基于斑馬魚模型探討馬錢子的抗血管生成活性＊

倪媛媛，趙崇軍，馮婭茹，田敬歡，張文婷，夏 青，樊嬌嬌，馬志強，林瑞超

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 中藥品質(zhì)評價北京市重點實驗室 北京 100102）

基于斑馬魚模型探討馬錢子的抗血管生成活性＊

倪媛媛，趙崇軍，馮婭茹，田敬歡，張文婷，夏 青，樊嬌嬌，馬志強＊＊，林瑞超＊＊

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 中藥品質(zhì)評價北京市重點實驗室 北京 100102）

目的：以斑馬魚為模型，探討馬錢子的抗血管生成活性。方法：以Tg（kdrl:mCherry）斑馬魚和野生斑馬魚為模型，在安全濃度范圍內(nèi)，分別采用熒光顯像和體內(nèi)堿性磷酸酶定量檢測的方法，以PTK787為陽性對照，考察馬錢子水提取物對斑馬魚血管生成的抑制作用。結(jié)果：與空白對照組比較，在一定的濃度范圍內(nèi)，低濃度的馬錢子水提取物能抑制Tg（kdrl:mCherry）斑馬魚的節(jié)間血管生成，隨著提取物濃度的增加抑制作用更加明顯，抑制作用呈劑量依賴性。在堿性磷酸酶定量檢測實驗中，馬錢子水提取物濃度為25 μg·mL-1時，血管生成抑制率為8.61%；濃度為100 μg·mL-1時，血管生成抑制率為26.16%；在一定的濃度范圍內(nèi)，馬錢子處理組均表現(xiàn)出顯著的抗血管生成活性（P＜0.05），血管生成抑制率與馬錢子水提取物濃度成線性關(guān)系。結(jié)論：馬錢子水提取物可以有效的抑制斑馬魚血管生成，有明顯的抗血管生成活性。

馬錢子 斑馬魚 抗血管生成 熒光顯像 堿性磷酸酶定量

馬錢子為馬錢科植物馬錢Strychons nux-vomica L.的干燥成熟種子，具有通絡(luò)止痛，散結(jié)消腫的功效，用于治療跌打損傷，骨折腫痛，風(fēng)濕頑痹，麻木癱瘓，癰疽瘡毒，咽喉腫痛[1]。馬錢子的主要成分生物堿既是有效成分也是毒性成分[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，馬錢子具有抗心律失常、抗血栓、抗炎免疫[3]、抗腫瘤[4]等藥理作用，其中，抗腫瘤作用最引人注目。

作為一種模式生物，斑馬魚具有飼養(yǎng)繁殖容易、胚胎發(fā)育迅速等特點，被廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)和發(fā)育生物學(xué)研究。近些年，斑馬魚逐漸被應(yīng)用于中藥活性、毒性成分的高通量篩選[5]。在胚胎發(fā)育早期，斑馬魚具有光學(xué)透明性，且血管的生成模式比較簡單，主要出現(xiàn)在頭部和軀干部體節(jié)間[6]，可以在顯微鏡下直接觀察其血管的生成情況而不需要復(fù)雜的解剖。此外，血管內(nèi)源性堿性磷酸酶染色能夠進一步確定藥物的抗血管生成活性，該方法簡單易行。因此，斑馬魚已經(jīng)成為一種理想的抗血管生成藥物的篩選模型。

本實驗以Tg（kdrl:mCherry）斑馬魚和野生斑馬魚為模型，分別采用熒光顯像和體內(nèi)堿性磷酸酶定量檢測的方法，以PTK787為陽性對照，觀察斑馬魚節(jié)間血管生成數(shù)目，測定體內(nèi)堿性磷酸酶含量，探討馬錢子水提取物的抗血管生成活性。

1 實驗材料

1.1 主要儀器與試藥

TE-2000-S型光學(xué)倒置顯微鏡（日本尼康公司）；BX51熒光顯微鏡（日本奧林巴斯集團）；200 μL、1 mL、5 mL移液器（德國Eppendorf公司）；LRH-250Z型恒溫生化培養(yǎng)箱（廣州滬瑞明儀器有限公司）；RJLDL-50G型離心機（無錫瑞江分析儀器有限公司）；HZQ-QX型全溫振蕩箱（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；Epoch酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；HQ10-20H超純水儀（長沙聚豐環(huán)?？萍加邢薰荆?；塑料吸管（江蘇天力醫(yī)療器械有限公司）。

