葛根總黃酮磷脂復(fù)合物制備工藝的研究*

黎 迎，宋軼群，張 運(yùn)，朱春燕

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 北京 100193）

葛根總黃酮磷脂復(fù)合物制備工藝的研究*

黎 迎，宋軼群，張 運(yùn)，朱春燕＊＊

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 北京 100193）

目的：優(yōu)選葛根總黃酮磷脂復(fù)合物最佳成型工藝。方法：以磷脂復(fù)合物的復(fù)合率和表觀油水分配系數(shù)為指標(biāo)，采用單因素正交試驗優(yōu)化葛根總黃酮磷脂復(fù)合物處方。結(jié)果：優(yōu)選出制備工藝的最佳條件：葛根總黃酮和大豆卵磷脂質(zhì)量比為1:4，反應(yīng)溶劑為甲醇，葛根總黃酮的濃度為4 mg·mL-1，反應(yīng)溫度為55℃，反應(yīng)時間為2 h。按得到的優(yōu)化條件制備的磷脂復(fù)合物的復(fù)合率為102.98%；pH=3時，Papp=0.392；pH=6.8時，Papp=0.323；綜合得分為95.11分。結(jié)論：優(yōu)化所得葛根總黃酮磷脂復(fù)合物處方合理，復(fù)合率高，油水分配系數(shù)增高，脂溶性得到改善。

葛根總黃酮 磷脂復(fù)合物 制備工藝 正交試驗

藥物的油水分配系數(shù)（log P）可用于預(yù)測藥物的吸收，腸道不同部位對藥物吸收所需要的油水分配系數(shù)不同，胃腸道適宜吸收的油水分配系數(shù)值的范圍是0.3-2.0。對葛根總黃酮的理化性質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，葛根總黃酮中葛根素在各生理pH下的log P值均小于零，說明其極性大，親脂性弱，透膜吸收存在困難，為胃腸道吸收較差的原因之一。

磷脂的乳化作用可提高葛根素在大鼠離體腸管吸收量的2-4倍，乳劑憑其脂溶性而易于通過生物膜是提高葛根素生物利用度的物理化學(xué)基礎(chǔ)[1-4]。磷脂可提高葛根素的生物利用度，有利于葛根素通過生物膜進(jìn)入靶器官[5-8]。因此，本研究期望通過將葛根總黃酮制成磷脂復(fù)合物來提高葛根總黃酮的表觀油水分配系數(shù)，從而得到脂溶性高的葛根總黃酮制劑，增強(qiáng)透膜吸收。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HC-188加熱循環(huán)器（Shishim公司）；VV2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidolph公司）；UGC-12MF氮吹儀（北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司）。

1.2 試藥

葛根素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110752-200511）；葛根總黃酮提取物（本室自制，批號：040120）[9]；大豆磷脂酰膽堿（德國Lipoid公司，批號：S100）。

2 方法與結(jié)果

2.1 磷脂復(fù)合物的制備

將葛根總黃酮和卵磷脂溶于10 mL溶劑中，控制一定的反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間，500 r·min-1水浴循環(huán)攪拌加熱，反應(yīng)完畢后，在70℃條件下以60r·min-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去反應(yīng)溶劑，再加入2.0 mL氯仿，充分溶解其中的磷脂及磷脂復(fù)合物（葛根總黃酮在CHCl3中不溶，磷脂及磷脂復(fù)合物溶于CHCl3），用0.45 μm有機(jī)濾膜過濾，收集濾膜上的沉淀，干燥并稱重。同時取續(xù)濾液于70℃，60 r·min-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸干。

2.2 葛根總黃酮中葛根素的高效液相色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）。流動相為：乙腈（A）- 0.05%醋酸水（B），梯度洗脫（0-20 min，10%A；20-30 min，20%A；30-40 min， 30%A；40-50 min，40%A；50-75 min，10%A），波長為254 nm，溫度為40℃，流速為1.0 mL?min-1，進(jìn)樣量為20 μL。

圖1 不同溶劑的磷脂復(fù)合物的復(fù)合率（n=3）

圖2 不同溶劑的磷脂復(fù)合物的表觀油水分配系數(shù)（n=3）

圖3 不同反應(yīng)時間對磷脂復(fù)合物復(fù)合率的影響（n=3）

2.3 稱重法考察復(fù)合率

葛根總黃酮的初始投藥量（g）與沉淀量（g）的差值即為磷脂復(fù)合物中葛根總黃酮的量，從而計算葛根總黃酮與磷脂的復(fù)合率。

復(fù)合率（%）=（葛根總黃酮的初始投藥量-沉淀量）/葛根總黃酮的初始投藥量×100%

2.4 表觀油水分配系數(shù)

