海蝦致死試驗篩選天然活性成分的研究進(jìn)展＊

郭晶晶，張 屏，李瑞娟，趙紅梅，岳 鑫，包保全＊

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 呼和浩特 010059）

海蝦致死試驗篩選天然活性成分的研究進(jìn)展＊

郭晶晶＊＊，張 屏＊＊，李瑞娟，趙紅梅，岳 鑫，包保全＊＊＊

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 呼和浩特 010059）

海蝦致死試驗是近年快速發(fā)展起來的一種天然活性成分篩選方法，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞毒、抗癌和殺病原蟲等藥理活性的篩選，也是毒性評估的重要工具之一。該方法利用簡單的生物有機(jī)體——豐年蝦（Brine Shrimp，Artemia sp.）的幼蟲，體外給予不同濃度的待測樣品，培養(yǎng)一定時間后測定海蝦幼蟲的存活數(shù)，計算出LD50值作為活性評價指標(biāo)。該方法應(yīng)用整體動物進(jìn)行體外實驗，具有操作簡單、快速、經(jīng)濟(jì)、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好等優(yōu)點。樣品用量在20 mg以下，適用于天然提取物的活性篩選和活性追蹤分離。

海蝦致死性試驗 細(xì)胞毒 抗癌 殺錐蟲

活性成分篩選是指對可能作為藥用的物質(zhì)進(jìn)行初步的藥理活性檢測和試驗，以發(fā)現(xiàn)其藥用價值和臨床用途為目的，為開發(fā)新藥提供最初始的依據(jù)和資料。藥物篩選可在整體動物水平、組織器官水平、細(xì)胞和分子水平進(jìn)行，要求盡可能高效準(zhǔn)確。海蝦致死試驗（Brine Shrimp Lethality Test，BSLT）是一種測定殺死實驗室培養(yǎng)的豐年蝦（Artemia sp.）幼蟲能力的試管實驗，由Michael AS等在1956年提出，后來由Vanhaecke P（1981年），Sleet RB 和 Brendel K（1983年）等人開發(fā)，最初用于測定真菌毒素、藻類毒素、植物毒素、重金屬、殺蟲劑和牙科材料的毒性，是初步評估毒性的有效手段[1]。近20年來，該方法在天然物活性成分篩選方向得到了快速發(fā)展和應(yīng)用，所涉及的生物活性包括細(xì)胞毒、抗癌和殺原蟲等。本文概述了海蝦致死試驗的原理、實驗方法和注意事項，對其在天然活性成分篩選中的應(yīng)用做了初步分類和統(tǒng)計，總結(jié)了該法的特點和優(yōu)勢，為從事天然活性成分篩選和活性成分追蹤分離的科研工作者提供參考。

1 海蝦致死試驗方法與注意事項

1.1 海蝦致死試驗的原理

海蝦致死試驗是利用海蝦幼蟲（Brine shrimp nauplii）對有毒物質(zhì)敏感而進(jìn)行的藥理毒性試驗。試驗中采用豐年蝦（Artemia sp.）的休眠卵，在一定濃度的鹽水中脫水而啟動生命周期，孵化出海蝦幼蟲。海蝦幼蟲以濾食海水中的有機(jī)物為生，對有毒物質(zhì)敏感，食入具有細(xì)胞毒、抗癌、抗菌、殺蟲等活性的物質(zhì)均可致其死亡。因此，可以通過計算半數(shù)致死劑量LD50值，來估計待測物的毒性[2]，LD50＞ 1 000 μg·mL-1無毒，500＜LC50＜1 000低毒，LC50＜500有毒。

1.2 儀器、試劑與材料

海蝦卵（Artemia sp.）：各廠牌海蝦卵都是在自然界中直接采集而得的，由于各產(chǎn)地的品種并不一樣，因此在孵化率及孵化時間上會有差異存在。中國品種為豐年蝦（Artenmia sinica），孵化時間大約17 h。

人工海水：實驗中為了保證均一性，所用海水均為人工配制而成，方法為海鹽或NaCl溶于去離子水中，濃度一般控制在35 g·L-1。

待測樣品：本實驗中待測物通常為粗提物或經(jīng)過初步分離的組分，通常配制成10、100和1 000 μg·mL-1三個濃度，溶解或混懸分散于人工海水中。

海蝦孵化器：多為實驗室自制，選一左右結(jié)構(gòu)的不透明容器，在兩室的中間擋板底部打一排小孔（直徑1-2 mm），一室上加不透明蓋作為孵化室，另一室暴露于光照中作為收集室。

