通塞脈片4種入血成分的含量測定＊

胡玉梅，楊 彪，房 卉，畢 森，孟兆青，黃文哲，王振中，蕭 偉＊＊

（1. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 連云港 222001；2. 中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室 連云港 222001）

通塞脈片4種入血成分的含量測定＊

胡玉梅1，2，楊 彪1，2，房 卉1，2，畢 森1，2，孟兆青1，2，黃文哲1，2，王振中1，2，蕭 偉1，2＊＊

（1. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 連云港 222001；2. 中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室 連云港 222001）

目的：目的：建立同時測定通塞脈片中綠原酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、哈巴俄苷4種入血成分的HPLC分析方法，為進一步控制通塞脈片的質(zhì)量提供參考。方法：采用HPLC-Q-TOF分析大鼠口服通塞脈片后的血中移行成分；結(jié)合HPLC測定通塞脈片中主要入血成分的含量。結(jié)果：在大鼠含藥血漿中，綠原酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和甘草苷均以原型入血，哈巴俄苷脫去葡萄糖以苷元入血，以綠原酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷和哈巴俄4種成分為指標(biāo)，建立的含量測定方法線性范圍良好，平均加樣回收率分別為100.9%、98.68%、98.88%、99.25%。結(jié)論：建立的含量測定方法簡便可行，回收率和重復(fù)性良好，可為進一步控制通塞脈片質(zhì)量提供參考。

通塞脈片 綠原酸 毛蕊異黃酮葡萄糖苷 哈巴俄苷 甘草苷 含量測定

通塞脈片為江蘇康緣陽光藥業(yè)有限公司的獨家品種，由金銀花、當(dāng)歸、黃芪、黨參、牛膝、石斛、玄參、甘草等8味中藥組成，具有培補氣血，養(yǎng)陰清熱，活血化瘀，通經(jīng)活絡(luò)的功效，用于血栓閉塞型脈管炎（脫疽）的毒熱癥的治療，功效顯著[1-4]。通塞脈片現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)為國家藥品監(jiān)督管理局頒布的通塞脈片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（試行）（YBZ08372004），其含量測定項只對金銀花中的綠原酸進行了質(zhì)量控制?，F(xiàn)有文獻(xiàn)僅對該制劑中黃芪甲苷[5，6]、阿魏酸[7]、甘草酸[6]進行了定量研究，未見同時測定多個成分的文獻(xiàn)報道。目前，一般認(rèn)為只有能被吸收入血的成分才有可能是中藥及復(fù)方的體內(nèi)直接作用物質(zhì)[8，9]。但是，迄今為止未見對通塞脈片入血成分進行研究的文獻(xiàn)。因此，本實驗對通塞脈片的入血成分進行了充分研究，從而確定其質(zhì)量控制指標(biāo)，包括綠原酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷以及哈巴俄苷，并建立了同時測定這4種成分的HPLC含量測定方法，為通塞脈片質(zhì)量控制指標(biāo)的選擇提供了一定的科學(xué)依據(jù)，并在此基礎(chǔ)上提高了通塞脈片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)水平，為保證藥品質(zhì)量的穩(wěn)定、均一和可控奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器、試藥與動物

1.1 儀器

Aglient 1100 高效液相色譜儀，配備二元泵、DAD 檢測器及配套色譜工作站（美國 Aglient公司）；Aglient 1290 安捷倫液質(zhì)聯(lián)用儀，配備DAD 檢測器、Q-TOF 6538 質(zhì)譜儀及配套色譜工作站（美國Aglient公司）；KQ-500型超聲波清洗器（昆山市超聲儀儀器有限公司）；AE240 十萬分之一電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；XW-80A 微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；Centrifuge 5424高速離心機（德國艾本德公司）；EYELA MG-2200 型氮氣吹干儀（日本東京理化器械株式會社）。

1.2 試藥與動物

綠原酸、甘草苷、哈巴俄苷對照品均購于中國食品藥品檢定研究院（批號分別為110753-201415、111610-201106、111730-201307），毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品購于成都普菲德生物技術(shù)有限公司（批號：140326）。通塞脈片（康緣陽光藥業(yè)有限公司，批號分別為130613、130807、130808、131020、131111）。甲醇、磷酸（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司）；甲酸（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；羧甲基纖維素鈉（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（色譜純，美國天地公司），超純水（Milli-Q 制備）。

SD 雄性大鼠，SPF 級，體質(zhì)量180-220 g，購于上海杰思捷實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2013-0006。

2 方法與結(jié)果

2.1 入血成分確認(rèn)

2.1.1 給藥及血漿樣品處理方法

SD 大鼠（雌雄各4只），按雌雄隨機分成2組，給藥組按 6.6 g·kg-1劑量灌胃給藥通塞脈片灌胃液，給藥3天，每天2次；空白組灌胃等體積的蒸餾水，于最后一次給藥（灌胃前禁食12 h）后15、30、60、120、180、240 min 采取大鼠眼內(nèi)眥靜脈叢血，肝素鈉抗凝，將血樣合并,4 000 r·min-1離心10 min，取上清液血漿1 mL加入4 mL甲醇渦旋30 s，12 000 r·min-1離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液，40 ℃氮氣吹干，殘渣加入100 μL 80%甲醇溶解，12 000 r·min-1離心5 min，取上清液待測?？瞻籽獫{處理方法同給藥血漿。

