龍膽草中農(nóng)藥嘧霉胺殘留動(dòng)態(tài)的研究＊

穆錦江，孫海峰，張帥男

（1. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 哈爾濱 150081；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 哈爾濱 150040）

龍膽草中農(nóng)藥嘧霉胺殘留動(dòng)態(tài)的研究＊

穆錦江1，孫海峰2＊＊，張帥男2

（1. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 哈爾濱 150081；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 哈爾濱 150040）

目的：建立適合龍膽草中嘧霉胺殘留的分析方法，探討龍膽中嘧霉胺殘留和消解規(guī)律。方法：本研究首次采用高效液相色譜法研究龍膽中嘧霉胺pyrimethanil的殘留動(dòng)態(tài)，對(duì)同一批經(jīng)施藥8次的龍膽按不同的時(shí)間間隔進(jìn)行分批采樣，優(yōu)化樣品制備方法和色譜條件并進(jìn)行分析。結(jié)果：建立了高效液相色譜法測(cè)定龍膽中嘧霉胺殘留量的方法，龍膽中嘧霉胺含量隨時(shí)間消減，消解方程C=1.4569-0.9105exp（59.2146t-2.7442），半衰期為6.65天。結(jié)論：本研究建立了利用高效液相色譜法測(cè)定龍膽中嘧霉胺殘留量的可靠方法，建立的消解方程能準(zhǔn)確描述龍膽中嘧霉胺消解規(guī)律。通過減少用藥次數(shù)和交替用藥，延長(zhǎng)采收的安全間隔期，可以降低農(nóng)藥殘留。

嘧霉胺 高效液相色譜法 龍膽 農(nóng)藥殘留

龍膽（Radix Gentianae）藥材主要來源為龍膽科植物龍膽Gentiana scabra Bag的干燥根及莖[1]。研究顯示[2]，斑枯病和葉枯病是龍膽草發(fā)生最普遍、危害最重的病害，目前嘧霉胺（施佳樂）是防治這類病害的新型有效藥劑，是以處理種苗防治龍膽斑枯病最佳農(nóng)藥，其防效達(dá)71.9%，田間施用嘧霉胺800倍液防治效果也很好，防效達(dá)到70.3%[3-5]。嘧霉胺是高效、低毒的新型殺菌劑，在農(nóng)業(yè)上主要用于黃瓜、番茄、草莓等灰霉病的防治[6]，目前僅對(duì)番茄、青菜、大米、草莓、葡萄等[7]農(nóng)產(chǎn)品中嘧霉胺殘留進(jìn)行了研究，而有關(guān)嘧霉胺在中藥材中殘留的研究未見報(bào)道，在龍膽中嘧霉胺殘留量及消解規(guī)律的研究尚屬空白。本研究采用高效液相色譜法測(cè)定龍膽中嘧霉胺的含量，通過建立龍膽藥材中殘留嘧霉胺的定量分析方法，旨在為龍膽中該藥的殘留量檢測(cè)提供科學(xué)方法，同時(shí)對(duì)龍膽嘧霉胺殘留動(dòng)態(tài)進(jìn)行研究，為嘧霉胺的安全使用提供科學(xué)依據(jù)，為生產(chǎn)符合GAP標(biāo)準(zhǔn)的中藥材奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 儀器

Pipet-one微量加樣移液器（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀及水浴鍋（亞榮生化儀器廠）、離心機(jī)（LDZ4-0.8，北京醫(yī)用離心機(jī)廠制造）、超聲波清洗機(jī)（KH5200E型，昆山禾利超聲儀器有限公司）、電子天平（AE 240，Mettler）、Agilent 1200高效液相色譜儀和色譜工作站（美國(guó)Agilent公司）。

1.2 試劑

98%嘧霉胺標(biāo)準(zhǔn)品（德國(guó)拜耳公司，批號(hào)：80429）；400 g·L-1施加樂（嘧霉胺）懸浮劑（意大利拜耳作物科學(xué)公司）；丙酮、甲醇、正己烷（分析純，北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司）；NaCl（上?；瘜W(xué)試劑公司）；二氯甲烷（上?，F(xiàn)代制藥股份有限公司）；無水硫酸鈉（江蘇省昆山市年沙助劑廠）；石英砂、飽和醋酸鉛（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司）、甲醇（色譜純，菲律賓DIMA 公司），娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 龍膽病害防治和采樣

