響應(yīng)面法優(yōu)化十味盆安顆?；⒄却籽雍鞯奶崛」に囇芯浚?/h1>
2016-03-06 03:31:43劉長龍李云霄
關(guān)鍵詞：工藝
劉長龍，李云霄，錢 俊，吳 云，蕭 偉
（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室 連云港 222001）
響應(yīng)面法優(yōu)化十味盆安顆粒虎杖醋延胡索的提取工藝研究＊
劉長龍，李云霄，錢 俊，吳 云，蕭 偉＊＊
（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室 連云港 222001）
目的：優(yōu)選十味盆安顆?；⒄?、醋延胡索的最佳提取工藝。方法：在單因素考察的基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度、提取時間、提取次數(shù)三個主要因素，以提取液中虎杖苷、延胡索乙素提取率及干膏得率的綜合評分為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面試驗優(yōu)選虎杖、醋延胡索的提取工藝，并對最佳工藝進(jìn)行工藝驗證。結(jié)果：最佳提取工藝為10倍量59%乙醇加熱回流提取2次，每次95 min，經(jīng)三批工藝驗證，虎杖苷、延胡索乙素平均提取率分別為87.80%、94.11%，干膏的平均得膏率為15.00%，綜合評分為94.71，RSD=0.49%。結(jié)論：該工藝采用響應(yīng)面法優(yōu)化后，穩(wěn)定可行，有效成分轉(zhuǎn)移率高，適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
十味盆安顆粒 虎杖苷 延胡索乙素 提取工藝 響應(yīng)面法
十味盆安方為江蘇省中醫(yī)院談勇教授的臨床經(jīng)驗方，由赤芍、虎杖、醋延胡索等十味中藥組成[1]，具有清熱除濕、化瘀止痛之功效，主治濕熱瘀結(jié)所致的腹痛、腹墜脹，慢性盆腔炎見上述證候者[2]。該方在臨床應(yīng)用多年，且療效顯著，原方為湯劑，臨床應(yīng)用存在諸多限制。因此，本研究采用現(xiàn)代制劑技術(shù)，開發(fā)了治療慢性盆腔炎的中藥六類新藥——十味盆安顆粒。
虎杖、醋延胡索為方中君藥，虎杖苷、延胡索乙素是分別是虎杖、醋延胡索中主要有效成分[3-5]。相關(guān)研究表明，兩味藥均宜采用乙醇提取工藝[6，7]。響應(yīng)面法已被廣泛地用于多因素試驗優(yōu)化上，該法能得到明確的函數(shù)表達(dá)式，可在指定區(qū)域內(nèi)得到因素的最優(yōu)組合和響應(yīng)的最佳值[8]。為提高有效成分的提取率并保證質(zhì)量的穩(wěn)定均一，本研究在單因素考察的基礎(chǔ)上，以提取液中虎杖苷、延胡索乙素的提取率及干膏率的綜合評分為響應(yīng)值，應(yīng)用Design-Expert軟件的Box-Behnken[9，10]中心組合設(shè)計方法設(shè)計響應(yīng)面試驗進(jìn)行虎杖、醋延胡索提取工藝的優(yōu)化研究。
1 儀器與耗材
Aglient 1260型高效液相色譜儀（美國Aglient公司），BP211D 型電子分析天平（德國Sartorius公司）；虎杖苷對照品、延胡索乙素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為：111575-200502、110726-201213）；虎杖飲片、醋延胡索飲片（亳州市中藥飲片廠，批號分別為：140401、140301）；乙腈為色譜純，水為超純水；其他試劑均為分析純。
2 方法與結(jié)果
2.1 含量測定
2.1.1 色譜條件
虎杖苷色譜條件Phenomenex luna C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-水（20：80）為流動相，檢測波長為306 nm，流速1 mL·min-1，進(jìn)樣10 μL，柱溫30 ℃。
延胡索乙素色譜條件Phenomenex Gemini C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-磷酸鈉緩沖鹽（精密稱取無水磷酸二氫鈉6 g、十二水合磷酸氫二鈉約2 g，加水1 000 mL使溶解）（42：58）為流動相，檢測波長為280 nm，流速1 mL·min-1，進(jìn)樣10 μL，柱溫30℃。
2.1.2 溶液的制備
2.1.2.1 對照品溶液的制備
分別精密稱取虎杖苷、延胡索乙素對照品適量，分別加甲醇制成濃度分別為71.9 μg.mL-1、102.7 μg·mL-1的溶液，即得。
2.1.2.1 虎杖苷供試品溶液的制備
精密移取各試驗項下的提取液5 mL，置50 mL量瓶中，加稀乙醇至刻度，搖勻即得。
2.1.2.1 延胡索乙素供試品溶液的制備
取各試驗項下的提取液適量，以0.45 μm有機濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。
2.1.2.2 陰性樣品溶液的制備
取虎杖飲片50 g，加20倍量60%乙醇回流提取2次，每次90 min，濾過，按照延胡索乙素供試品溶液制備方法制備缺醋延胡索陰性樣品溶液；取醋延胡索飲片50 g，加20倍量60%乙醇回流提取2次，每次90 min，濾過，按照虎杖苷供試品溶液制備方法制備缺虎杖陰性樣品溶液。
