SD胚鼠心臟成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定

沈俊，袁平，唐俊明，楊建業(yè)，李興元，張蕾，趙繼先，張煥鑫，薛仕珍，馮怡，王家寧

· 論著 ·

SD胚鼠心臟成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定

沈俊1,2，袁平1，唐俊明2，楊建業(yè)2，李興元2，張蕾2，趙繼先1，張煥鑫1，薛仕珍1，馮怡1，王家寧1,2

目的建立適用于胚胎大鼠心臟成纖維細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)及鑒定的技術(shù)方法。方法從SD孕19 d大鼠子宮中分離出胚胎鼠，再?gòu)奶ナ笾蟹蛛x出心臟，將心臟剪成肉糜狀，用胰蛋白酶加上Ⅱ型、Ⅳ膠原酶聯(lián)合消化法分離心臟成纖維細(xì)胞，再通過(guò)差速貼壁分離法分別收集、 培養(yǎng)胚胎大鼠心臟成纖維細(xì)胞。在光學(xué)顯微鏡下觀察心臟成纖維細(xì)胞形態(tài)特征的變化，用第2代心臟成纖維細(xì)胞用波形蛋白（vimentin）、結(jié)蛋白（desmin）、血管性血友病因子（vWF）、平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）免疫熒光鑒定。結(jié)果差速貼壁法分離的心臟成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)120 min已經(jīng)完全貼壁，培養(yǎng)第3～5代細(xì)胞生長(zhǎng)良好，24 h心臟成纖維細(xì)胞波形蛋白免疫熒光鑒定純度高達(dá)97%，培養(yǎng)2～3 d時(shí)心臟成纖維細(xì)胞增殖活力最強(qiáng)。結(jié)論差速貼壁分離法結(jié)合免疫熒光鑒定可分離胚胎大鼠心臟成纖維細(xì)胞，此種方法可得到產(chǎn)量大，純度高，活力好的心臟成纖維細(xì)胞，適用于細(xì)胞水平上的心血管疾病發(fā)病機(jī)制的研究。

心臟成纖維細(xì)胞；原代培養(yǎng)；胚鼠；鑒定

體外培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞，作為一種體外實(shí)驗(yàn)研究模型，已用于多種心血管疾病的研究，如心肌梗死后心臟纖維化、缺血缺氧再灌注模型等，是心血管疾病基礎(chǔ)研究的基本方法之一，應(yīng)用前景廣闊[1-3]。但目前體外培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞，隨著傳代次數(shù)的增多存在增殖能力下降、表型轉(zhuǎn)換的現(xiàn)象[4-7]。目前關(guān)于心臟成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法較多，但大多數(shù)都是從成年鼠或乳鼠心臟中分離培養(yǎng)[8-14]，而從胚胎大鼠心臟中分離培養(yǎng)心臟成纖維細(xì)胞的方法未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)借鑒前人的經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用胎鼠心臟組織塊酶消化法結(jié)合差速貼壁能夠分離出純度較高、活力較強(qiáng)的心臟成纖維細(xì)胞，現(xiàn)將具體實(shí)驗(yàn)方法和經(jīng)驗(yàn)予以報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Sprague-Dawley（SD）孕19 d大鼠，SPF級(jí)，體重（380±3.2）g，湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要試劑DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青公司），0.1%胰蛋白酶（將胰蛋白酶溶于PBS緩沖液（pH 7.3）中配制），PBS液（pH 7.3），0.08%Ⅱ型膠原酶（Sigma公司），Ⅳ膠原酶（Sigma公司），細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒（CCK-8）（Dojindo公司），波形蛋白（Vimentin）抗體、結(jié)蛋白（Desmin）抗體、血管性血友病因子（vWF）抗體、平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體，熒光二抗（均為Abcom公司）。細(xì)胞培養(yǎng)板、 離心管、培養(yǎng)皿等、移液管耗材購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.1.3 主要儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（RORMA3111，美國(guó)Thermo公司），高性能超凈工作臺(tái)（上海瑞仰凈化裝備有限公司），倒置相差顯微鏡（1× 200），Eppendorf 5804R低溫離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 取材將SD孕鼠脫頸處死后頭部以下置于75%酒精缸中浸泡5 min，轉(zhuǎn)移到超凈臺(tái)中。75%酒精棉球擦洗泡沫板，用針頭將孕鼠仰面固定在泡沫板上。用外科剪自盆腔處沿腹中線向上剪開(kāi)皮膚至劍突下停止。用2把止血鉗夾取兩側(cè)皮膚，充分撕開(kāi)，暴露下腹部，用大頭針將腹腔兩側(cè)皮膚固定在泡沫板上。用鑷子夾起盆腔處肌肉，用無(wú)菌外科剪自盆腔處沿腹中線向上剪開(kāi)肌肉至劍突下停止。用止血鉗夾住腹腔兩側(cè)肌肉，充分撕開(kāi)，暴露子宮。用鑷子挑起呈串珠狀子宮，分離周?chē)M織后，將子宮置于裝有20 ml左右預(yù)冷PBS的培養(yǎng)皿中。分離胎盤(pán)，將剝離的胚胎大鼠置于新的預(yù)冷PBS培養(yǎng)皿中，依次逐一剝離子宮中的胚鼠置于培養(yǎng)皿中。將胚鼠于預(yù)冷PBS液中清洗3次。充分消毒雙手，左手將胚鼠仰面固定于指尖，眼科剪在劍突處正中線稍偏左向上開(kāi)胸后用，用食指和拇指輕輕擠壓使心臟自然跳出，用彎鑷子勾住心臟根部，取出心臟 , 置于盛預(yù)冷PBS液的培養(yǎng)皿中，依次逐一取出胚鼠的心臟置于培養(yǎng)皿中。將胚心于預(yù)冷PBS液中清洗3次。夾取心臟逐一轉(zhuǎn)移到無(wú)菌青霉素瓶中，充分剪碎心臟至肉糜狀。

