組比Ac-LDL處理組的ABCA1表達量升高，提示apoA-1可通過提高ABCA1表達，增強泡沫細胞內(nèi)膽固醇的流出，shRNA3-apoA-1處理組的ABCA1表達量比apoA-1處理組增加40%，說明干擾后PDE7A基因的ABCA1表達量增加。本實驗為進一步研究PDE7A在膽固醇逆向轉運中的作用提供實驗基礎，同時也為發(fā)現(xiàn)新的治療心血管疾病藥物提供潛在靶點。

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（童穎丹編輯）

Construction of PDE7A gene silencing THP-1 cell lines by lentivirus-mediated RNA interference and expression of ABCA1*

Le Xiang, Wan-ze Tang, Zhi-zhen Zhang, Wei-lie Ma
(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Guangdong Medical College, Dongguan, Guangdong 523808, China)

Abstract:Objective To construct phosphodiesterase 7A (PDE7A) gene silence human acute monocytic leukemia (THP-1) cell lines by lentivirus-mediated RNA interference technique, and to analyze the expression of ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) in THP-1 cell lines. Methods Three human PDE7A gene targeted shRNA fragments (shRNA1, shRNA2 and shRNA3) and shRNA-NC fragment were designed and synthesized, then connected with lentiviral vector PmiRzip to construct recombinant plasmids. After DNA sequencing, the lentivirus was packaged, and infected the THP-1 cells. The inhibitory effect of PDE7A shRNAs was analyzed by qPCR. Subsequently, the THP-1 cells were screened with Puromycin to get stable PDE7A gene silencing cell lines which were then identified by qPCR and Western blot. The expression of ABCA1 was determined after THP-1 cells were induced to develop macrophage foam cells. Results The relative expression of PDE7A in the cells transfected with shRNA1, shRNA2 or shRNA3 was (0.480±0.028), (0.561±0.016) and (0.377±0.013) respectively; then shRNA3 was chosen as interferent PDE7A gene fragment. PDE7A silence cell lines were successfully screened with 1.4 g/L Puromycin. PDE7A gene interference efficiency was identified by qPCR and Western blot, and inhibition efficiency was more than 70%. The expression of ABCA1 wasbook=2,ebook=8increased by more than 40% after THP-1 cells were induced into macrophage foam cells. Conclusions PDE7A silencing lentivirus interference vector has been successfully constructed, and PDE7A gene silencing THP-1 cell lines have been screened out in which ABCA1 expression is increased.

Keywords:phosphodiesterase 7A; RNA interference; lentivirus; ATP-binding cassette transporter A1

通信作者]馬衛(wèi)列，E-mail：mazhangwu@163.com

*基金項目：國家自然科學基金（No：81170267）；廣東省高等學校人才引進專項[No：粵財教（2013）246號][

收稿日期：2015-10-14

文章編號：1005-8982（2016）03-0001-08

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.03.001

中圖分類號：R341

文獻標識碼：A