2.1.3 系統(tǒng)適應(yīng)性與專屬性試驗
在上述色譜條件下，理論塔板數(shù)按虎杖苷色譜峰計算應(yīng)不得低于3 000，按延胡索乙素色譜峰計算應(yīng)不得低于6 000，分離度均＞1.5，且均已達(dá)到基線分離，拖尾因子在0.95-1.05之間。
分別精密吸取虎杖苷對照品溶液、虎杖苷供試品溶液、缺虎杖陰性樣品溶液各10 μL，注入高效液相色譜，結(jié)果見圖1，表明缺虎杖陰性樣品溶液無干擾；分別精密吸取延胡索乙素對照品溶液、延胡索乙素供試品溶液、缺醋延胡索陰性樣品溶液各10 μL，注入高效液相色譜，結(jié)果見圖2，表明缺醋延胡索陰性樣品溶液無干擾，說明本含量測定方法專屬性較強。
2.1.4 線性關(guān)系考察
取虎杖苷對照品溶液、延胡索乙素對照品溶液，按“2.1.1”項下的色譜條件分別進(jìn)樣1、2、5、10、20 μL和1、2、5、10、20 μL，測定色譜峰峰面積，以對照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），以色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得虎杖苷、延胡索乙素的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為Y=36780X+18.39（r=0.999 9）、Y=6516X+1.967（r=0.999 6），線性范圍分別為0.007 19～0.143 8 μg、0.010 27～0.205 4 μg，線性關(guān)系良好。
圖1 虎杖苷含量測定HPLC圖
圖2 延胡索乙素含量測定HPLC圖
2.1.5 精密度試驗
取虎杖苷對照品溶液、延胡索乙素對照品溶液按“2.1.1”項下的色譜條件測定，分別連續(xù)進(jìn)樣5次，測得虎杖苷、延胡索乙素色譜峰峰面積RSD分別為0.94%、1.31%，表明儀器精密度良好。
2.1.6 穩(wěn)定性試驗
取“2.3.1”乙醇濃度考察項下60%乙醇組提取液適量，按照2.1.2項下方法制備虎杖苷、延胡索乙素供試品溶液，分別放置 0、2、4、8、12、24 h ，按“2.1.1”項下色譜條件測定，測得虎杖苷和延胡索乙素的色譜峰峰面積RSD分別為1.68%、0.74%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。
2.1.7 重復(fù)性試驗
取“2.3.1”乙醇濃度考察項下60%乙醇組提取液適量，按照“2.1.2”項下方法制備6份虎杖苷、延胡索乙素供試品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件測定色譜峰面積，計算RSD分別為1.07%、0.92%，表明試驗重復(fù)性良好。
2.1.8 加樣回收率試驗
精密稱取6份已測定含量的提取液適量，分別加入與樣品等量的虎杖苷、延胡索乙素對照品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，進(jìn)行含量測定，計算加樣回收率，結(jié)果虎杖苷平均回收率為98.94%，RSD為1.58%，延胡索乙素平均回收率為101.67%， RSD為1.02%。
2.2 提取率及干膏率的測定
2.2.1 提取率測定
按照“2.1.1”項下含量測定方法，采用外標(biāo)一點法分別計算提取液中虎杖苷、延胡索乙素的含量，虎杖中虎杖苷含量、醋延胡索中延胡索乙素含量均按照2010年版《中國藥典》 一部相應(yīng)藥材項下含量測定方法進(jìn)行測定。
2.2.2 干膏率的測定
精密量取試驗項下的提取液適量，置干燥至已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃干燥至恒重，稱定重量，計算干膏率。
2.3 單因素試驗考察
考慮到延胡索乙素為生物堿類成分，而虎杖中大黃素等蒽醌類為偏酸性，兩者配伍合提可能會影響有效成分的煎出率[11-14]。本研究曾對虎杖、延胡索的分提與合提工藝進(jìn)行考察，結(jié)果顯示虎杖與延胡索合提時提取液延胡索乙素、虎杖苷提取率及干膏率與分提時無明顯差異。考慮到生產(chǎn)可行性，確定采用合提工藝。
影響中藥乙醇提取有效成分提取率、干膏率的因素一般有：乙醇濃度、加醇倍量、提取時間和提取次數(shù)。根據(jù)前期單因素考察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，溶劑倍量對兩個成分的提取率影響不顯著，在以10、12倍量60%乙醇提取時提取液中虎杖苷、延胡索乙素提取率、干膏率相差不大，為節(jié)省成本、提高效率，將溶劑倍量固定在10倍量，不再進(jìn)行考察。
2.3.1 乙醇濃度考察
取4份虎杖、醋延胡索飲片，每份虎杖、醋延胡索飲片均為50 g，每份分別加10倍量40、60、80、95%乙醇回流提取2次，每次90 min，測定各組提取液中虎杖苷、延胡索乙素提取率和干膏率。結(jié)果，隨乙醇濃度的升高提取液中兩個成分的提取率、干膏率均呈先增加后降低的規(guī)律，以60%乙醇提取時虎杖苷、延胡索乙素提取率最高，因此最優(yōu)條件為60%乙醇提取。
