成分敲除技術(shù)在中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用＊

邵 曉，朱珂璇，張 薔，趙玉男

（南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)研究中心 南京 210046）

成分敲除技術(shù)在中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用＊

邵 曉，朱珂璇，張 薔，趙玉男＊＊

（南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)研究中心 南京 210046）

中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究是實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵問題之一。近年來，中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究逐漸引入成分敲除技術(shù)，主要包括色譜敲除法和抗體敲除法。該類方法可以探討同一成分在不同中藥中的作用貢獻(xiàn)，以及不同成分在同一中藥中針對(duì)不同活性的作用貢獻(xiàn)，并對(duì)此進(jìn)行主次區(qū)分與排序，從而獲得新的研究結(jié)果。成分敲除技術(shù)的運(yùn)用，不僅有助于從全新的角度理解中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和制定科學(xué)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，而且有助于理解中藥單味藥內(nèi)部不同成分之間“配伍”的現(xiàn)代科學(xué)意義。

中藥 藥效物質(zhì)基礎(chǔ) 成分敲除 色譜敲除法 抗體敲除法

隨著現(xiàn)代醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究已成為當(dāng)下的研究熱點(diǎn)[1]。中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究不僅闡明了中藥作用的原理，而且為控制中藥的質(zhì)量打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。中藥從古至今一直被廣泛運(yùn)用并且有著確切的療效，其中所含的復(fù)雜物質(zhì)基礎(chǔ)便是發(fā)揮作用的關(guān)鍵[2]。眾所周知，中藥是一個(gè)復(fù)雜體系，即使是單味中藥，其本身也由多樣性成分構(gòu)成， 影響其質(zhì)量的因素更為復(fù)雜多樣。研究表明：中藥多種成分之間存在著協(xié)同拮抗等相互作用，即中藥中某個(gè)單體成分在干預(yù)動(dòng)物或人體時(shí)必然受到其它成分藥理和藥效作用的影響[3]。中藥特定藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)是其所含的化學(xué)成分，因而全面評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的關(guān)鍵是對(duì)產(chǎn)生藥效的特定化學(xué)成分的檢驗(yàn)。目前，開展中藥化學(xué)成分與其功效間關(guān)聯(lián)度的研究思路主要是通過對(duì)不同途徑獲得的化學(xué)成分進(jìn)行藥理活性或藥效評(píng)價(jià)，以該評(píng)價(jià)結(jié)果作為判斷其是否與中藥整體功效主治相關(guān)。但該研究思路僅用于推測(cè)某一單體成分與中藥功效間是否存在相關(guān)性，并不能為其在整體藥效作用中的貢獻(xiàn)度提供直接的證據(jù)。最近，在基因敲除研究模式的影響下，成分敲除技術(shù)（Ingredient Knock-Out Technology）被逐漸引入到中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究中。成分敲除技術(shù)，包括色譜敲除法和抗體敲除法，指的是在研究某一特定成分的功能時(shí)，將目標(biāo)成分從復(fù)合物中敲除，并通過對(duì)比分析成分敲除前后復(fù)合物藥效的變化來揭示該成分的作用，可以探討同一成分在不同中藥中的作用貢獻(xiàn)，以及不同成分在同一中藥中針對(duì)不同活性的作用貢獻(xiàn)，并對(duì)此進(jìn)行主次區(qū)分與排序，從而獲得新的研究結(jié)果。成分敲除技術(shù)的運(yùn)用，不僅有助于從全新的角度理解中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和制定科學(xué)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，而且有助于理解中藥單味藥內(nèi)部不同成分之間“配伍”的現(xiàn)代科學(xué)意義。

1 色譜敲除法

1.1 研究思路

制備液相色譜系統(tǒng)可應(yīng)用于中藥研究中化學(xué)成分的分離和純化，其原理是通過混合物中各成分物理化學(xué)性質(zhì)的差異，使其不同程度地分布于兩個(gè)不相溶的相中，并在兩相的相對(duì)運(yùn)動(dòng)過程中發(fā)生多次分布以達(dá)到分離的目的[4]。研究顯示，現(xiàn)代制備液相色譜系統(tǒng)的收集及分離技術(shù)成熟且具有較高的效率，可用于剔除中藥中某個(gè)單一成分或化學(xué)特征部位。