試驗(yàn)在哈爾濱松北區(qū)萬寶藥材種植基地進(jìn)行。根據(jù)室內(nèi)藥效篩選結(jié)果，選出田間藥劑試驗(yàn)農(nóng)藥嘧霉胺。8月上旬開始對(duì)二年生粗糙龍膽用藥防治龍膽病害，以嘧霉胺800倍液噴霧防治，每隔7-10天施藥一次，共施藥8次，于最后一次（9月24日）用藥后第二天開始采樣，依次經(jīng)過1、3、5、7、14、21天采集樣品。

2.2 農(nóng)藥殘留測(cè)定方法考查

2.2.1 色譜條件

C18ODS Hypersial column色 譜 柱 （125 mm×4.0 mm），流動(dòng)相為甲醇-水溶液（V：V =75: 25）；流速1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，柱溫20 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2.2.2 樣品制備方法考查

方法一：精密稱取20.00 g龍膽樣品，勻漿，加80 mL甲醇，超聲30 min，抽濾，用80 mL甲醇沖洗濾渣數(shù)次，抽干，合并濾液。將濾液在45℃下濃縮至50 mL，加180 mL蒸餾水、20 mL飽和醋酸鉛、45 mL飽和氯化鈉，搖勻，靜置數(shù)分鐘。抽濾漏斗加石英砂抽濾，再用二氯甲烷沖洗濾渣并抽干。取濾液，加100 mL二氯甲烷萃取。取二氯甲烷層，用無水硫酸鈉脫水，濾過，濾液在60℃水浴中減壓濃縮至干，甲醇定容至2 mL，過0.45 μm濾膜備用。

方法二：精密稱取20.00 g龍膽樣品，加乙腈50 mL，勻漿，抽濾。濾液置分液漏斗中，加飽和氯化鈉50 mL進(jìn)行萃取，取乙腈相，用50、25、25 mL二氯甲烷對(duì)水相分3次萃取，合并二氯甲烷和乙腈相加無水硫酸鈉抽濾，45℃下減壓濃縮至干，用2 mL甲醇潤(rùn)洗殘?jiān)⒍ㄈ?，過0.45 μm濾膜備用。

表1 樣品制備方法考察

方法三：精密稱取20.00 g龍膽樣品，勻漿，加丙酮100 mL，超聲10 min，濾過，殘?jiān)?0 mL丙酮，超聲提取10 min，濾過，合并濾液，在不高于40℃條件下減壓濃縮，控制濃縮液體積至30 mL左右。取100 mL 10 %NaCl溶液注入分液漏斗中，再注入上述濃縮液，取100 mL正己烷對(duì)上述回收瓶分次洗滌，將洗液也注入同一分液漏斗中，搖勻5 min，靜置分層，將正己烷層移入300 mL錐形瓶中，水層加50 mL正己烷，搖勻5 min，靜置分層，將正己烷層移入上述錐形瓶中，加10 g無水硫酸鈉，靜置15 min，濾過。用20 mL正己烷洗滌錐形瓶及濾紙上殘留物，重復(fù)兩次，濾過，合并濾液，45℃下減壓濃縮至干，殘留物加1 mL甲醇溶解，定容于1 mL容量瓶中，過0.45 μm濾膜備用。

方法四：將100.00 g龍膽用勻漿機(jī)打碎，置于燒杯中，加150 mL丙酮，超聲10 min，抽濾，取濾紙上的殘?jiān)?5 mL丙酮，超聲10 min，按上述同樣操作合并濾液，用25 mL丙酮分次沖洗燒杯然后沖洗濾渣，40℃下減壓濃縮至約60 mL濃縮液，取100 mL 10 % NaCl溶液移入分液漏斗中，再注入上述濃縮液，取200 mL正己烷對(duì)上述回收瓶分次洗滌，將洗液也注入上述分液漏斗中，搖勻5 min，靜置。把正己烷層轉(zhuǎn)移至300 mL錐形瓶中，用100 mL正己烷對(duì)水層按上述操作再萃取，正己烷層也移入上述錐形瓶中，加入20 g無水硫酸鈉，反復(fù)振蕩數(shù)次，靜置15 min，過濾，濾液置于回收瓶中，取20 mL正己烷洗滌三角瓶及濾紙上的殘留物，重復(fù)操作兩次，兩次濾液合并，移于回收瓶中，40℃下減壓濃縮至干。殘留物加1 mL甲醇溶解并定容于1 mL容量瓶中，溶液用離心機(jī)在2 000 r·min-1離心2 min，過0.45 μm濾膜備用。