2.3.2 提取次數(shù)考察
取3份虎杖、醋延胡索飲片，每份虎杖、醋延胡索飲片均為50 g，每份分別加10倍量60%乙醇回流提取1、2、3次，每次90 min，測定各組提取液中虎杖苷、延胡索乙素提取率和干膏率，結(jié)果提取1、2、3次時虎杖苷提取率分別為62.58%、87.01%、87.56%，延胡索乙素提取率分別為56.21%、93.43%、95.07%，干膏率分別為8.52%、14.08%、16.27%。結(jié)果說明，兩味藥在以10倍量60%乙醇回流提取2次和提取3次時提取率差異不大，考慮到生產(chǎn)成本及效率，以提取2次為最優(yōu)條件。
2.3.3 提取時間考察
取5份虎杖、醋延胡索飲片，每份虎杖、醋延胡索飲片均為50 g，每份均加10倍量60%乙醇回流提取2次，提取時間分別為每次30、60、90、120、150 min，測定各組提取液中虎杖苷、延胡索乙素提取率和干膏率。結(jié)果，隨著提取時間的延長，虎杖苷、延胡索乙素提取率以及干膏率不斷增加，當(dāng)提取時間為90 min時最高，到120 min時提取率有所下降，所以選擇最佳提取時間為90 min 。
2.4 響應(yīng)面法試驗研究
2.4.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計
取15份虎杖、醋延胡索飲片，每份虎杖、醋延胡索飲片均為50 g，在單因素考察的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理，選取乙醇濃度、提取時間、提取次數(shù)對提取率、干膏率影響顯著的3個因素為自變量，采用三因素三水平響應(yīng)面分析法，以提取液中虎杖苷、延胡索乙素提取率及干膏率的綜合加權(quán)評分為響應(yīng)值，綜合加權(quán)評分=（虎杖苷提取率/虎杖苷最高提取率×0.4+延胡索乙素/延胡索乙素最高提取率×0.4+干膏率/最高干膏率×0.2）×100[15]。按表1中因素水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗，其中試驗1-12為析因?qū)嶒灒囼?3-15為中心實驗，用來估計實驗誤差。
2.4.2 回歸模型建立及分析
Box-Behnken 試驗設(shè)計及結(jié)果見表 2。
表1 虎杖醋延胡索提取工藝響應(yīng)面因素水平編碼
表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果
由表可知A、C、A2、C2的P值均＜0.01，表明其對提取工藝的影響極顯著，B對提取工藝的影響顯著，因素對指標(biāo)的影響為：提取次數(shù)C＞乙醇濃度A＞提取時間B；AB、AC、BC的交互項并不顯著，交互項可以省略，方差分析結(jié)果表明，各因素與指標(biāo)之間的關(guān)系不是簡單的線性關(guān)系。模型P＜0.000 1，說明模型具有高度顯著性；模型相關(guān)系數(shù)R2=0.996 4，說明模型擬合度很好，失擬誤差P值為0.062 3＞0.05，說明實驗誤差不顯著，響應(yīng)面模型對實驗擬合的情況較好。綜上所述，該模型的建立是合理的，可用回歸方程代替試驗真實點對實驗結(jié)果進(jìn)行分析。利用 Design-Expert 8.0.6軟件對表2實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，擬合出的綜合評分（Y）對自變量A、B、C的二次多項回歸方程為：
Y=93.93-3.18A+2.02B+16.49C+1.74AB+1.59AC-2.24BC-11.93A2-2.25B2-16.61C2。
2.4.3 相應(yīng)曲面分析及優(yōu)化
因素A和因素C交互響應(yīng)曲線面見圖5，根據(jù)擬合的響應(yīng)曲面形狀，通過Design-Expert 8.0.6軟件計算并分析得到各因素的最優(yōu)條件為：提取時間95.26 min，乙醇濃度59.12%，提取次數(shù)2.48次，最優(yōu)的綜合評分98.21，考慮到生產(chǎn)可行性，將提取時間修正為95 min，乙醇濃度修正為59%，此條件下提取次數(shù)為2次、3次時預(yù)測綜合評分分別為93.57、92.92，兩者差異不大，與單因素考察提取次數(shù)時結(jié)果一致。因此，將提取次數(shù)定為2次。
2.4.4 工藝驗證
響應(yīng)面分析得到的優(yōu)化結(jié)果是一個預(yù)測結(jié)果，需要進(jìn)行工藝驗證。按照優(yōu)選出的最佳工藝平行進(jìn)行三次驗證試驗，取3份虎杖、醋延胡索飲片，每份虎杖、醋延胡索飲片均為50 g，每份各加10倍量59%乙醇回流提取2次，每次95 min，測定各提取液中虎杖苷、延胡索乙素提取率及干膏率，結(jié)果見表4。采用優(yōu)選工藝所得結(jié)果綜合評分為94.71，RSD=0.49%，與預(yù)測綜合評分93.57相差不大，表明本響應(yīng)面實驗是成功的且該工藝穩(wěn)定可行。
圖3 提取次數(shù)、乙醇濃度對綜合評分影響的響應(yīng)面圖
表3 回歸系數(shù)顯著性及方差分析結(jié)果
表4 工藝驗證結(jié)果
3 討論
