超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜法測定中藥材（飲片）中非法添加6種水溶性紅色素通用方法的研究＊

徐昱婷，張學(xué)博，蘇 靜，龔 瑞，徐 剛，沙禕煒＊＊

（1. 閘北區(qū)衛(wèi)生和計劃生育委員會 上海 200070；2.上海市崇明食品藥品檢驗所 上海 202150；3. 上海食品藥品包裝材料測試所 上海 201203）

超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜法測定中藥材（飲片）中非法添加6種水溶性紅色素通用方法的研究＊

徐昱婷1，張學(xué)博2，蘇 靜2，龔 瑞3，徐 剛2，沙禕煒2＊＊

（1. 閘北區(qū)衛(wèi)生和計劃生育委員會 上海 200070；2.上海市崇明食品藥品檢驗所 上海 202150；3. 上海食品藥品包裝材料測試所 上海 201203）

目的：建立快速篩查及確證中藥材（飲片）中非法添加6種水溶性紅色素（日落黃、莧菜紅、胭脂紅、赤蘚紅、新品紅、酸性紅73）的超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜的通用方法。方法：中藥材（飲片）經(jīng)溶劑提取后，采用超高效液相色譜法分離，以乙腈和5 mmol·L-1乙酸銨溶液為流動相，進行梯度洗脫，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式，篩查中藥材（飲片）中非法添加的6種水溶性紅色素，并進行確證。結(jié)果：超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜可在4 min內(nèi)快速篩選并確證是否含有非法添加的6種水溶性紅色素。結(jié)論：該方法具有簡便快捷、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確的特點，適用于中藥材（飲片）中非法添加6種水溶性紅色素的篩查和確證工作。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 色素 中藥材（飲片） 非法添加

近年來，在藥品檢驗工作中發(fā)現(xiàn)有不法分子將假、劣藥材染色后冒充正品，顏料染色偽制的常用藥材、貴細中藥材（飲片），外觀性狀酷似正品，隱蔽性大，不易辨別。如果缺乏相關(guān)的藥材知識和嚴(yán)格的監(jiān)管制度，這些假冒偽劣中藥材會在臨床應(yīng)用，這將擾亂藥材市場，嚴(yán)重影響中藥材的臨床合理、安全、有效用藥，甚至危及患者的生命。若染色藥材經(jīng)進一步加熱炮制，如蒲黃炒炭、黃芩酒炒等，其中的化工染料又可能因受熱分解產(chǎn)生新的有害物質(zhì)。這會給患者用藥安全帶來潛在威脅，給患者家庭造成重大經(jīng)濟損失。因此，必須隨時隨地予以嚴(yán)厲打擊，依法檢查和處理假冒偽劣中藥材[1，2]。

目前，中國中藥材（飲片）現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中，對于此類染色現(xiàn)象的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)較少，國內(nèi)外對于中藥材（飲片）中非法添加色素檢測方法的相關(guān)研究報道文獻較少，而檢測多組分色素或色素系列的方法更為罕見。在檢測中藥材（飲片）非法添加色素的研究工作中，檢測方法開始向儀器化和自動化發(fā)展，目前色素測定多采用薄層色譜法[3，4]、液相色譜法[5-9]和氣相色譜-質(zhì)譜法[10]，而液相色譜-質(zhì)譜法[11-14]則主要用于食品檢測，且食品中色素檢測方法[15]較為多樣和通用。雖然，《中國藥典》2015年版第四部有9303色素測定法指導(dǎo)原則[16]，但覆蓋面和通用性尚需完善。

由于不法分子貪圖利益，中藥尤其是中藥材（飲片）非法添加色素的狀況愈演愈烈。因此，建立系統(tǒng)的中藥材（飲片）多組分色素的檢測方法工作迫在眉睫。

為解決以上問題，本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜法測定法，建立了一種快速篩查和確證中藥材（飲片）中非法添加6種水溶性紅色素的通用方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、藥品與試劑

ACQUITY UPLC超高效液相色譜系統(tǒng)（美國Waters公司）；Waters BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；TQD三重四級桿質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；0.2 μm針式濾器（上海安譜公司）。

乙腈、甲醇（德國Merck公司，色譜純）；純凈水（中國娃哈哈公司）；其余試劑均為分析純；日落黃、莧菜紅、胭脂紅、赤蘚紅、酸性紅73、新品紅標(biāo)準(zhǔn)品（購自中國藥品生物制品檢定所）；朱砂、紫蘇梗、烏梅、五味子、枸杞子、雞血藤、丁香、紅花、玫瑰花、丹參（均為市售商品藥材）。

1.2 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），流速：0.2 mL·min-1， 柱溫：25℃， 進樣量：10 μL，樣品室溫度：20 ℃，流動相：采用5 mmol·L-1乙酸銨溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫表

1.3 質(zhì)譜條件

離子化模式：電噴霧離子源（ESI），正離子模式（ESI+）；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；毛細管電壓：3.5 kV，去溶劑氣溫度400℃，離子源溫度：120℃，用于定性的離子對及錐孔電壓和碰撞能量參數(shù)[17]見表2。