馬錢子為安國圣山藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為馬錢科馬錢屬植物馬錢Strychnos nux-vomica L.的干燥成熟種子。PNPP（北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司）；二乙醇胺緩沖液（美國Thermo Scientific公司）；無水乙醇、NaOH、Na2HPO4、KCl、K2HPO4、MgSO4、NaCl、NaHCO3均為分析純（北京化工廠）；CaCl2（德國Sigma公司）；麻醉劑（MS222，德國Sigma公司）；水為超純水；琥珀酸瓦他拉尼（PTK787）（上海瀚香生物科技有限公司，批號：201605129）。

1.2 實驗動物

實驗用Tg（kdrl:mCherry）斑馬魚和野生斑馬魚親魚均來源于中國科學(xué)院水生生物研究所，并在本實驗室進行飼養(yǎng)繁殖。飼養(yǎng)條件如下：水溫控制在28±1℃，pH=7-7.2，電導(dǎo)率400-500 μs·cm-1，光照/黑暗周期為14 h/10 h，養(yǎng)殖系統(tǒng)為愛生牌斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)。

2 實驗方法

2.1 馬錢子樣品制備及分組

2.1.1 斑馬魚胚胎培養(yǎng)液

按 照Zebrafish Book標 準 配 制：0.25 mol·L-1Na2HPO4、0.137 mol·L-1NaCl、0.44 mol·L-1K2HPO4、5.4 mol·L-1KCl、4.2 mol·L-1NaHCO3、1.0 mol·L-1MgSO4、1.3 mol·L-1CaCl2的含4%亞甲基藍的水溶液。

2.1.2 藥物的制備

稱取25 g的馬錢子生品，粉碎后過40目篩，加入10倍量的水加熱回流提取2次，每次1 h，過濾，5 000 r·min-1離心30 min，上清液濃縮干燥，貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 馬錢子水提取物溶液的配制及分組

準確稱取0.01 g的馬錢子水提取物粉末，研磨，溶于50 mL的胚胎培養(yǎng)液中，超聲30 min，配制成200 μg·mL-1的母液，用胚胎培養(yǎng)液將母液稀釋至所需濃度，即為馬錢子組；0.1 μg·mL-1PTK787為陽性對照組；等體積的胚胎培養(yǎng)液為空白對照組。

2.2 馬錢子水提取物溶液對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

在顯微鏡下選取正常發(fā)育受精后6-8 h（post-受精的單詞，6-8 hpf）的斑馬魚胚胎，并將其隨機轉(zhuǎn)入含有4 mL胚胎培養(yǎng)液或不同濃度馬錢子水提取物溶液的12孔板，每2孔為同一藥物濃度，每孔25枚胚胎，置于28.5℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔24 h更換馬錢子水提取物溶液1次，培育至48 hpf。實驗終點，在光學(xué)倒置顯微鏡下觀測斑馬魚胚胎心臟發(fā)育情況，初步判斷馬錢子水提取物對斑馬魚胚胎的致畸性。

2.3 血管生成測定

2.3.1 熒光顯像的方法

取6-8 hpf的Tg（kdrl:mCherry）斑馬魚胚胎按2.2項下處理，以PTK787為陽性對照，培育至72 hpf，在實驗終點，使用麻醉劑將斑馬魚麻醉，在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚體內(nèi)節(jié)間血管生成情況并拍照，評價馬錢子水提取物對斑馬魚節(jié)間血管生成的抑制作用。

2.3.2 體內(nèi)堿性磷酸酶定量的方法

取6-8 hpf的野生斑馬魚胚胎按2.2項下處理，以PTK787為陽性對照，培育至72 hpf，參照Huang等[7]的方法進行體內(nèi)堿性磷酸酶染色，對血管生成進行定量評價，確定馬錢子水提取物對斑馬魚血管生成的抑制作用。步驟如下：① 吸除孔板中的馬錢子水提取物溶液，用胚胎培養(yǎng)液清洗2次；② -20℃預(yù)冷的70 %乙醇水中處理10 min；③ 無水乙醇脫水，滲透30 min；④ 二乙醇胺緩沖液洗3次，每次10 min；⑤ 2 mL 0.5mg·mL-1的PNPP室溫振蕩孵育 30 min；⑥ 每孔加入500 μL 2 mol·L-1的NaOH，終止反應(yīng)；⑦ 將反應(yīng)液（200 μL）置于96孔板中，在酶標儀中測吸光度（OD405）；⑧ 計算血管生成抑制率，公式如下：