試驗中發(fā)現(xiàn)，60%乙醇提取時延胡索乙素、虎杖苷提取率較高，95%乙醇提取時延胡索乙素提取率急劇下降，說明在考察醋延胡索提取工藝時若以延胡索乙素為指標(biāo)不適宜用高濃度乙醇提取，延胡索乙素為叔胺堿，并且在延胡索醋制過程中延胡索乙素與醋酸結(jié)合成生物堿鹽，高濃度乙醇具有鹽析作用抑制了延胡索乙素的溶出；另外高濃度乙醇的沸點較低使得提取時溫度偏低[16]，對延胡索乙素的溶出也有一定影響。
響應(yīng)面法能在指定區(qū)域內(nèi)得到因素的最優(yōu)組合，在采用此法進(jìn)行工藝優(yōu)化時一般只確定一個最優(yōu)參數(shù)，導(dǎo)致實際生產(chǎn)中操作空間較小。本響應(yīng)面試驗考察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙醇濃度、提取時間均對醋延胡索、虎杖提取結(jié)果有較顯著性影響，經(jīng)優(yōu)化的乙醇濃度為59%，提取時間為95 min，而在生產(chǎn)中一般用酒精計來測定所配制乙醇濃度，用肉眼觀察溶劑的沸騰與否，較容易受到溫度、觀測誤差等影響，試驗參數(shù)精確度較低。因此，可設(shè)定提取結(jié)果在一個允許波動的范圍，對乙醇濃度、提取時間的選擇范圍進(jìn)行考察，以設(shè)定一個便于產(chǎn)業(yè)化的工藝參數(shù)區(qū)間。
中藥復(fù)方大多存在主要藥效物質(zhì)不明確的情況，在考察中藥復(fù)方提取工藝時，應(yīng)盡量采用多指標(biāo)成分和出膏量綜合加權(quán)評分的方法來全面評價提取工藝，并且應(yīng)充分考慮復(fù)方化學(xué)成分之間的相互影響以及炮制對中藥化學(xué)成分形態(tài)的轉(zhuǎn)化，這樣才能優(yōu)選出療效顯著、適宜產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的工藝。
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Optimum Extraction Process of Polygoni Cuspidati Rhizoma Et Radix and Corydalis Rhizoma from Shiwei Pen’an Granule Using Response Surface Method
Liu Changlong, Li Yunxiao, Qian Jun, Wu Yun, Xiao Wei
(Jiangsu Kanion Parmaceutical Co.,Ltd., State Key Laboratory of New-Tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China)
This study aimed to optimize extraction process of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix and Corydalis Rhizoma from Shiwei Pen'an granule (SWPAG). In the study， ethanol concentration， extraction duration，extraction frequency were set up for main indexes according to the results of single factor experiments; the overall weighted scores of dry cream rate， polydatin and tetrahydropalmatine extraction rates for the response values，while response surface method (RSM) for optimum extraction process. It was found that optimal parameters included hotreflux for twice with ten folds of 59.00% ethanol solution， lasting 95 min for each time. Under the optimum conditions， the average dry extract rate was 15.00%， average extraction rates of polydatin and tetrahydropalmatine were 87.80% and 94.11%， respectively; the average dry cream rate was 15.00%， while the weighted composite score was 94.71 with the RSD value of 0.49%. As a conclusion， it was beneficial to industrial production for increasing effective components through the stable and optimum process of RSM.