根據(jù)4種樣品制備方法（以9月25日樣品為例），見表1。結(jié)果表明，方法三、方法四可檢出嘧霉胺，方法四較方法三嘧霉胺的富集量明顯增大，方法一、方法二在上述色譜條件下均無峰。

2.2.3 流動(dòng)相考查

比較了不同甲醇-水的比例下吸收峰的保留時(shí)間和面積，結(jié)果見表2，表明流動(dòng)相的比例為甲醇：水=60:40為最佳比例。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取1.18 mg的嘧霉胺標(biāo)準(zhǔn)品于1 mL容量瓶中，用甲醇定容配制成1.18 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，從中依次精確吸取500、250、125、62.5 μL定容至1mL容量瓶中，分別配制成1.18、0.59、0.29、0.15、0.07 mg·mL-1。按流動(dòng)相為甲醇-水溶液（V:V =60: 40）；流速1 mL·min-1；柱溫20℃；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；進(jìn)樣量20 μL。分別測(cè)定上述樣品，每份樣品平行3次，并且記錄色譜數(shù)據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 流動(dòng)相比例的考察結(jié)果

以峰面積（Y）對(duì)濃度（X）建立回歸方程Y = 42 564 X + 593.02，（R2= 0.999 9，n=5）。結(jié)果表明嘧霉胺在1.16-0.07 mg·mL-1的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。稀釋嘧霉胺對(duì)照品溶液至記錄到嘧霉胺響應(yīng)的信噪比S/N=3為最低檢測(cè)限。結(jié)果表明，嘧霉胺的最低檢測(cè)限為0.018 mg·mL-1。結(jié)果見圖1，圖2。

2.2.5 精密度試驗(yàn)

取同一樣品溶液20 μL進(jìn)樣，重復(fù)5次，檢測(cè)精密度。結(jié)果顯示，RSD=1.71 %，表明精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取樣品溶液20 μL，每隔2 h進(jìn)樣一次，依次測(cè)定6次，考查其穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，RSD=1.83 %，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取龍膽樣品100 g，共5份，按優(yōu)化的樣品制備方法制備樣品，并進(jìn)行含量測(cè)定，每份重復(fù)5次。結(jié)果顯示，含量平均值為1.21 mg·kg-1，RSD=1.55 %，表明重現(xiàn)性良好。

2.2.8 加樣回收實(shí)驗(yàn)

取同一批龍膽樣品100 g，共3份，分別加入0.126、0.05、0.02 mg標(biāo)準(zhǔn)品后，按優(yōu)化的方法提取測(cè)定（表3）。結(jié)果顯示，3種不同加樣量平均回收率分別為96.2%、95%、99.9%，RSD為1.80%、1.35%、1.22%，表明回收率良好。

2.3 嘧霉胺殘留量測(cè)定及消解動(dòng)態(tài)圖的繪制

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇適宜樣品制備方法及分析方法進(jìn)行測(cè)定，建立消解動(dòng)態(tài)方程。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過方法四，并且在甲醇：水（60:40）條件下進(jìn)行色譜分析，測(cè)出9月25日至10月15日樣品中嘧霉胺的含量，并繪出消解動(dòng)態(tài)圖，建立消解方程。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線洗脫曲線

圖2 龍膽中嘧霉胺的色譜圖注：a. 樣品（tR=9.122），b. 標(biāo)準(zhǔn)品。

結(jié)果見表4和圖3，表明嘧霉胺在用藥后第一天殘留量（C）最高達(dá)到1.456 0 mg·kg-1，在用藥后從第3天開始迅速下降，從第6天開始緩慢下降。經(jīng)Curveexpert 1.3擬合，得消解動(dòng)態(tài)方程 C=1.456 9-0.910 5 exp（59.2146 t-2.7442），相 關(guān)系數(shù)（Coefficient Data）r=0.999 3，標(biāo)準(zhǔn)差（Standard Error）為0.023 9，半衰期為6.65天。

表3 加樣回收實(shí)驗(yàn)

表4 龍膽中嘧霉胺殘留量測(cè)定結(jié)果

圖3 龍膽中嘧霉胺的消解動(dòng)態(tài)

4 討論

龍膽（粗糙龍膽）較東北龍膽長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，植株高，葉茂盛，根系發(fā)達(dá)產(chǎn)量高，是主要栽培種，但病害較重[8]。在龍膽草栽培過程中發(fā)生多種病害，主要有龍膽斑枯病和葉枯病，造成的損失大[9]。使用常用藥劑不能有效控制這些病害[10]。