表2 六種色素質(zhì)譜MRM多反應(yīng)監(jiān)測其他條件

1.4 標(biāo)準(zhǔn)儲備液和工作液的配制

精密稱取適量的各色素標(biāo)準(zhǔn)品，用70%乙醇溶解并定容至10 mL，配制出1 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20℃下保存。精密量取各色素標(biāo)準(zhǔn)儲備液200 μL，用水定容至100 mL，作為混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4℃下保存。

1.5 樣品前處理

1.5.1 陽性樣品制備

取已知不含任何色素的丁香和雞血藤，將標(biāo)準(zhǔn)混合溶液按0.4 mg·g-1比例，定量噴灑加入中藥材（飲片）中，揮干溶劑，置烘箱中50℃干燥4 h，作為陽性樣品。

圖1 6種色素一級質(zhì)譜圖及結(jié)構(gòu)式

1.5.2 供試品溶液制備

稱取中藥材（飲片）或陽性樣品2 g，加70%乙醇20 mL，超聲提取20 min，取上清液離心，精密量取1 mL，用水定容至20 mL，過0.20 μm聚醚砜微孔濾膜后，作為供試品溶液。

2 結(jié)果

分別取朱砂、紫蘇梗、烏梅、五味子、枸杞子、雞血藤、丁香、紅花、玫瑰花、丹參等藥材共計13批樣品，其中紅花3批，按上述實驗條件進行測定。由實驗結(jié)果表明，朱砂、紫蘇梗、烏梅、五味子、雞血藤、丁香、玫瑰花、丹參及一批紅花中均未檢出含有色素，有兩批紅花中含有日落黃和胭脂紅（《中國藥典》2015年版未收載的色素[16]）。

該方法將超高效液相色譜的高速、高分離度與串聯(lián)四級桿質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度相結(jié)合，具有通用性強、選擇性好、靈敏度高、便捷省時的優(yōu)點。本研究建立了中藥材（飲片）中日落黃、莧菜紅、胭脂紅、赤蘚紅、酸性紅73、新品紅的UPLC-ESI-MS/MS檢測的方法，方法快速、簡單、靈敏，抗干擾能力強，定性準(zhǔn)確，一次提取和進樣即可完成多成分色素的篩查，也適用于中藥材（飲片）中這6種紅色素的確證，其檢測結(jié)果也為中藥材（飲片）監(jiān)督檢查提供確切、有效的科學(xué)法律依據(jù)，可用于中藥材（飲片）日常監(jiān)督檢測工作。

3 討論

3.1 樣品處理方法的優(yōu)化

3.1.1 提取方法

日落黃、莧菜紅、胭脂紅、赤蘚紅、酸性紅73、新品紅均為水溶性色素，極性較大，各色素均在水、70%乙醇中有較好的溶解性，為了獲得較高的提取效率，通過實驗比較，選擇70%乙醇作為提取溶劑。為了減少操作步驟及提高提取效率，采用超聲提取方式對樣品進行提取?？疾炝瞬煌崛r間和和提取次數(shù)的提取效果，最終確定最佳的樣品處理條件。

3.1.2 過濾器的選擇

由于中藥材（飲片）成分較復(fù)雜，經(jīng)70%乙醇提取后，可能存在一些雜質(zhì)。本實驗選擇亞微米粒徑的色譜柱，這些雜質(zhì)的存在容易堵塞液相色譜柱，也有可能污染質(zhì)譜。為了凈化樣品，避免損失儀器，樣品需通過0.20 μm微孔濾膜進行凈化。實驗室常用樣品過濾器有尼龍66（Nylon）、聚醚砜（PES）、聚偏氟乙醚（PVDF）、混合纖維素（MCE）等。本實驗考查了各種針式濾器對樣品的吸附作用。實驗結(jié)果表明，尼龍66、混合纖維素等常用針式濾器對樣品明顯的吸附作用。因此本實驗采用聚醚砜（PES）針式濾器對樣品進行凈化。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

3.2.1 色譜柱的選擇

本實驗采用1.7 μm粒徑色譜柱與傳統(tǒng)5 μm粒徑的色譜柱相比，分析時間大大減小，柱效大大提高，同時顯著提高了樣品分析的通量。

3.2.2 流動相的選擇

通過實驗分別考察了有機相溶劑（甲醇和乙腈）與不同種類揮發(fā)性緩沖液組成的流動相體系，如甲醇（或乙腈）-5mmol·L-1甲酸銨溶液、甲醇（或乙腈）-5mmol·L-1乙酸銨溶液、甲醇（或乙腈）-0.1%甲酸溶液等、結(jié)果表明，以乙腈 -5mmol·L-1乙酸銨溶液作為流動相時色譜峰形、分離效果和質(zhì)譜信號相應(yīng)最佳。通過比較不同乙酸銨緩沖液離子強度的影響，分別考察了濃度2 -10 mmol·L-1乙酸銨溶液，結(jié)果表明5mmol·L-1乙酸銨為最佳添加量。通過梯度洗脫方式，各色素能得到有效分離。