Shiwei Pen'an granule， polydatin， tetrahydropalmatine， response surface method， extraction process
10.11842/wst.2016.09.027
R283
A
（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）
2014-12-26
修回日期：2014-12-29
＊ 科學(xué)技術(shù)部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2013ZX09402203）：現(xiàn)代中藥創(chuàng)新集群與數(shù)字制藥技術(shù)平臺，負(fù)責(zé)人：王振中。
＊＊ 通訊作者：蕭偉，本刊編委，博士，研究員級高級工程師，主要研究方向：中藥新藥的研究與開發(fā)。
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劉長龍，李云霄，錢 俊，吳 云，蕭 偉
（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室 連云港 222001）
響應(yīng)面法優(yōu)化十味盆安顆粒虎杖醋延胡索的提取工藝研究＊
劉長龍，李云霄，錢 俊，吳 云，蕭 偉＊＊
（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室 連云港 222001）
目的：優(yōu)選十味盆安顆?；⒄?、醋延胡索的最佳提取工藝。方法：在單因素考察的基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度、提取時間、提取次數(shù)三個主要因素，以提取液中虎杖苷、延胡索乙素提取率及干膏得率的綜合評分為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面試驗優(yōu)選虎杖、醋延胡索的提取工藝，并對最佳工藝進(jìn)行工藝驗證。結(jié)果：最佳提取工藝為10倍量59%乙醇加熱回流提取2次，每次95 min，經(jīng)三批工藝驗證，虎杖苷、延胡索乙素平均提取率分別為87.80%、94.11%，干膏的平均得膏率為15.00%，綜合評分為94.71，RSD=0.49%。結(jié)論：該工藝采用響應(yīng)面法優(yōu)化后，穩(wěn)定可行，有效成分轉(zhuǎn)移率高，適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
十味盆安顆粒 虎杖苷 延胡索乙素 提取工藝 響應(yīng)面法
十味盆安方為江蘇省中醫(yī)院談勇教授的臨床經(jīng)驗方，由赤芍、虎杖、醋延胡索等十味中藥組成[1]，具有清熱除濕、化瘀止痛之功效，主治濕熱瘀結(jié)所致的腹痛、腹墜脹，慢性盆腔炎見上述證候者[2]。該方在臨床應(yīng)用多年，且療效顯著，原方為湯劑，臨床應(yīng)用存在諸多限制。因此，本研究采用現(xiàn)代制劑技術(shù)，開發(fā)了治療慢性盆腔炎的中藥六類新藥——十味盆安顆粒。
虎杖、醋延胡索為方中君藥，虎杖苷、延胡索乙素是分別是虎杖、醋延胡索中主要有效成分[3-5]。相關(guān)研究表明，兩味藥均宜采用乙醇提取工藝[6，7]。響應(yīng)面法已被廣泛地用于多因素試驗優(yōu)化上，該法能得到明確的函數(shù)表達(dá)式，可在指定區(qū)域內(nèi)得到因素的最優(yōu)組合和響應(yīng)的最佳值[8]。為提高有效成分的提取率并保證質(zhì)量的穩(wěn)定均一，本研究在單因素考察的基礎(chǔ)上，以提取液中虎杖苷、延胡索乙素的提取率及干膏率的綜合評分為響應(yīng)值，應(yīng)用Design-Expert軟件的Box-Behnken[9，10]中心組合設(shè)計方法設(shè)計響應(yīng)面試驗進(jìn)行虎杖、醋延胡索提取工藝的優(yōu)化研究。
1 儀器與耗材
Aglient 1260型高效液相色譜儀（美國Aglient公司），BP211D 型電子分析天平（德國Sartorius公司）；虎杖苷對照品、延胡索乙素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為：111575-200502、110726-201213）；虎杖飲片、醋延胡索飲片（亳州市中藥飲片廠，批號分別為：140401、140301）；乙腈為色譜純，水為超純水；其他試劑均為分析純。
2 方法與結(jié)果
2.1 含量測定
2.1.1 色譜條件
虎杖苷色譜條件Phenomenex luna C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-水（20：80）為流動相，檢測波長為306 nm，流速1 mL·min-1，進(jìn)樣10 μL，柱溫30 ℃。
延胡索乙素色譜條件Phenomenex Gemini C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-磷酸鈉緩沖鹽（精密稱取無水磷酸二氫鈉6 g、十二水合磷酸氫二鈉約2 g，加水1 000 mL使溶解）（42：58）為流動相，檢測波長為280 nm，流速1 mL·min-1，進(jìn)樣10 μL，柱溫30℃。
2.1.2 溶液的制備
2.1.2.1 對照品溶液的制備
分別精密稱取虎杖苷、延胡索乙素對照品適量，分別加甲醇制成濃度分別為71.9 μg.mL-1、102.7 μg·mL-1的溶液，即得。
2.1.2.1 虎杖苷供試品溶液的制備
精密移取各試驗項下的提取液5 mL，置50 mL量瓶中，加稀乙醇至刻度，搖勻即得。
2.1.2.1 延胡索乙素供試品溶液的制備