2.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SAS 9.30統(tǒng)計分析-軟件進行數(shù)據(jù)處理，多組數(shù)據(jù)均以均值±方差（±s）方式表示，方差分析采用方差分析（ Analysis of Variance，ANOVA )，P＜0.05為統(tǒng)計學(xué)顯著差異。

3 實驗結(jié)果

3.1 馬錢子水提取物溶液對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

在不同濃度馬錢子處理組中，斑馬魚胚胎發(fā)育至48 hpf 時出現(xiàn)了明顯的心包水腫，心率降低，血流速度減慢等癥狀。以心率為指標評價馬錢子水提取物對斑馬魚胚胎心臟發(fā)育的影響。結(jié)果顯示，各處理組與空白對照組，處理組之間均存在顯著性差異（P＜0.05）。在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著馬錢子水提取物濃度的增加，斑馬魚心臟毒性越明顯（圖1）。

圖1 馬錢子水提取物溶液對斑馬魚48 hpf胚胎心率的影響

3.2 血管生成測定

3.2.1 熒光顯像的方法

在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白對照組斑馬魚體節(jié)間血管正常形成，血管紅色熒光清晰可見；馬錢子處理組斑馬魚體節(jié)間血管出現(xiàn)部分缺失或全部缺失；陽性對照組斑馬魚的體節(jié)間血管也同樣出現(xiàn)了缺失。結(jié)果表明，與空白對照組比較，在一定的濃度范圍內(nèi)，低濃度馬錢子水提取物能夠抑制斑馬魚的節(jié)間血管生成數(shù)目，隨著馬錢子水提取物濃度的增加，抑制作用越來越明顯（圖2）。

圖2 馬錢子水提取物對Tg(kdrl:mCherry)斑馬魚血管生成抑制情況

3.2.2 體內(nèi)堿性磷酸酶定量檢測的方法

由于堿性磷酸酶和底物PNPP反應(yīng)能生成黃色產(chǎn)物，可根據(jù)該產(chǎn)物在405 nm處的吸光度來計算斑馬魚體內(nèi)血管生成情況。選擇不同濃度馬錢子水提取物溶液處理6-8 hpf斑馬魚胚胎培育至72 hpf，對其體內(nèi)的堿性磷酸酶含量進行測定。結(jié)果顯示，當馬錢子水提取物濃度為25、50、75、100 μg·mL-1時，斑馬魚血管生成抑制率分別為8.61%、14.53%、22.50%、26.16%，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。陽性對照組抑制率為14.94%，顯著高于25 μg·mL-1馬錢子組（P＜0.05），顯著低于75、100 μg·mL-1馬錢子組（P＜0.05），而50 μg·mL-1馬錢子組與陽性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。一定范圍內(nèi)，隨著馬錢子水提取物濃度的增加，血管生成抑制作用更加明顯，斑馬魚血管生成抑制率與馬錢子水提取物濃度呈線性關(guān)系：Y=0.2648X+1.118，R2= 0.9856（圖3、圖4）。

圖3 馬錢子水提取物對72 hpf斑馬魚胚胎血管生成影響的定量堿性磷酸酶檢測

4 討論

腫瘤的發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移與腫瘤新生血管的形成密切相關(guān)[8，9]。腫瘤新生血管的形成是以血管生成的方式發(fā)生的，若能抑制腫瘤血管生成，則可達到抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的目地，因此，“抗血管生成療法”成為了研究者們尋求腫瘤治療的新途徑[10，11]。在抗血管生成活性藥物篩選中，斑馬魚早期血管生成的模式比較簡單，顯微鏡下能夠動態(tài)觀察其逐步延伸的發(fā)育過程，并且斑馬魚在血液循環(huán)系統(tǒng)嚴重缺陷的情況下仍能存活7天以上[12]。熒光標記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚使得在活體胚胎中篩選抗血管生成活性藥物的過程更加直觀、快捷[13]，實驗結(jié)果便于統(tǒng)計、可信[14，15]。此外，斑馬魚模型還能夠?qū)崿F(xiàn)抗血管生成活性化合物的高通量篩選，在一次平行試驗中可以對多個化合物同時進行測定，獲得高通量的數(shù)據(jù)且便于系統(tǒng)分析處理[16-18]?？傊唏R魚在抗血管生成活性篩選中是體內(nèi)動物模型和體外細胞模型的結(jié)合體，不僅能夠在整體水平上觀察藥物對斑馬魚血管的抑制作用，還可以從分子水平探討影響血管生成的機制，能充分發(fā)揮早期活性成分（部位）發(fā)現(xiàn)以及化合物活性評價的優(yōu)勢[19]，這對中國現(xiàn)有的抗癌藥新藥發(fā)現(xiàn)和早期篩選模型將會是一個有力的補充，其應(yīng)用前景十分廣闊。