1.2 應(yīng)用實(shí)例

紅花是活血化瘀的傳統(tǒng)中藥，其現(xiàn)代藥理研究表明：紅花可以降低細(xì)胞氧化損傷，具有較好的抗氧化活性，治療腦缺血、心肌缺血等心腦血管疾病與紅花的抗氧化活性密不可分[5-7]。王林艷等[8]把抗氧化效應(yīng)評(píng)價(jià)與制備液相剔除技術(shù)相結(jié)合，并在該基礎(chǔ)上，尋找到一種新穎有效的中藥效應(yīng)物質(zhì)研究方法。該方法在一定程度上顯示了中藥的不同成分在發(fā)揮作用的過程中所體現(xiàn)出來的成效以及成效的多少。研究表明，紅花中分離出的有效成分6-羥基山柰酚-3，6-二氧葡萄糖-7-氧葡萄醛酸苷，羥基紅花黃色素A和脫水紅花黃色素B等是對(duì)紅花抗氧化活性有重要貢獻(xiàn)，可直接發(fā)揮紅花的抗氧化活性，還可通過結(jié)合其他成分間接地發(fā)揮紅花的抗氧化活性。

Gong A G等[9]通過液相色譜分離出當(dāng)歸補(bǔ)血湯中的黃芪關(guān)鍵成分毛蕊異黃酮，化學(xué)結(jié)構(gòu)類似β-雌二醇。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯具有促進(jìn)雌激素、血紅素及骨細(xì)胞生成的作用，日常服用可以用來治療婦女更年期綜合征。比較原方和剔除毛蕊異黃酮后的功效，發(fā)現(xiàn)后者在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中促進(jìn)雌激素、血紅素及骨細(xì)胞生成的作用顯著降低。不過，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中單獨(dú)使用毛蕊異黃酮也未取得明顯上述作用。由此推測(cè)，毛蕊異黃酮在當(dāng)歸補(bǔ)血湯中的作用主要是協(xié)調(diào)湯劑中多種藥理成分以達(dá)到最大的生物化學(xué)效應(yīng)。

2 抗體敲除法

2.1 基本原理

中藥化學(xué)成分復(fù)雜，用抗體敲除法研究藥物成分與功效間關(guān)聯(lián)度的原理類似于“基因敲除”。“基因敲除”是指在研究某一特定基因的功能時(shí)，將目標(biāo)基因從全基因中敲除，并通過對(duì)比分析基因敲除前后生理效應(yīng)的變化來揭示該基因的功能。研究證明，基因敲除技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于研究特定基因功能的有效途徑。同樣研究中藥中某一特定成分在整體藥味中的作用可以通過比較分析將其敲除前后中藥功效的變化，以揭示該中藥成分與整體藥物功效之間的相關(guān)性。

2.2 技術(shù)策略

采用生物技術(shù)手段制備中藥小分子單克隆抗體，結(jié)合免疫親和色譜特異性敲除/剔除提取物中某個(gè)有效成分進(jìn)行中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究技術(shù)。研究表明，該技術(shù)策略不僅將中藥復(fù)方中關(guān)鍵的有效成分及具有協(xié)同作用的天然成分的作用理清，并且在中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究中發(fā)揮不可或缺的作用[10]。

2.3 小分子單克隆抗體技術(shù)

2.3.1 小分子半抗原

小分子物質(zhì)（即半抗原）指的是相對(duì)分子質(zhì)量小于5 000的分子。由于小分子物質(zhì)沒有免疫原性，不具有獨(dú)立激發(fā)人或動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗體的作用，需與大分子物質(zhì)偶聯(lián)生成人工抗原免疫人或動(dòng)物，才能使人或動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答產(chǎn)生相應(yīng)抗體[11]。目前國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者較為全面的研究了基于單克隆抗體的小分子免疫分析方法，建立了多種小分子半抗原的合成方法，并初步應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品農(nóng)藥殘留及毒品快速測(cè)定中[12-14]。