1.2.2 酶消化分離培養(yǎng)吸取5 ml胰蛋白酶沖洗眼科剪，青霉素瓶靜止1～2 min后用彎頭吸管吸取上清液棄掉，在加入5 ml胰蛋白酶及100 μlⅡ型和100 μl Ⅳ膠原酶，轉(zhuǎn)移至15 ml無(wú)菌離心管中，封口后于37℃恒溫水浴鍋中充分震蕩搖晃6～8 min，離心管靜置1～2 min后用彎頭吸管吸取上清液轉(zhuǎn)移至裝有20 ml預(yù)冷培養(yǎng)基的50 ml離心管中止消化。在未消化的組織液中再加入5 ml胰蛋白酶及100 μl膠原酶Ⅱ型和100 μl膠原酶Ⅳ，同法消化3～5次。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)將分次收集的上清細(xì)胞懸液離心（1000 rpm，5 min）。棄掉上清液，加入10 ml 20%胎牛血清高糖DMEM重懸細(xì)胞，接種到培養(yǎng)皿中。裝移到置體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 h后棄掉細(xì)胞懸液，補(bǔ)充10 ml 20%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)基置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.15%胰蛋白酶消化傳代（1:3），第二代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 心臟成纖維細(xì)胞的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定在心臟成纖維細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，將細(xì)胞置于不同倍數(shù)倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.3.2 免疫熒光鑒定取第二代心臟成纖維細(xì)胞接種于12孔板中，均勻接種3個(gè)孔中，每孔1 ml細(xì)胞懸液，第2 d用PBS液輕輕洗3遍，用4%多聚甲醛固定15 min，再用PBS液洗3遍，5%羊血清+0.3%Tritorx-100封閉30 min，再用PBS液洗3遍，3個(gè)孔對(duì)應(yīng)加入波形蛋白、結(jié)蛋白、血管性血友病因子、平滑肌肌動(dòng)蛋白的一抗4℃孵育過(guò)夜，再用PBS液洗3遍，各孔加入對(duì)應(yīng)的熒光二抗室溫下孵育2 h，再用PBS液洗3遍，加入DAPI染核15 min，置于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3.3 增殖活力檢測(cè)待生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第二代細(xì)胞80～90%融合時(shí)，消化后，按照每孔約2×103個(gè)細(xì)胞等量接種于96孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔24 h向其中12孔加入CCK8溶液10 μl，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中1 h后，用酶標(biāo)儀在 450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光密度值（D450 nm），每日測(cè)12孔， 連續(xù)測(cè)4 d。同時(shí)測(cè)空白對(duì)照孔（只加培養(yǎng)液，不加細(xì)胞）光密度值（D450 nm）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用 SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，兩組間均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)資料的方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)利用酶消化法結(jié)合差速貼壁法，剛分離的心臟混合細(xì)胞呈圓球狀，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，心臟成纖維細(xì)胞最先貼壁，鏡下可見(jiàn)長(zhǎng)梭形，胞體較大，胞質(zhì)透明；細(xì)胞核清晰且較大，呈橢圓形，通常含1～3個(gè)核，無(wú)自發(fā)性搏動(dòng)。胚鼠心臟成纖維生長(zhǎng)迅速，24 h即可鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿（圖1）。細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%～90%進(jìn)行傳代培養(yǎng)，6代之后會(huì)出現(xiàn)明顯衰老。