對(duì)龍膽的斑枯病防治應(yīng)采用綜合防治措施，用化學(xué)藥劑防治仍是最有效的措施[5,11]，常用農(nóng)藥有甲基托布津、代森錳鋅、殺毒礬等。由于使用時(shí)間長(zhǎng)都產(chǎn)生了一定抗藥性。而嘧霉胺是應(yīng)用于龍膽的斑枯病和葉枯病防治新型農(nóng)藥，效果很好。嘧霉胺是近年來開發(fā)的一種結(jié)構(gòu)新穎、有獨(dú)特作用機(jī)制的新型殺菌劑，是農(nóng)業(yè)部推薦的綠色農(nóng)業(yè)優(yōu)先使用的農(nóng)藥。嘧霉胺能被植物葉及根吸收，在農(nóng)業(yè)上對(duì)葡萄、草莓、觀賞植物等的灰霉病有很好的防治效果。中國(guó)對(duì)嘧霉胺在農(nóng)產(chǎn)品中的最高殘留限量尚無標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)內(nèi)外對(duì)嘧霉胺殘留量分析采用液相色譜法[12]、氣相色譜法（NPD檢測(cè)器）[14]及氣（液）質(zhì)聯(lián)用等方法，其中液相色譜法操作簡(jiǎn)便，分離效果好、精密度高是常用方法。

本文首次以高效液相法研究了嘧霉胺在龍膽草中殘留和消解規(guī)律，建立了嘧霉胺在龍膽草中的高效液相檢測(cè)分析方法；對(duì)樣品制備條件、流動(dòng)相組成進(jìn)行了優(yōu)化；研究了龍膽草中嘧霉胺的消解動(dòng)態(tài)，以數(shù)學(xué)模型描述了嘧霉胺的降解規(guī)律。農(nóng)藥殘留分析中樣品處理是最難的，因?yàn)椴煌牧现兴s質(zhì)成分不同、種類多且與農(nóng)藥成分很難分離，針對(duì)特定分析材料篩選出有效農(nóng)藥富集方法及分析方法成為研究的難點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)篩選了龍膽中嘧霉胺的富集方法，表明用丙酮提取，正己烷萃取為最佳方法，相比用二氯甲烷萃取，更安全；方法四較方法三只是增加了處理樣品量，但富集效果卻明顯好，可能是由于農(nóng)藥在藥材中殘留量很少，增加處理樣品量可以減少富集過程中實(shí)驗(yàn)誤差，從色譜峰圖可以看出，雖然雜峰較多，但是嘧霉胺峰與其它峰的分離度大于1.5，流動(dòng)相選擇甲醇：水（60:40）為最佳條件。此方法精密度高、重現(xiàn)性好，回收率高，嘧霉胺的最低檢測(cè)限達(dá)到0.018 mg·mL-1，因此完全可以用來測(cè)定龍膽中嘧霉胺的殘留量。

本研究建立的嘧霉胺消解方程是經(jīng)運(yùn)算優(yōu)選的，其相關(guān)系數(shù)為0.999 3，標(biāo)準(zhǔn)差為0.023 9，說明方程精度高，擬合好，能準(zhǔn)確描述嘧霉胺在龍膽中的消解規(guī)律，也可以根據(jù)用藥后時(shí)間預(yù)測(cè)龍膽中嘧霉胺殘留量，從消解規(guī)律來看，末次噴灑嘧霉胺第1天和第3天后含量沒有明顯減少，但從第3天開始明顯下降，從第15天開始，消解速度又變得非常緩慢，含量下降大約至第1天的1/3。從消解動(dòng)態(tài)來看，嘧霉胺殘留量最終高于美國(guó)環(huán)?？偸鹬贫ǖ南憬吨朽酌拱窔埩粝蘖縈RL（0.1 mg·kg-1），為了減少龍膽藥材中農(nóng)藥殘留，建議通過減少使用次數(shù)與其它農(nóng)藥交替使用。由于栽培龍膽一般是種植3年采收，栽培第1-2年可以多用，第3年少用或不用，距離收獲的安全間隔期要大于15天，這不僅能有效防治斑枯病、葉枯病等，而且能使得嘧霉胺的殘留降到安全限度，提高藥材質(zhì)量和保證用藥安全。本文對(duì)中藥材生產(chǎn)過程的農(nóng)藥殘留規(guī)律進(jìn)行了探討，對(duì)指導(dǎo)中藥材規(guī)范化生產(chǎn)及促進(jìn)中藥現(xiàn)代化具有現(xiàn)實(shí)的意義，也為其它中藥材農(nóng)藥殘留研究提供借鑒。

1 孫立晨,高郁芳,劉志剛,等.防治龍膽草斑枯病藥劑篩選試驗(yàn).植物保護(hù),2006,32(6): 154-156.