本實驗以Tg（kdrl:mCherry）斑馬魚和野生斑馬魚為模型，在安全濃度范圍內(nèi)，分別采用熒光顯像和體內(nèi)堿性磷酸酶定量的方法，對馬錢子水提取物的抗血管生成活性進行評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組和陽性對照組比較，低濃度的馬錢子水提取物就能夠抑制斑馬魚的節(jié)間血管生成數(shù)目，降低體內(nèi)堿性磷酸酶的含量，且低濃度的馬錢子水提取物具有較顯著的抗血管生成活性。該實驗進一步證實了馬錢子具有抗腫瘤活性，未來能夠用于抗腫瘤活性物質(zhì)的篩選和研發(fā)。

本實驗中采用的陽性對照藥物PTK787是一種新型酞嗪類小分子酪氨酸激酶抑制劑，通過抑制VEGF的表達來實現(xiàn)抗血管生成作用[20]。雖然，本實驗結(jié)果表明馬錢子水提取物具有抗血管生成活性，但是馬錢子水提取物抑制斑馬魚血管生成是否與生長因子水平尤其是VEGF 水平有關(guān)，以及抑制斑馬魚血管生成的作用機制尚需進一步研究。此外，馬錢子作為毒性較大的中藥，對斑馬魚具有明顯的毒性，會引發(fā)機體出現(xiàn)心包水腫、心率降低、血流速度減慢等癥狀。從某種程度上來說，我們要確定馬錢子的抗血管生成作用是否與細胞毒性相關(guān)，為有毒中藥的二次開發(fā)提供新的思路和方法。

圖4 斑馬魚血管生成抑制率與馬錢子水提取物濃度的線性關(guān)系

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The Anti-Angiogenetic Effect of Strychons Nux-vomica on Zebrafish

Ni Yuanyuan, Zhao Chongjun, Feng Yaru, Tian Jinghuan, Zhang Wenting, Xia Qing, Fan Jiaojiao, Ma Zhiqiang, Lin Ruichao
(Beijing Key Laboratory for Quality Evalution of Traditional Chinese Medicine, School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

This study aimed to explore the anti-angiogenetic effect of the seeds of S. nux-vomica on zebrafish. Taking Tg (kdrl:mCherry) zebrafish and wild zebrafish as the models， fluorescence imaging and quantitative endogenous alkaline phosphatase assay in vivo respectively were adopted in the scope of the safe concentration of S. nux-vomica seeds. The angiogenesis activity of S. nux-vomica seeds in zebrafish was investigated taking PTK787 as the positive control. As a result， in a certain range of concentrations， the low concentration of the water extract of S. nux-vomica seeds limited the number of intersegmental blood vessels in Tg (kdrl:mCherry) zebrafish compared with the blank control group. With the increased concentration of the water extract of S. nux-vomica seeds， the anti-angiogenetic effect enhanced in a dose-dependent manner. The quantitative endogenous alkaline phosphatase assay showed that as the concentration of water extract of the seeds of S. nux-vomica was 25 μg·mL-1the anti-angiogenesis effect was 8.61%; and while the concentration was 100 μg·mL-1， the anti-angiogenesis effect was 26.16%. At least for some range of concentrations， the different treatment groups showed that the difference was statistically significant (P ＜0.05)， and the anti-angiogenetic effect was closely associated with the concentration of the water extract of S. nux-vomica seeds in the linear relation. In conclusion， the water extract of S. nux-vomica seeds presented significant anti-angiogenetic effect and effectively suppressed angiogenesis in zebrafish.

Zebrafish， Strychons nux-vomica， anti-angiogenesis， fluorescence imaging， quantitative endogenous alkaline phosphatase assay

10.11842/wst.2016.09.017

R966

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：朱黎婷）

2016-06-29

修回日期：2016-08-30

＊ 北京市教委共建項目：基于化學(xué)成分和斑馬魚特性對有毒中藥材進行安全性評價的關(guān)鍵技術(shù)研究和應(yīng)用，負責人：林瑞超。

＊＊ 通訊作者：林瑞超，本刊編委，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥民族藥品質(zhì)評價、中草藥活性成分等；馬志強，教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。