2.2 細(xì)胞免疫熒光鑒定在倒置熒光顯微鏡下觀察，培養(yǎng)的胚鼠心臟成纖維細(xì)胞波形蛋白抗原表達(dá)呈陽(yáng)性反應(yīng)（圖2A）， 陽(yáng)性細(xì)胞率98%，說(shuō)明細(xì)胞來(lái)源于間充質(zhì)；結(jié)蛋白抗原表達(dá)呈陰性反應(yīng)（圖2B），基本可排除血管平滑肌細(xì)胞；血管性血友病因子抗原表達(dá)呈陰性反應(yīng)（圖2C），基本可排除內(nèi)皮細(xì)胞；α-SMA抗原表達(dá)呈陰性（圖2D），基本可排除心臟肌成纖維細(xì)胞。細(xì)胞免疫熒光鑒定的結(jié)果說(shuō)明利用該方法可得到理想的心臟成纖維細(xì)胞。

2.3 心臟成纖維細(xì)胞增殖活力測(cè)定原代培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞利用CCK-8試劑盒檢測(cè)其增殖活力，在用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光密度值（D450 nm），如表1。在培養(yǎng)第48 h及72 h可見(jiàn)細(xì)胞增殖活力最強(qiáng)，在第4 d增殖活力有所下降。

圖1 普通光學(xué)顯微鏡下心臟成纖維細(xì)胞形態(tài)（100×） [A：培養(yǎng)2 h后的心臟成纖維細(xì)；B：培養(yǎng)24 h后的心臟心臟成纖維細(xì)胞]

圖2 心臟成纖維細(xì)胞免疫熒光染色后熒光顯微鏡下結(jié)果（100×）[A：Vementin在胚鼠心臟成纖維細(xì)胞中表達(dá)陽(yáng)性；B：Dismin在胚鼠心臟成纖維細(xì)胞中表達(dá)陰性；C：vWF在胚鼠成纖維細(xì)胞中表達(dá)陰性；D：α-SMA在胚鼠心臟成纖維細(xì)胞中表達(dá)陰性]

3 討論

3.1 心臟成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)臨床上，心肌纖維化是心臟重塑的關(guān)鍵，心肌纖維化后正常的心肌組織中膠原纖維異常積聚、膠原濃度明顯升高或膠原成分發(fā)生改變[1-4,16]。其基礎(chǔ)源于心臟成纖維細(xì)胞的異常增殖，研究心臟成纖維細(xì)胞對(duì)于探討心臟重塑具有重要意義。因?yàn)樾呐K成纖維細(xì)胞有一定的增殖分化能力，反復(fù)多次傳代后易向心臟肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換[4-6]，關(guān)于純度較高的心臟成纖維細(xì)胞代數(shù)，國(guó)內(nèi)外報(bào)道不一[7-15]，在分離的胚鼠心臟成纖維細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn)在6代以后細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)梭型變寬變扁，在前6代細(xì)胞免疫熒光鑒定的結(jié)果和細(xì)胞形態(tài)學(xué)相吻合，因此，獲得純度高的心臟成纖維細(xì)胞培養(yǎng)模型對(duì)實(shí)驗(yàn)研究的科學(xué)性及結(jié)果的可靠性具有重要意義。

3.2 胚胎大鼠心臟酶消化及差速貼壁法本實(shí)驗(yàn)采用胰蛋白酶加上Ⅱ型、Ⅳ膠原酶聯(lián)合消化法分離心臟成纖維細(xì)胞，再通過(guò)差速貼壁分別收集、培養(yǎng)胚胎大鼠心臟成纖維細(xì)胞。為提高胚鼠心臟成纖維細(xì)胞的活力，胚鼠心臟組織塊要盡量剪碎，酶消化組織塊時(shí)要嚴(yán)格控制時(shí)間，過(guò)短，細(xì)胞消化不下來(lái)，過(guò)長(zhǎng)，會(huì)增加細(xì)胞死亡的概率。同時(shí)用短時(shí)間多次消化組織塊也可較好的保持心臟成纖維細(xì)胞的活力。另外，心臟成纖維細(xì)胞是貼壁型細(xì)胞，接皿培養(yǎng)2 h左右即完全貼壁，而未貼壁的多為心肌細(xì)胞。選用的胚鼠胎齡太小，不利于剝離心臟，一般選取胎齡19 d左右的胎鼠可以較好的剝離胎心，在剝離胎鼠、分離胎心、剪碎組織塊及酶消化時(shí)，盡量要快，避免污染。