2 馮繼承,朱飛. 龍膽草斑枯病的防制研究. 中國(guó)林副特產(chǎn),2010(1): 32-33.

3 徐浩,李振. 嘧霉胺在黃瓜及土壤中的殘留降解動(dòng)態(tài). 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2005,17(6): 380-383.

4 李興紅,喬廣行,黃金寶,等. 北京地區(qū)番茄灰霉病菌對(duì)嘧霉胺的抗藥性檢測(cè)植物保護(hù),2012,38(4): 141-143.

5 孫海峰,曹思思,呂游. 藥劑浸苗及田間用藥防治龍膽斑枯病的研究. 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2010,24(5): 10-12.

6 紀(jì)明山,祁之秋,王英姿,等. 番茄灰霉病菌對(duì)嘧霉胺的抗藥性.植物保護(hù)學(xué)報(bào),2003,30(4): 396-400.

7 潘守奇,朱莉萍,孫軍,等. 氣相色譜法測(cè)定水果和蔬菜中嘧霉胺·氟硅唑·抑霉唑殘留量. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2008,36(17): 7238-7239.

8 王喜軍,孟祥才,左軍,等. 黑龍江省地道中藥材龍膽、防風(fēng)的種植基本情況調(diào)查. 中醫(yī)藥信,2003,20(2): 55-56

9 苗春華,孫華,張衛(wèi)東. 龍膽草斑枯病發(fā)病規(guī)律及防治技術(shù)研究.吉林特產(chǎn)高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào),2004,13(1): 1-3．

10 劉海濤,張本剛,薛健. 中藥龍膽主要病害及防治. 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2006,20(6): 8-12.

11 王喜軍,孫海峰. 人工規(guī)范化種植龍膽斑枯病的無公害防治技術(shù).中國(guó)現(xiàn)代中藥,2009,11(3): 7-9.

12 余向陽(yáng),駱愛蘭. 高效液相色譜法測(cè)定葡萄中嘧霉胺的殘留量. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2004,20(4): 268-270.

13 袁圓,龍友華,吳小毛. 白菜中嘧霉胺和烯酰嗎啉殘留的氣相色譜分析. 山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào),2013,32(6): 492-494.

14 王玉健,黃惠玲,汪春光,等. 荔枝中抑霉唑和嘧霉胺殘留量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定. 分析測(cè)試學(xué)報(bào),2010,29(10): 1068-1072.

Study on Residue Trends of Pesticides Pyrimethanil in Gentian

Mu Jinjiang1,Sun Haifeng2,Zhang Shuainan2
(1.The Second Affiliated Hospital,Harbin Medical University,Harbin 150086 ,China; 2. Pharmaceutical College,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China)

The study aimed to establish asuitable method for analyzing pyrimethanil in gentian,in order toexplore the residue trends of pyrimethanil in gentian and its degradation dynamics. The high performance liquid chromatography (HPLC) method was the first to be performed in this study tolearn the residue trends of pyrimethanil. Prior to sampling gentian at different time intervals,the samples were spreaded by pesticides for eight times at the same timeline. The preparation method and chromatographic conditions were optimized and analyzed. As a result,the HPLC method that detected the residues of pyrimethanil in gentian was established. The content of pyrimethanil in the gentian samples degradated over time,and its resolution equation was C=1.4569-0.9105exp(59.2146t-2.7442) with the half-time of 6.65 days. It was concluded that HPLC method for determining the pyrimethanil residues of gentian was reliable,and the resolution equation accurately described the principle of pyrimethanil degradation in gentian. By reducing the frequency and alternating theutilization of pesticide,prolonging the security intervals of harvesting may reduce the pesticide residues.

Pyrimethanil,HPLC,gentian,pesticide residue

10.11842/wst.2016.05.030

R282.2

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-01-28

修回日期：2016-02-13

＊ 科學(xué)技術(shù)部國(guó)家“十一五”支撐計(jì)劃項(xiàng)目子課題（2006BAI09B04-10）: 種子貯存、栽培生產(chǎn)、商品流通等環(huán)節(jié)的病蟲害防治技術(shù)研究-龍膽的關(guān)鍵病害防治技術(shù)研究，負(fù)責(zé)人：孫海峰。

＊＊ 通訊作者：孫海峰，博士，教授，主要研究方向：中藥資源與開發(fā)研究。