2.3.2 免疫親和色譜

免疫親和色譜柱技術(shù)通過將抗體連接臂結(jié)合在固相介質(zhì)上，使抗體與其有生物特異親和性的抗原分子相結(jié)合，從而達(dá)到分離純化的目的。研究表明，免疫親和色譜柱技術(shù)已在抗體純化等方面廣泛應(yīng)用[15]。因此，小分子單克隆抗體技術(shù)即通過具有中藥活性成分的單克隆抗體制備相應(yīng)的免疫親和色譜柱，從而特異性地敲除藥材或復(fù)方中該化合物的某一成分以達(dá)到純化的目的。

2.4 應(yīng)用實(shí)例

陳亮等[16]利用抗體敲除技術(shù)將柚皮苷從經(jīng)典方劑四逆散中剔除。主要過程如下：①合成柚皮苷的完全抗原：柚皮苷與牛血清白蛋白的結(jié)合物；②獲得抗血清即通過合成的完全抗原對(duì)新西蘭兔進(jìn)行免疫；③制成免疫親和色譜柱：將獲得的抗血清純化后與經(jīng) CNBr 活化的Sepharose 4B 凝膠共價(jià)偶聯(lián)；④上樣：上樣于親和色譜柱，上樣液為四逆散樣品提取物；⑤洗脫：獲得特異性剔除柚皮苷的四逆散樣品。

人參的主要活性成分是人參皂苷，單克隆抗體技術(shù)可以用于制備其敲除提取物并研究其生物活性[17]。研究表明：人參皂苷Re及西洋參漿果提取物均可將小鼠禁食血糖的水平大幅度降低；而西洋參漿果提取物在剔除掉人參皂苷Re之后其降血糖效應(yīng)大大減少，從而提示西洋參漿果提取物中擁有顯著降血糖效應(yīng)的成分是人參皂苷Re[18]。除此之外，人參皂苷Re的提取物制備為檢驗(yàn)人參皂苷Re在治療糖尿病和肥胖中的重要性亦提供了一種理想的方式[19]。

屈會(huì)化等[19]采用免疫親和色譜柱技術(shù)特異性敲除了葛根藥材提取物中的葛根素，并研究了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC）分泌內(nèi)皮素-1（Endothelin 1，ET-1）水平在葛根素敲除前后的影響，其研究結(jié)果表明：葛根總提取液與特異性敲除葛根素后的葛根提取液之間，葛根素純品與特異性敲除葛根素后的葛根提取液之間均存在顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01），而葛根總提取液與葛根素純品無(wú)明顯差異（P＞0.05），提示HUVEC分泌ET-1的水平與葛根素的生物效應(yīng)密切相關(guān)，證明了葛根素與葛根功效之間具有明確的相關(guān)性。

Uto T等通過抗體敲除法研究了甘草在特異性敲除甘草皂苷前后對(duì)一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase，NOS）蛋白水平的影響。研究結(jié)果顯示：甘草提取物可以抑制內(nèi)毒素刺激巨噬細(xì)胞釋放NO和誘導(dǎo)型NO合酶的表達(dá)；剔除甘草皂苷后的抑制作用較甘草提取物有了顯著的減少；而單獨(dú)給予甘草皂苷卻無(wú)抑制作用。以上研究結(jié)果表明，甘草皂苷對(duì)甘草提取物中的其他成分發(fā)揮抑制巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)型NO合酶的表達(dá)有一定的協(xié)同作用[20，21]。

表1 色譜敲除法和抗體敲除法的比較

3 小結(jié)