2.1.2 灌胃液的制備

取通塞脈片（批號：131020）適量，研細(xì)，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成1 mL含制劑0.66 g的混懸液。

2.1.3 LC-MS分析條件

Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.1% 甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0 -10 min，5% B；15 min，8% B ；25-32 min，14% B；35-45 min，15% B；75 min，32% B；90 min，60% B；95 min，60% B；105 min，100% B，后運行10 min；柱溫30 ℃；流速1.0 mL.min-1，進樣量2 μL。

電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式檢測；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流量：10 L·min-1；霧化氣壓力：10.0 psi；毛細(xì)管電壓：（-）4 500 V；Fragmentor：135 V，skimmer：65 V；掃描范圍：m/z 100-1 500 amu。

2.1.4 入血成分鑒定

將空白血樣、給藥血樣按照 “2.1.3 ”項下條件進行測定，結(jié)果見圖 1-2，根據(jù)對照品對照確定tR=22.775 色譜峰為綠原酸、tR=34.152 色譜峰為毛蕊異黃酮葡萄糖苷、tR=37.672 色譜峰為甘草苷，3個化合物均以原型成分的形式吸收入血，推測哈巴俄苷脫去葡萄糖以苷元（tR=73.754）吸收入血。

2.2 入血相關(guān)成分的含量測定

2.2.1 對照品溶液的配制

精密稱取干燥至恒重的綠原酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、哈巴俄苷對照品各10.49、3.25、12.02和4.05 mg置20 mL具塞三角瓶中，加入80%甲醇溶液少許，超聲溶解，放冷后，用甲醇溶液定容至刻度，搖勻，得混合對照品貯備液，再精密移取1 mL貯備液置25 mL量瓶中，80%甲醇溶液定容至刻度，即得混合對照品溶液。

2.2.2 供試品的制備

取通塞脈片20片，除去薄膜衣，精密稱取0.7 g，精密稱定，置25 mL 量瓶中，加入80% 甲醇適量，超聲1 h（工作頻率40 kHz，功率500 W），放至室溫，定容，搖勻，離心5 min（12 000 r·min-1），取上清液，即得。

2.2.3 液相色譜條件

Agilent Extend C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.2% 磷酸溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫：0-10 min，5% B；15 min,8% B ；25-32 min，14% B；35-45 min，15% B；75 min，32% B； 90 min ，60% B；95 min，60% B；100 min，100% B，后運行10 min；柱溫為30 ℃；檢測波長為327 nm（檢測綠原酸）、260 nm（檢測毛蕊異黃酮葡萄糖苷）、276 nm（檢測哈巴俄苷）、237 nm（檢測甘草苷）[10-13]；柱溫30 ℃；流速1.0 mL·min-1，進樣量10 μL。

2.2.4 專屬性試驗

按處方比例制備不含金銀花、黃芪、玄參、甘草的陰性制劑樣品，按“2.2.2”項下的方法分別制備制劑供試品溶液和陰性制劑溶液，按“2.2.3”項下條件測定，得HPLC色譜圖。結(jié)果表明，陰性制劑對所測成分無干擾，4個成分峰的理論塔板數(shù)不低于6 000，與相鄰峰的分離度均大于1.5，見圖3。

圖1 空白血樣（A）和給藥血樣（B）的總離子流圖

圖2 4個入血相關(guān)成分質(zhì)譜圖

續(xù)圖2 4個入血相關(guān)成分質(zhì)譜圖

圖3 混合對照品（A）、陰性制劑（B）及通塞脈片（批號：130613）（C）的HPLC色譜圖（260 nm）

2.2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對照品貯備溶液分別稀釋5、10、12.5、25、50倍，得到一系列不同濃度的混合對照品溶液，分別吸取上述不同濃度的對照品溶液各10 μL，按“2.2.3”項下色譜條件測定，以峰面積（Y）與對照品進樣量（μg）進行回歸。結(jié)果表明，4個成分線性關(guān)系良好（r＞0.999 5），回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)見表 1。

2.2.6 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液連續(xù)進樣5次，記錄峰面積并計算5 次峰面積的RSD。結(jié)果顯示，綠原酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、哈巴俄苷的峰面積的RSD分別為0.25%、0.35%、0.30%、0.28%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗

取通塞脈片（批號：130613），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h進樣10 μL測定各成分的峰面積。結(jié)果顯示，綠原酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、哈巴俄苷的峰面積RSD分別為1.5%、2.7%、2.1%、1.9%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗

取通塞脈片（批號：130613），平行6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品10 μL進樣，記錄峰面積，計算含量。結(jié)果顯示，綠原酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、哈巴俄苷含量的RSD分別為2.0%、1.6%、1.3%、1.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的通塞脈片（批號130613），共9份，精密加入混合對照品貯備液1.2、1.2、1.2、1.0、1.0、1.0、0.8、0.8、0.8 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣10 μL，記錄峰面積，計算回收率。結(jié)果顯示，綠原酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、哈巴俄苷的平均回收率分別為100.9%、98.68%、98.88%、99.25%，RSD分 別 為 1.1%、2.5%、2.0%、1.8% 。