表1 胚鼠心臟成纖維原代培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)增值情況（n=12，s）

表1 胚鼠心臟成纖維原代培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)增值情況（n=12，s）

注：與同時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組相比，aP＜0.05

培養(yǎng)時(shí)間（h）空白對(duì)照組密度值（D450 nm）24 0.492±0.012a0.122±0.102 48 0.792±0.003a0.121±0.103 72 0.852±0.002a0.120±0.101 96 0.792±0.001a0.121±0.103細(xì)胞組光密度值（D450 nm）

圖3 成纖維細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間注：與24 h比較，aP＜0.05

3.3 胚鼠心臟成纖維細(xì)胞的鑒定形態(tài)學(xué)上可見(jiàn)從胎鼠分離的心臟成纖維細(xì)胞，接皿2 h已經(jīng)生長(zhǎng)40%～60%左右，光鏡下可見(jiàn)典型的長(zhǎng)梭型；成纖維細(xì)胞中間絲的結(jié)構(gòu)蛋白是波形蛋白，不同于內(nèi)皮細(xì)胞的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，也不同于血管平滑肌細(xì)胞的結(jié)蛋白及肌成纖維細(xì)胞的平滑肌肌動(dòng)蛋白，可利用免疫熒光進(jìn)行鑒定。本研究免疫熒光結(jié)果提示波形蛋白染色陽(yáng)性表達(dá)，而結(jié)蛋白、平滑肌肌動(dòng)蛋白，血管性血友病因子染色陰性，從而表明分離培養(yǎng)的細(xì)胞為心臟成纖維細(xì)胞[17-20]。從成纖維細(xì)胞增殖活力測(cè)定可看出，從胚鼠分離培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞增殖活力旺盛。

總之，本研究通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，通過(guò)胰蛋白酶與膠原酶聯(lián)合應(yīng)用、多次消化胚鼠心臟組織，利用差速貼壁2 h、20%FCS的高糖DMEM培養(yǎng)基的使用，并通過(guò)特異性免疫熒光鑒定及CCK8進(jìn)行活力鑒定，所獲得的心臟成纖維細(xì)胞分裂增殖能力強(qiáng)，傳代周期短，易培養(yǎng)，純度高等特點(diǎn)，建立了一種比較理想的胚鼠心臟成纖維細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)模型，為心血管疾病的細(xì)胞水平研究提供了基礎(chǔ)。

[1] Baudino TA,Carver W,Giles W,et al. Cardiac fibroblasts:Friend or foe?[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2006,291(3):H1015-26.

[2] Itoh N,Ornitz DM. Fibroblast growth factors:from molecular evolution to roles in development,metabolism and disease[J]. J Biochem,2011, 149(2):121-30.

[3] Nguyen PD,Hsiao ST,Sivakumaran P,et al. Enrichment of neonatal rat cardiomyocytes in primary culture facilitates long-term maintenance of contractility in vitro[J]. Am J Physiol Cell Physiol,2012,303(12): C1220-8.

[4] Tolstonog GV,Belichenko-Weitzmann IV,Lu JP,et al. Spontaneously immortalized mouse embryo fibroblasts:growth behavior of wild-type and vimentin-deficient cells in relation to mitochondrial structure and activity[J]. DNA Cell Biol,2005,24(11):680-709.

[5] Miki A,Narushima M,Okitsu T,et al. Maintenance of mouse, rat,and pig pancreatic islet functions by coculture with human islet-derived fibroblasts[J].Cell Transplant,2006,15(4):325-34.

[6] Simpson P,Savion S. Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells. Cross-striations, ultrastructure, and chronotropic response to isoproterenol[J]. Cir Res,1982,50(1):101-16.

[7] Bannikova S,Zorov DB,Shoeman RL,et al. Stability and association with the cytomatrix of mitochondrial DNA in spontaneously immortalized mouse embryo fibroblasts containing or lacking the intermediate filament protein vimentin[J]. DNA Cell Biol,2005,24(11):710-35.