中藥廣泛應(yīng)用于疾病的預(yù)防和治療，快速分離純化技術(shù)對(duì)于理解中藥復(fù)雜的物質(zhì)基礎(chǔ)、控制中藥質(zhì)量和發(fā)現(xiàn)潛在活性物質(zhì)具有重要意義，也是目前中藥研究的熱點(diǎn)問題之一[22]。成分敲除技術(shù)具有明顯的中醫(yī)藥特色且高效精準(zhǔn)，具體表現(xiàn)為該技術(shù)可將中醫(yī)藥理論的整體觀、系統(tǒng)觀運(yùn)用于實(shí)際，并突顯中醫(yī)藥多成分協(xié)同拮抗的豐富內(nèi)涵。中醫(yī)藥特色指該模式始終把中醫(yī)方藥作為一個(gè)整體或系統(tǒng)思考，且該模式可又好又快地辨別中藥譜效關(guān)系和量效關(guān)系的真實(shí)性，并在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)中藥（化學(xué)）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究。因此，中藥成分在治療及應(yīng)用過程中的具體效應(yīng)可通過敲除技術(shù)的廣泛運(yùn)用進(jìn)一步探查。中藥一般多以同母核結(jié)構(gòu)形式存在（類似物），各成分之間的活性差異有時(shí)未必很大，即多表現(xiàn)出集成效應(yīng)。研究中如果出現(xiàn)去掉某一成分后藥效影響很大，可說明該成分是發(fā)揮藥效的關(guān)鍵成分，應(yīng)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定時(shí)重點(diǎn)設(shè)定；如果出現(xiàn)藥效影響不大的現(xiàn)象，說明該成分的效應(yīng)可被其它類似物所取代，且與其它結(jié)構(gòu)類似物之間不產(chǎn)生協(xié)同作用，可不作為質(zhì)控的指標(biāo)成分（特征性成分除外）。

目前，成分敲除技術(shù)國(guó)內(nèi)外已陸續(xù)應(yīng)用于藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究，不過相關(guān)研究的數(shù)量偏少，未來有很大的發(fā)展空間。在研究中是采用色譜敲除法還是抗體敲除法，由于實(shí)踐的相對(duì)匱乏，因此提出客觀的評(píng)述是困難的。不過，基于這兩種敲除法的原理，可初步分析得到兩者的適用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)（表1）?？贵w敲除法采用的是免疫親和色譜，因此整個(gè)制備過程需要在水相中完成，僅適用于水溶性較強(qiáng)的小分子或大分子化合物的敲除，不如色譜敲除法適用范圍廣。不過，由于采用的是抗體和抗原之間的特異性結(jié)合原理，抗體敲除法天然選擇性高，抗體大規(guī)模制備成本相對(duì)低；而色譜敲除法的選擇性受制于敲除化合物與其它化合物之間的分離效果，并需要專門的制備液相色譜系統(tǒng)。未來需要更多的實(shí)踐來驗(yàn)證這些適用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)；如果屬實(shí)，那么如何拓展適用范圍以及克服優(yōu)缺點(diǎn)是需要進(jìn)一步研究的方向。

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Application of Ingredient Knock-Out Technology in Pharmacodynamic Material Basis Research of Traditional Chinese Medicine

Shao Xiao, Zhu Kexuan, Zhang Qiang, Zhao Yunan
(Research Center, Basic Medical College, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China)

Studies on pharmacodynamic material basis are critical for the development of traditional Chinese medicine. Recently， ingredient knock-out technologies， including chromatography knock-out and antibody knock-out， were introduced to recent experimental studies. It was adopted for understanding the effects of the same ingredient in different herbal medicines and of different ingredients in the same herbal medicine. The ingredients were sorted distinctly and some new findings were obtained. So the utilization of ingredient knock-out technology not only brought a new perspective of comprehending pharmacodynamic material basis of traditional Chinese medicine and formulating appropriate criteria of quality control， but also was beneficial to understand the scientific significance of “compatibility” between different ingredients within a single herbal medicine in modern sense.

Traditional Chinese medicine， pharmacodynamic material basis， ingredient knock-out，chromatography knock-out， antibody knock-out

10.11842/wst.2016.09.021

R966

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-09-20

修回日期：2016-09-20

＊ 國(guó)家自然科學(xué)基金委青年基金項(xiàng)目（81303246）：腦局部糖原代謝在人參總皂苷抗應(yīng)激致海馬結(jié)構(gòu)可塑性損傷中的作用研究，負(fù)責(zé)人：趙玉男；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（中西醫(yī)結(jié)合），負(fù)責(zé)人：黃熙。

＊＊ 通訊作者：趙玉男，副教授，主要研究方向：中藥藥理學(xué)。