圖3 空白溶劑總離子流圖

3.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本實驗所檢測的色素為偶氮類、蒽醌類和三芳基甲烷類色素。在ESI+和ESI-離子化模式下，對各色素進行全掃描，選擇適當(dāng)?shù)碾婋x方式和子離子。結(jié)果表明，日落黃、新品紅、莧菜紅、胭脂紅、酸性紅73、赤蘚紅在ESI+電離模式下均具有較高的豐度。莧菜紅、胭脂紅、日落黃、赤蘚紅為含鈉色素，母離子為[(M-nNa)+(n+1)H]+，新品紅為含氯色素，母離子為[M-Cl+H]+。在確定各色素準(zhǔn)分子離子后，對二級質(zhì)譜進行分析，對子離子進行優(yōu)化選擇，確定定量離子和定性離子。通過優(yōu)化毛細管電壓、一級錐孔電壓、二級錐孔電壓、萃取錐孔電壓、碰撞能量、質(zhì)譜分辨率等質(zhì)譜參數(shù)，使每種色素的特征碎片離子的強度達到最大。

由于莧菜紅和胭脂紅為同分異構(gòu)體，母離子均為539，均有子離子223，因此在莧菜紅和胭脂紅在232子離子處有響應(yīng)，但是莧菜紅和胭脂紅出峰時間不同，可明顯區(qū)分莧菜紅和胭脂紅，出峰順序依次為莧菜紅、胭脂紅。

3.4 UPLC-ESI-MS/MS優(yōu)點

本實驗方法為發(fā)揮UPLC的最大優(yōu)勢，同時選用亞微米小顆粒填料色譜柱，提高了樣品分離度、樣品通量和靈敏度。0.2 mL·min-1的流速更適合質(zhì)譜電噴霧化的要求，減少溶劑對結(jié)果的影響，所用溶劑也大大減少，減少了檢驗成本，與此同時，實驗產(chǎn)生廢液也大大降低。

圖4 丁香陽性樣品總離子流圖

3.5 方法專屬性

在本實驗條件下分別稱取朱砂（礦物類）、紫蘇梗（全草類）、烏梅（果實類）、五味子（果實類）、枸杞子（果實類）、雞血藤（藤莖類）、丁香（花類）、紅花（花類）、玫瑰花（花類）、丹參（根莖類）藥材按“1.5.2 供試品溶液制備”項下方法制備供試品溶液進行測定，結(jié)果表明，這5類10種中藥材在相應(yīng)色素色譜峰位置均不干擾色素的測定。實驗還考察了溶劑對實驗結(jié)果的影響，由實驗結(jié)果表明，溶劑水和70%乙醇對色素測定均不干擾。

圖5 雞血藤陽性樣品總離子流圖

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General Approaches to Determining Six Water-Soluble Red Pigments Illegally Added in Crude Drug (Prepare Slices) by UPLC-ESI-MS / MS

Xu Yuting1,Zhang Xuebo2,Su Jing2,Gong Rui3,Xu Gang2,Sha Yiwei2
(1. Shanghai Zhabei District Health and Family Planning Commission,Shanghai 200070,China; 2. Shanghai Chongming Institute for Food and Drug Control,Shanghai 202150,China; 3. Shanghai Food and Drug Packaging Material Control Center,Shanghai 201203,China)

The study aimed to establish a general method for the rapid screening and confirmation of the six water-soluble red pigments,sunset yellow,amaranth,carmine,erythrosine,new fuchsin and acid red 73,using UPLC-ESI-MS/MS. The six water-soluble red pigments were illegally added into crude drug or prepare slices. After extracting the samples through bysolvent extraction,the UPLC-ESI-MS / MS method was adopted using a gradient elution with the mobile phase of acetonitrile and ammonium acetate solution (5 mmoL·L-1). The MRM mode was performed to screen and quantitatively confirm the six red pigments added illegally. The results showed that UPLC-ESI-MS / MS method rapidly screened and confirmed whether the illegal six red pigments had been added into the crude drug or prepare slices within 4 minutes. In conclusion,the UPLC-ESI-MS / MS method was accurate and suitable for screening and confirming water-soluble red pigments in crude drug or prepare slices featuring simple,sensitivity and accuracy.

UPLC-ESI-MS/MS,pigment,crude drug (prepare slices), illegally additives

10.11842/wst.2016.05.031

R2

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2015-12-08

修回日期：2015-12-25

＊ 上海市食品藥品監(jiān)督管理局科技攻關(guān)課題（2011JY2-06）；中藥材（飲片）中非法添加紅色類色素的快速檢測法及確證方法的建立，負責(zé)人：沙禕煒，蘇靜。

＊＊ 通訊作者：沙禕煒，在職研究生，主管中藥師，主要研究方向：中藥、食品（含保健食品）和化妝品檢驗分析及質(zhì)量管理工作。