取各試驗項下的提取液適量，以0.45 μm有機濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。
2.1.2.2 陰性樣品溶液的制備
取虎杖飲片50 g，加20倍量60%乙醇回流提取2次，每次90 min，濾過，按照延胡索乙素供試品溶液制備方法制備缺醋延胡索陰性樣品溶液；取醋延胡索飲片50 g，加20倍量60%乙醇回流提取2次，每次90 min，濾過，按照虎杖苷供試品溶液制備方法制備缺虎杖陰性樣品溶液。
2.1.3 系統(tǒng)適應(yīng)性與專屬性試驗
在上述色譜條件下，理論塔板數(shù)按虎杖苷色譜峰計算應(yīng)不得低于3 000，按延胡索乙素色譜峰計算應(yīng)不得低于6 000，分離度均＞1.5，且均已達(dá)到基線分離，拖尾因子在0.95-1.05之間。
分別精密吸取虎杖苷對照品溶液、虎杖苷供試品溶液、缺虎杖陰性樣品溶液各10 μL，注入高效液相色譜，結(jié)果見圖1，表明缺虎杖陰性樣品溶液無干擾；分別精密吸取延胡索乙素對照品溶液、延胡索乙素供試品溶液、缺醋延胡索陰性樣品溶液各10 μL，注入高效液相色譜，結(jié)果見圖2，表明缺醋延胡索陰性樣品溶液無干擾，說明本含量測定方法專屬性較強。
2.1.4 線性關(guān)系考察
取虎杖苷對照品溶液、延胡索乙素對照品溶液，按“2.1.1”項下的色譜條件分別進(jìn)樣1、2、5、10、20 μL和1、2、5、10、20 μL，測定色譜峰峰面積，以對照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），以色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得虎杖苷、延胡索乙素的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為Y=36780X+18.39（r=0.999 9）、Y=6516X+1.967（r=0.999 6），線性范圍分別為0.007 19～0.143 8 μg、0.010 27～0.205 4 μg，線性關(guān)系良好。
圖1 虎杖苷含量測定HPLC圖
圖2 延胡索乙素含量測定HPLC圖
2.1.5 精密度試驗
取虎杖苷對照品溶液、延胡索乙素對照品溶液按“2.1.1”項下的色譜條件測定，分別連續(xù)進(jìn)樣5次，測得虎杖苷、延胡索乙素色譜峰峰面積RSD分別為0.94%、1.31%，表明儀器精密度良好。
2.1.6 穩(wěn)定性試驗
取“2.3.1”乙醇濃度考察項下60%乙醇組提取液適量，按照2.1.2項下方法制備虎杖苷、延胡索乙素供試品溶液，分別放置 0、2、4、8、12、24 h ，按“2.1.1”項下色譜條件測定，測得虎杖苷和延胡索乙素的色譜峰峰面積RSD分別為1.68%、0.74%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。
2.1.7 重復(fù)性試驗
取“2.3.1”乙醇濃度考察項下60%乙醇組提取液適量，按照“2.1.2”項下方法制備6份虎杖苷、延胡索乙素供試品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件測定色譜峰面積，計算RSD分別為1.07%、0.92%，表明試驗重復(fù)性良好。
2.1.8 加樣回收率試驗
精密稱取6份已測定含量的提取液適量，分別加入與樣品等量的虎杖苷、延胡索乙素對照品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，進(jìn)行含量測定，計算加樣回收率，結(jié)果虎杖苷平均回收率為98.94%，RSD為1.58%，延胡索乙素平均回收率為101.67%， RSD為1.02%。
2.2 提取率及干膏率的測定
2.2.1 提取率測定
按照“2.1.1”項下含量測定方法，采用外標(biāo)一點法分別計算提取液中虎杖苷、延胡索乙素的含量，虎杖中虎杖苷含量、醋延胡索中延胡索乙素含量均按照2010年版《中國藥典》 一部相應(yīng)藥材項下含量測定方法進(jìn)行測定。
2.2.2 干膏率的測定
精密量取試驗項下的提取液適量，置干燥至已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃干燥至恒重，稱定重量，計算干膏率。
2.3 單因素試驗考察
考慮到延胡索乙素為生物堿類成分，而虎杖中大黃素等蒽醌類為偏酸性，兩者配伍合提可能會影響有效成分的煎出率[11-14]。本研究曾對虎杖、延胡索的分提與合提工藝進(jìn)行考察，結(jié)果顯示虎杖與延胡索合提時提取液延胡索乙素、虎杖苷提取率及干膏率與分提時無明顯差異。考慮到生產(chǎn)可行性，確定采用合提工藝。
影響中藥乙醇提取有效成分提取率、干膏率的因素一般有：乙醇濃度、加醇倍量、提取時間和提取次數(shù)。根據(jù)前期單因素考察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，溶劑倍量對兩個成分的提取率影響不顯著，在以10、12倍量60%乙醇提取時提取液中虎杖苷、延胡索乙素提取率、干膏率相差不大，為節(jié)省成本、提高效率，將溶劑倍量固定在10倍量，不再進(jìn)行考察。
2.3.1 乙醇濃度考察
取4份虎杖、醋延胡索飲片，每份虎杖、醋延胡索飲片均為50 g，每份分別加10倍量40、60、80、95%乙醇回流提取2次，每次90 min，測定各組提取液中虎杖苷、延胡索乙素提取率和干膏率。結(jié)果，隨乙醇濃度的升高提取液中兩個成分的提取率、干膏率均呈先增加后降低的規(guī)律，以60%乙醇提取時虎杖苷、延胡索乙素提取率最高，因此最優(yōu)條件為60%乙醇提取。
2.3.2 提取次數(shù)考察