2.2.10 含量測定

分別取5批通塞脈片，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，每批平行3份，每份進樣2次，按“2.3.3”項下的色譜條件對綠原酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、哈巴俄苷進行含量測定，結(jié)果見表2。

3 結(jié)論

3.1 大鼠給藥方式的選擇

比較單次給藥與多次給藥（連續(xù)給藥3天，每日2次）的血中移行成分，LC-MS分析結(jié)果表明，多次給藥后樣品出峰穩(wěn)定，且峰的數(shù)目較多，故采用多次給藥。

3.2 供試品提取方法的考察

分別采用回流法和超聲2種提取方式進行提取，結(jié)果2種方法的提取率基本一致，由于超聲波法簡單省時，故本實驗采用超聲波法；同時考察了溶媒和超聲時間以及超聲次數(shù)的影響，選用100%甲醇、80% 甲醇、50% 甲醇、蒸餾水4個溶劑進行提取，在0.5、1、1.5 h分別提取1次、2次。結(jié)果顯示：80% 甲醇提取1次超聲1 h 時，4個組分即可完全溶出。

3.3 含測指標(biāo)的選擇

中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制方法通常以其中所含的某一類成分來定量，或者選擇其中1-2個指標(biāo)成分來定量，近年來也有采用指紋圖譜來控制產(chǎn)品的真實性、藥材質(zhì)量的一致性及穩(wěn)定性[9]。本實驗以入血成分為參考，建立HPLC 多波長同時測定通塞脈片中4個入血相關(guān)成分綠原酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、哈巴俄苷的含量，4個化合物分別是其組成藥材金銀花、黃芪、甘草和玄參的主要活性成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，綠原酸通過清除氧自由基及抗脂質(zhì)過氧化，可保護血管內(nèi)皮細(xì)胞，進而對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生有效的保護作用[14]；毛蕊異黃酮葡萄糖苷具有免疫調(diào)節(jié)、抗損傷、抑制動脈粥樣硬化等活性[15]；甘草苷對大鼠動脈粥樣硬化具有治療作用，其作用機制可能是通過抑制炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)[16]，同時甘草苷可通過降低髓過氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）活性及細(xì)胞間黏附因子-1（Intercellular Adhesion Molecule-1，ICAM-1）表達(dá)減輕腦缺血再灌注后炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮其抗腦缺血再灌注損傷作用[17]；哈巴俄苷具有抗慢性炎癥、降壓、鎮(zhèn)痛及免疫促進作用[18]。該HPLC含量測定方法重復(fù)性好，準(zhǔn)確簡便，可以更有效地控制通塞脈片制劑的質(zhì)量，同時也為中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制提供新的研究方法。

3.4 后續(xù)研究思路

后續(xù)研究將進一步對入血成分進行藥理活性驗證，明確入血成分與藥效的相關(guān)性，為功效相關(guān)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定基礎(chǔ)。

表1 4種對照品的回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)

表2 通塞脈片中4中成分含量測定（n=3）

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Study on the Quality Standard of Tongsaimai Tablet by Determining Four Representative Components Absorbed into Blood

Hu Yumei1,2,Yang Biao1,2,Fang Hui1,2,Bi Sen1,2,Meng Zhaoqing1,2,Huang Wenzhe1,2,
Wang Zhenzhong1,2,Xiao Wei1,2(1. Jiangsu Kanion Parmaceutical Co.,Ltd.,Lianyungang 222001,China; 2. State Key Laboratory of New-Tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process,Lianyungang 222001,China)

This study aimed to establish the HPLC analysis method for determining four representative components,chlorogenic acid,calycisin glyciside,liquiritin and harpagoside,simultaneously,which provided references for the quality control study of the Tongsaimai （TSM） tablet. HPLC-Q-TOF technique was applied to determine the components in the blood after the administration of TSM table extract. In this process,HPLC was used for detection of the ingredients' content of the blood sample. It was found that chlorogenic acid,calycisin glycoside and liquiritin migrated into the blood as prototype forms,while harpagoside into the blood by the form of aglycone. The linear range of the four compounds was favorable,and the average recoveries were 100.9%,98.68%,98.88% and 99.25%,respectively. It was concluded that the HPLC technique was simple and feasible with good reproducibility,which could be used for quality control of TSM tablet.

Tongsaimai tablet,chlorogenic acid,calycosin-7-O-β-D-glycoside,liquiritin， harpagoside,quantitative determination

10.11842/wst.2016.05.029

R285

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2015-07-02

修回日期：2015-12-18

＊ 科學(xué)技術(shù)部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2013ZX09402203）：現(xiàn)代中藥創(chuàng)新集群與數(shù)字制藥技術(shù)平臺，負(fù)責(zé)人：王振中。

＊＊ 通訊作者：蕭 偉，本刊編委，研究員級高級工程師，博士，主要研究方向：中藥新藥的研究與開發(fā)。