取復(fù)溶于CHCl3中的磷脂復(fù)合物溶液100 μL，氮?dú)獯蹈桑尤? mL不同pH（pH 2.94，6.88）水飽和的正辛醇溶液，渦旋，超聲，使之溶解。取2 mL此液，分別加入2 mL不同pH正辛醇飽和的水溶液，渦旋5 min，置于37℃的恒溫水浴振蕩器中振搖24 h，取出后靜置30 min，3 000 r·min-1離心10 min，分別取上下層溶液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，用HPLC測定萃取后油相、水相中的葛根素（占總黃酮17.93%）濃度，計算公式如下：

logP =log（Co/ Cw）

其中Co（μg·mL-1）為萃取后油相中的藥物濃度，Cw（μg·mL-1）為萃取后水相中的藥物濃度。

2.5 處方因素的研究

2.5.1 溶劑種類考察

葛根總黃酮與卵磷脂的投料比為1:2（質(zhì)量比）時，葛根總黃酮濃度為2 mg·mL-1，反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時間為2 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除反應(yīng)溶劑，以磷脂復(fù)合物的復(fù)合率和表觀油水分配系數(shù)為評估標(biāo)準(zhǔn)，對甲醇、乙醇、四氫呋喃、二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙醚、乙酸乙酯進(jìn)行考察，優(yōu)選出最佳反應(yīng)溶劑，復(fù)合率和表觀油水分配系數(shù)結(jié)果分別見圖1和圖2。

由圖1可知，不同溶劑制備的磷脂復(fù)合物復(fù)合率的大小為：THF＞甲醇＞丙酮＞二氯甲烷＞乙醇＞氯仿＞乙酸乙酯，其中THF、甲醇、丙酮、二氯甲烷為溶劑制備的磷脂復(fù)合物的復(fù)合率均在90%以上，且無顯著性差異（P＞0.05）。由于甲醇作為溶劑時，復(fù)合率在90%以上，且在pH=3時的表觀油水分配系數(shù)最大，故選擇甲醇作為溶劑。

2.5.2 不同反應(yīng)時間的考察

選定反應(yīng)溶劑為甲醇后，設(shè)定葛根總黃酮與卵磷脂的投料比為1:2（質(zhì)量比），葛根總黃酮濃度為2 mg·mL-1，反應(yīng)溫度為50℃，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除反應(yīng)溶劑，分別考察反應(yīng)時間為0.5、1、1.5、2、3、4 h的磷脂復(fù)合物的復(fù)合率和表觀油水分配系數(shù)，結(jié)果分別見圖3、圖4。

由圖3可知，隨著反應(yīng)時間的增加，磷脂復(fù)合物的復(fù)合率先增加后降低，在反應(yīng)時間為2 h時達(dá)到最高值93.27±3.06%。

圖4 不同反應(yīng)時間對磷脂復(fù)合物表觀油水分配系數(shù)的影響（n=3）

由圖4可知，隨著反應(yīng)時間的增加，磷脂復(fù)合物的表觀油水分配系數(shù)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在反應(yīng)時間為2 h時達(dá)到最高值，綜合反應(yīng)時間對磷脂復(fù)合物復(fù)合率的影響，因此篩選反應(yīng)時間為2 h。

2.5.3 不同反應(yīng)溫度的考察

選定反應(yīng)溶劑為甲醇，反應(yīng)時間為2 h后，設(shè)定葛根總黃酮與卵磷脂的投料比為1:2（質(zhì)量比），葛根總黃酮濃度為2 mg·mL-1，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除反應(yīng)溶劑，考察于不同反應(yīng)溫度（37、50、55℃）下磷脂復(fù)合物的復(fù)合率和表觀油水分配系數(shù)。結(jié)果分別見圖5、圖6。

由圖5可知，隨著反應(yīng)溫度的增加，磷脂復(fù)合物的復(fù)合率呈增加趨勢，但反應(yīng)溫度為50℃時和55℃時，磷脂復(fù)合物的復(fù)合率無顯著性差異（P＞0.05），且反應(yīng)溫度為50℃時，磷脂復(fù)合物的復(fù)合率就已經(jīng)達(dá)到90%以上，故考慮到節(jié)約能源，選擇反應(yīng)溫度為50℃即可。由圖6可知，隨著反應(yīng)溫度的增加，pH=3和pH=6.8條件下磷脂復(fù)合物的表觀油水分配系數(shù)均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在溫度為50℃時，達(dá)到最高值，因此篩選反應(yīng)溫度為50℃。