[8] 辛毅,許秀芳,黃益民,等. 乳小鼠心肌成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)及熒光鑒定[J]. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2011,28(05):541-7.

[9] 胡金蓮,鄭怡文,谷曉蕾,等. 新生小鼠心臟細(xì)胞體外共培養(yǎng)體系的建立及其在心肌細(xì)胞增殖研究中的應(yīng)用[J]. 北京醫(yī)學(xué),2015,37(05):476-9.

[10] 王寧,李應(yīng)東. 乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的改進(jìn)[J]. 中國(guó)心血管病研究雜志, 2007, 5(12):920-2.

[11] Weber KT. Cardiac interstitium in health and disease: the fibrillar collagen network[J]. Journal of the American College of Cardiology, 1989,13(7):1637-52.

[12] 張怡,趙連三,汪成孝,等. 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2003,34(02):344-6.

[13] 商愛(ài)民,吳靖芳,薛剛,等. 大鼠胚胎成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性[J]. 河北北方學(xué)院學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2010,27(3):17-20.

[14] 張乃菊,陳天平,祝曉光. 乳鼠心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)[J]. 蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,35(06):558-61.

[15] 薛慶善. 體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)[M].科學(xué)出版社,2001.

[16] Rudolph AM,Heyman MA. Fetal and neonatal circulation and respiration[J]. Annu Rev Physiol,1974,36(36):187-207.

[17] Giddings JC,Hogg S,Legg IR,et al. The relationship between von Willebrand factor antigen and fibronectin in human plasma,endothelial cells and fibroblasts in culture[J]. Thromb Res,1986,44(3):291-301.

[18] Evans MJ,Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos[J]. Nature,1981,292(5819):154-6.

[19] Genbacev O,Krtolica A,Zdravkovic TE,et al. Serum-free derivation of human embryonic stem cell lines on human placental fibroblast feeders[J]. Fertil Steril,2005,83(5):1517-29.

[20] Zhen YS,Hui RT. Recent progress in heart regeneration[J]. Hereditas, 2011,33(11):1159-63.

本文編輯：劉暢，田國(guó)祥

Primary culture and identification of embryonic rat cardiac fibroblasts

SHEN Jun*, YUAN Ping, TANG Jun-ming, YANG Jian-ye, LI Xing-yuan, ZHANG Lei, ZHAO Ji-xian, ZHANG Huan-xin, XUE Shi-zhen, FENG Yi, WANG Jia-ning.*Department of Cardiology and Institute of Clinical Medicine , Renmin Hospital, Hubei University of Medicine, Shiyan, Hubei 442000, China.

WANG Jia-ning, E-mail: rywjn@vip.163.com

ObjectiveTo establish a suitable method for the isolation, culture and identification of embryonic rat cardiac fibroblasts in vitro.MethodsEmbryos of pregnant SD rats (19 days) were taken to get its heart, then the heart were cut into meat paste and digested with trypsinase plus collagenase Ⅱ/Ⅳ to isolate cardiac fibroblasts. Cardiac fibroblasts from embryonic rat hearts were harvested by differential adherent separation. The morphological changes of cardiac fibroblasts were observed under light microscope. The second generation of cardiac fibroblasts was identified by immunofluorescence with vimentin, desmin, von Willebrand factor (vWF) and smooth muscle actin (α-SMA).ResultsThe primary culture of cardiac fibroblasts isolated by differential adherence method was completely adherent for 120 min, and the cells were cultured well in the third to fifth passage. The purity of cardiac fibroblast vimentin immunofluorescence was up to 97% after 24 hours. Cultured for 2 to 3 days, the proliferation of cardiac fibroblasts was the strongest.ConclusionDifferential adherence assay combined with immunofluorescence assay can be used to separate embryonic rat cardiac fibroblasts. A great quantity, purity and high survival rate of cardiac fibroblasts can be effectively cultured by this method. And it is useful to explore the pathologic mechanisms of cardiovascular disease in cellular level.

Cardiac fibroblasts; Primary culture; Embryonic rat; Identification

R322.1

A

1674-4055(2016)12-1441-04

國(guó)家自然科學(xué)基金(81270221)

1442000 十堰,湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院心內(nèi)科1病區(qū);2442000 十堰,湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所

王家寧,E-mail:rywjn@vip.163.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.12.08