取3份虎杖、醋延胡索飲片，每份虎杖、醋延胡索飲片均為50 g，每份分別加10倍量60%乙醇回流提取1、2、3次，每次90 min，測定各組提取液中虎杖苷、延胡索乙素提取率和干膏率，結(jié)果提取1、2、3次時虎杖苷提取率分別為62.58%、87.01%、87.56%，延胡索乙素提取率分別為56.21%、93.43%、95.07%，干膏率分別為8.52%、14.08%、16.27%。結(jié)果說明，兩味藥在以10倍量60%乙醇回流提取2次和提取3次時提取率差異不大，考慮到生產(chǎn)成本及效率，以提取2次為最優(yōu)條件。
2.3.3 提取時間考察
取5份虎杖、醋延胡索飲片，每份虎杖、醋延胡索飲片均為50 g，每份均加10倍量60%乙醇回流提取2次，提取時間分別為每次30、60、90、120、150 min，測定各組提取液中虎杖苷、延胡索乙素提取率和干膏率。結(jié)果，隨著提取時間的延長，虎杖苷、延胡索乙素提取率以及干膏率不斷增加，當(dāng)提取時間為90 min時最高，到120 min時提取率有所下降，所以選擇最佳提取時間為90 min 。
2.4 響應(yīng)面法試驗研究
2.4.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計
取15份虎杖、醋延胡索飲片，每份虎杖、醋延胡索飲片均為50 g，在單因素考察的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理，選取乙醇濃度、提取時間、提取次數(shù)對提取率、干膏率影響顯著的3個因素為自變量，采用三因素三水平響應(yīng)面分析法，以提取液中虎杖苷、延胡索乙素提取率及干膏率的綜合加權(quán)評分為響應(yīng)值，綜合加權(quán)評分=（虎杖苷提取率/虎杖苷最高提取率×0.4+延胡索乙素/延胡索乙素最高提取率×0.4+干膏率/最高干膏率×0.2）×100[15]。按表1中因素水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗，其中試驗1-12為析因?qū)嶒灒囼?3-15為中心實驗，用來估計實驗誤差。
2.4.2 回歸模型建立及分析
Box-Behnken 試驗設(shè)計及結(jié)果見表 2。
表1 虎杖醋延胡索提取工藝響應(yīng)面因素水平編碼
表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果
由表可知A、C、A2、C2的P值均＜0.01，表明其對提取工藝的影響極顯著，B對提取工藝的影響顯著，因素對指標(biāo)的影響為：提取次數(shù)C＞乙醇濃度A＞提取時間B；AB、AC、BC的交互項并不顯著，交互項可以省略，方差分析結(jié)果表明，各因素與指標(biāo)之間的關(guān)系不是簡單的線性關(guān)系。模型P＜0.000 1，說明模型具有高度顯著性；模型相關(guān)系數(shù)R2=0.996 4，說明模型擬合度很好，失擬誤差P值為0.062 3＞0.05，說明實驗誤差不顯著，響應(yīng)面模型對實驗擬合的情況較好。綜上所述，該模型的建立是合理的，可用回歸方程代替試驗真實點對實驗結(jié)果進(jìn)行分析。利用 Design-Expert 8.0.6軟件對表2實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，擬合出的綜合評分（Y）對自變量A、B、C的二次多項回歸方程為：
Y=93.93-3.18A+2.02B+16.49C+1.74AB+1.59AC-2.24BC-11.93A2-2.25B2-16.61C2。
2.4.3 相應(yīng)曲面分析及優(yōu)化
因素A和因素C交互響應(yīng)曲線面見圖5，根據(jù)擬合的響應(yīng)曲面形狀，通過Design-Expert 8.0.6軟件計算并分析得到各因素的最優(yōu)條件為：提取時間95.26 min，乙醇濃度59.12%，提取次數(shù)2.48次，最優(yōu)的綜合評分98.21，考慮到生產(chǎn)可行性，將提取時間修正為95 min，乙醇濃度修正為59%，此條件下提取次數(shù)為2次、3次時預(yù)測綜合評分分別為93.57、92.92，兩者差異不大，與單因素考察提取次數(shù)時結(jié)果一致。因此，將提取次數(shù)定為2次。
2.4.4 工藝驗證
響應(yīng)面分析得到的優(yōu)化結(jié)果是一個預(yù)測結(jié)果，需要進(jìn)行工藝驗證。按照優(yōu)選出的最佳工藝平行進(jìn)行三次驗證試驗，取3份虎杖、醋延胡索飲片，每份虎杖、醋延胡索飲片均為50 g，每份各加10倍量59%乙醇回流提取2次，每次95 min，測定各提取液中虎杖苷、延胡索乙素提取率及干膏率，結(jié)果見表4。采用優(yōu)選工藝所得結(jié)果綜合評分為94.71，RSD=0.49%，與預(yù)測綜合評分93.57相差不大，表明本響應(yīng)面實驗是成功的且該工藝穩(wěn)定可行。
圖3 提取次數(shù)、乙醇濃度對綜合評分影響的響應(yīng)面圖
表3 回歸系數(shù)顯著性及方差分析結(jié)果
表4 工藝驗證結(jié)果
3 討論
試驗中發(fā)現(xiàn)，60%乙醇提取時延胡索乙素、虎杖苷提取率較高，95%乙醇提取時延胡索乙素提取率急劇下降，說明在考察醋延胡索提取工藝時若以延胡索乙素為指標(biāo)不適宜用高濃度乙醇提取，延胡索乙素為叔胺堿，并且在延胡索醋制過程中延胡索乙素與醋酸結(jié)合成生物堿鹽，高濃度乙醇具有鹽析作用抑制了延胡索乙素的溶出；另外高濃度乙醇的沸點較低使得提取時溫度偏低[16]，對延胡索乙素的溶出也有一定影響。