2.5.4 不同反應(yīng)物濃度的考察

選定反應(yīng)溶劑為甲醇，反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時間為2 h，設(shè)定葛根總黃酮與卵磷脂的投料比為1:2（質(zhì)量比），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除反應(yīng)溶劑，考察反應(yīng)物葛根總黃酮濃度（2、4、6 mg·mL-1）對磷脂復(fù)合物復(fù)合率和表觀油水分配系數(shù)的影響，結(jié)果分別見圖7、圖8。

由圖7可知，隨著反應(yīng)物濃度的增加，復(fù)合率無顯著性差異（P＞0.05）。由圖8可知，當(dāng)反應(yīng)物濃度為2 mg·mL-1時，磷脂復(fù)合物的表觀油水分配系數(shù)最大，因此篩選反應(yīng)物濃度為2 mg·mL-1。

2.5.5 不同投料比的考察

選定反應(yīng)溶劑為甲醇，反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時間為2 h，葛根總黃酮濃度為2 mg·mL-1，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除反應(yīng)溶劑，考察不同投料比（1:4，1:2，1:1，2:1，4:1）對磷脂復(fù)合物復(fù)合率和表觀油水分配系數(shù)的影響，結(jié)果分別見圖9、圖10。

圖5 不同反應(yīng)溫度對磷脂復(fù)合物復(fù)合率的影響（n=3）

圖6 不同反應(yīng)溫度對磷脂復(fù)合物表觀油水分配系數(shù)的影響（n=3）

圖7 不同反應(yīng)物濃度對磷脂復(fù)合物復(fù)合率的影響（n=3）

圖8 不同反應(yīng)物濃度對磷脂復(fù)合物表觀油水分配系數(shù)的影響（n=3）

圖9 不同投料比對磷脂復(fù)合物復(fù)合率的影響（n=3）

圖10 不同投料比對磷脂復(fù)合物表觀油水分配系數(shù)的影響（n=3）

表1 正交設(shè)計的因素與水平的確定

由圖9可知，當(dāng)葛根總黃酮與卵磷脂的投料比為1:2時，磷脂復(fù)合物的復(fù)合率最大，為102.45%，因此選擇投料比為1:2。由圖10可知，隨著葛根總黃酮比例的增大，磷脂復(fù)合物的表觀油水分配系數(shù)呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢。當(dāng)葛根總黃酮與卵磷脂的投料比為1:2時，pH=3和pH=6.8條件下磷脂復(fù)合物的logP均為最高，分別為-0.484和-0.384，因此篩選投料比為1:2。

2.6 正交設(shè)計優(yōu)化磷脂復(fù)合物處方

2.6.1 正交設(shè)計的因素與水平的確定

根據(jù)單因素考察的實驗結(jié)果，反應(yīng)物的質(zhì)量濃度（mg·mL-1）、反應(yīng)投料比和反應(yīng)溫度（℃）對復(fù)合率和表觀油水分配系數(shù)影響較大，根據(jù)預(yù)實驗確立各因素的考察范圍。因此，以復(fù)合率和表觀油水分配系數(shù)為指標(biāo)，對A（反應(yīng)物的濃度）、B（反應(yīng)投料比）、C（反應(yīng)溫度）作三因素三水平的正交實驗設(shè)計，反應(yīng)溶劑為甲醇，反應(yīng)時間為2 h，采用L9（34）表。

2.6.2 正交實驗設(shè)計方案與結(jié)果

由表1可知，按照正交表L9（34）安排了9 次實驗，以復(fù)合率和油水分配系數(shù)為指標(biāo)對磷脂復(fù)合物質(zhì)量進(jìn)行考察，采用綜合加權(quán)評分法，將多指標(biāo)轉(zhuǎn)化為單一指標(biāo)。正交實驗設(shè)計表和方差分析結(jié)果分別見表2、表3。其中，復(fù)合率（f1）指標(biāo)公式如下：

f1=（葛根總黃酮的初始投藥量-沉淀量）/葛根總黃酮的初始投藥量×100

表觀油水分配系數(shù)公式：

f2=Papp（pH=3）/Pappmax（pH=3）×100

f3=Papp（pH=6.8）/Pappmax（pH=6.8）×100

式中Papp為各處方測得的平均表觀油水分配系數(shù)，Pappmax為測得的最大表觀油水分配系數(shù)。綜合指標(biāo)公式：

根據(jù)極差及方差分析可知，各因素對總分的影響依序為A＞C＞B，反應(yīng)物濃度對總分的影響最大，但各因素的影響無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。由表2、表3可知，擬定優(yōu)化處方為A2B1C3，即反應(yīng)物濃度為4 mg·mL-1，葛根總黃酮/磷脂=1:4，反應(yīng)溫度為55℃。

2.6.3 驗證實驗

按最佳處方A2B1C3進(jìn)行驗證實驗，其復(fù)合率 為 102.98%，pH=3時 Papp=0.392，pH=6.8時Papp=0.323，綜合得分為95.11分。

表2 正交實驗設(shè)計及結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

3 討論

天然活性成分磷脂復(fù)合物是將天然活性成分與磷脂在適宜條件下進(jìn)行復(fù)合得到的一類化合物。據(jù)報道，天然活性成分磷脂復(fù)合物的理化性質(zhì)和生物性質(zhì)較原化合物均有不同程度的改變，具有較強(qiáng)的親脂性，通過與磷脂復(fù)合而形成載體系統(tǒng)或前體藥物，可有效地提高天然活性成分的體內(nèi)吸收，顯著地改善其生物有效性[10，11]。

本研究以葛根總黃酮與磷脂復(fù)合物復(fù)合的百分率以及磷脂復(fù)合物的表觀油水分配系數(shù)為指標(biāo)，采用正交實驗設(shè)計，優(yōu)化了葛根總黃酮磷脂復(fù)合物的制備條件，經(jīng)過工藝篩選，以價格低、來源廣甲醇作為反應(yīng)溶劑，得到了102.98%的復(fù)合率，這與文獻(xiàn)[12，13]報道的以介電常數(shù)大的甲醇、乙醇為反應(yīng)溶劑時，由于介電常數(shù)大所產(chǎn)生的反向電勢也大，從而降低了反應(yīng)物間的相互作用力，不利于異號離子間化合反應(yīng)的結(jié)論相一致。

4 結(jié)論

本實驗以葛根總黃酮與磷脂復(fù)合的百分率以及磷脂復(fù)合物的表觀油水分配系數(shù)為指標(biāo)，采用正交實驗設(shè)計，優(yōu)化了葛根總黃酮磷脂復(fù)合物的制備工藝，按得到的優(yōu)化條件制備的磷脂復(fù)合物的復(fù)合率 為102.98%。pH=3時，Papp=0.392；pH=6.8時，Papp=0.323，而葛根總黃酮油水分配系數(shù)為：pH=3時，Papp=-0.396；pH=6.8時，Papp=-0.657。因此該工藝制備的葛根總黃酮磷脂復(fù)合物提高了葛根總黃酮的油水分配系數(shù)，改善了脂溶性。

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Research on Preparation Technology of Flavonid Phospholipid Complex of Pueraria

Li Ying,Song Yiqun,Zhang Yun,Zhu Chunyan
(Institute of Medicinal Plant Development,Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College,Beijing 100193,China)

This study aimed to optimize the preparation technology of phospholipid complex of puerariaflavonoid. Taking composite ratio and oil-water partition coefficient of phospholipid complex as indexes,the single factor test and the orthogonal test were adopted to optimize the formula of the phospholipid complex in pueraria flavonoid. It was found that the optimum conditions were as follows: the weight ratio of pueraria flavonid to soybean phospholipid was 1：4,the reaction solvent was methanol,the concentration of puerariaflavonoid was 4 mg·mL-1,the reaction temperature was 55 ℃ ,and the reaction time was 2 h. The composite ratio of phospholipid complex was 102.98%,with the Papp values of 0.392 (pH=3) and 0.323 (pH=6.8),respectively. The comprehensive score was 95.11. It was concluded that the prescription of phospholipid complex in pueraria flavonoid was desirable featuring high composite ratio,increased oil-water partition coefficient and the improved lipid solubility.

Pueraria flavonoid,phospholipid complex,preparation technology,orthogonal test

10.11842/wst.2016.05.032

R283

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-02-18

修回日期：2016-03-07

＊ 國家自然科學(xué)基金委面上項目（81274094）：中藥有效部位及其與生物黏附材料相互作用的吸收機(jī)制對構(gòu)建GBDDS的影響，負(fù)責(zé)人：朱春燕。

＊＊ 通訊作者：朱春燕，研究員，主要研究方向：中藥新劑型與新技術(shù)。