響應(yīng)面法能在指定區(qū)域內(nèi)得到因素的最優(yōu)組合，在采用此法進(jìn)行工藝優(yōu)化時一般只確定一個最優(yōu)參數(shù)，導(dǎo)致實際生產(chǎn)中操作空間較小。本響應(yīng)面試驗考察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙醇濃度、提取時間均對醋延胡索、虎杖提取結(jié)果有較顯著性影響，經(jīng)優(yōu)化的乙醇濃度為59%，提取時間為95 min，而在生產(chǎn)中一般用酒精計來測定所配制乙醇濃度，用肉眼觀察溶劑的沸騰與否，較容易受到溫度、觀測誤差等影響，試驗參數(shù)精確度較低。因此，可設(shè)定提取結(jié)果在一個允許波動的范圍，對乙醇濃度、提取時間的選擇范圍進(jìn)行考察，以設(shè)定一個便于產(chǎn)業(yè)化的工藝參數(shù)區(qū)間。
中藥復(fù)方大多存在主要藥效物質(zhì)不明確的情況，在考察中藥復(fù)方提取工藝時，應(yīng)盡量采用多指標(biāo)成分和出膏量綜合加權(quán)評分的方法來全面評價提取工藝，并且應(yīng)充分考慮復(fù)方化學(xué)成分之間的相互影響以及炮制對中藥化學(xué)成分形態(tài)的轉(zhuǎn)化，這樣才能優(yōu)選出療效顯著、適宜產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的工藝。
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Optimum Extraction Process of Polygoni Cuspidati Rhizoma Et Radix and Corydalis Rhizoma from Shiwei Pen’an Granule Using Response Surface Method
Liu Changlong, Li Yunxiao, Qian Jun, Wu Yun, Xiao Wei
(Jiangsu Kanion Parmaceutical Co.,Ltd., State Key Laboratory of New-Tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China)
This study aimed to optimize extraction process of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix and Corydalis Rhizoma from Shiwei Pen'an granule (SWPAG). In the study， ethanol concentration， extraction duration，extraction frequency were set up for main indexes according to the results of single factor experiments; the overall weighted scores of dry cream rate， polydatin and tetrahydropalmatine extraction rates for the response values，while response surface method (RSM) for optimum extraction process. It was found that optimal parameters included hotreflux for twice with ten folds of 59.00% ethanol solution， lasting 95 min for each time. Under the optimum conditions， the average dry extract rate was 15.00%， average extraction rates of polydatin and tetrahydropalmatine were 87.80% and 94.11%， respectively; the average dry cream rate was 15.00%， while the weighted composite score was 94.71 with the RSD value of 0.49%. As a conclusion， it was beneficial to industrial production for increasing effective components through the stable and optimum process of RSM.
Shiwei Pen'an granule， polydatin， tetrahydropalmatine， response surface method， extraction process
10.11842/wst.2016.09.027
R283
A
（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）
2014-12-26
修回日期：2014-12-29
＊ 科學(xué)技術(shù)部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2013ZX09402203）：現(xiàn)代中藥創(chuàng)新集群與數(shù)字制藥技術(shù)平臺，負(fù)責(zé)人：王振中。
＊＊ 通訊作者：蕭偉，本刊編委，博士，研究員級高級工程師，主要研究方向：中藥新藥的研究與開發(fā)。
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