此外，還需要恒溫水浴鍋、臺燈、10 mL玻璃試管等。

1.3 實驗方法

海蝦幼蟲卵的孵化：將裝有人工海水的海蝦孵化器放入恒溫水浴鍋中，在25-29 ℃穩(wěn)定溫度下孵化。在孵化室中加入豐年蝦休眠卵，孵化室加蓋，同時打開臺燈照射收集室。由于趨光性，孵化出的健康海蝦幼蟲自孵化器底部的小孔游出。收集海蝦幼蟲，禁食培養(yǎng)24 h后，選取游動性好的幼蟲進(jìn)行試驗。

分組與給藥：試驗分為4組，空白和待測樣品（濃度分別為10、100、1 000 μg·mL-1），每組設(shè)3個平行樣，在10 mL試管中進(jìn)行，每管加入5 mL待測樣品溶液，空白加入5 mL人工海水。用吸管將海蝦幼蟲轉(zhuǎn)移到試管中，每管10只，在光照和恒溫水浴條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

測定與結(jié)果處理：將試管中的人工海水連同海蝦倒入培養(yǎng)皿，在光照下準(zhǔn)確數(shù)出每管中死亡幼蟲（無運動）的只數(shù)，計算百分死亡率。采用加權(quán)概率單位法（Bliss法），用Finney computer程序在計算機(jī)上運算，得出半數(shù)致死劑量LD50和95%的置信區(qū)間。

1.4 注意事項

空白組海蝦幼蟲的死亡：試驗中出現(xiàn)空白組幼蟲死亡現(xiàn)象，應(yīng)注意幼蟲開始孵化到試驗結(jié)束不得超過72 h，否則會因饑餓致死；人工海水應(yīng)用去離子水配制，蒸餾水含氧量少導(dǎo)致幼蟲死亡；配制人工海水的海鹽應(yīng)選擇正規(guī)廠家產(chǎn)品，如Sigma Sea Salt，因為中國近海域海鹽因受污染而有幼蟲致死活性；保證溫度控制在25 °C以上，過低導(dǎo)致死亡。

高濃度樣品不溶：海蝦是濾食動物，對大小5-16 μm的顆粒有較高的攝食率。一些海水中溶解度不好的待測物，可以先加入DMSO溶解，再配成人工海水的混懸液，DMSO用量不得超過1%，并以相同濃度DMSO的人工海水作空白對照。

2 海蝦致死試驗在天然活性成分篩選中的應(yīng)用

海蝦致死試驗建立在海蝦對有毒物質(zhì)敏感的基礎(chǔ)之上，最初用于檢測殺蟲劑的殘留物、霉菌毒素等有毒物質(zhì)。1982年，美國普渡大學(xué)藥學(xué)院Mclaughlin JL教授[3]研究發(fā)現(xiàn)，天然產(chǎn)物的海蝦致死率與對癌細(xì)胞的抑制率之間具有正相關(guān)性，可用于抗癌活性初步測定。之后，該試驗方法逐漸發(fā)展成為一種常用的細(xì)胞毒性、抗癌及殺病原蟲活性篩選方法，應(yīng)用天然產(chǎn)物活性篩選和活性追蹤分離研究。該方法在國內(nèi)的應(yīng)用始于1994年，閻寶琦等[2]首次報道了該法在地衣提取物抗癌活性篩選研究中的應(yīng)用。迄今為止，國內(nèi)已有64篇研究論文報道，大部分集中于近五年發(fā)表，主要應(yīng)用于細(xì)胞毒性[4-17]、抗癌[18-23]活性篩選方法（表1）。

表1 國內(nèi)海蝦致死試驗在天然活性成分研究中的應(yīng)用報道情況

2.1 海蝦致死試驗用于細(xì)胞毒活性篩選

海蝦致死試驗建立之初主要用于檢測食物或醫(yī)療用品的毒性，如重金屬、殺蟲劑殘留物和牙科材料的毒性檢查等。后來，隨著人們對細(xì)胞毒活性認(rèn)識的加深，逐步開始對一些有毒物質(zhì)，如真菌毒素、藻類毒素、低等海洋動物毒素以及植物毒素等進(jìn)行提取、分離和純化，以期發(fā)現(xiàn)具有抗癌、抗菌、殺病原蟲等活性的藥物。在此過程中，海蝦致死試驗已逐步發(fā)展成為一種成熟的細(xì)胞毒活性篩選和活性追蹤分離方法。2012年，印度學(xué)者Patel S等[24]采用海蝦致死試驗對爵床屬植物Justicia gendarussa進(jìn)行活性追蹤分離，發(fā)現(xiàn)其葉和根的甲醇提取物顯示有很強的細(xì)胞毒活性LD50 分別為48.71 μg·mL-1和93.25 μg·mL-1，進(jìn)一步分離并從中得到兩個純品化合物，細(xì)胞毒活性LD50 分別為8.13 μg·mL-1和15.41 μg·mL-1，可作為合成抗癌藥物的先導(dǎo)化合物。2008年，中國海洋大學(xué)劉培培等[25]為從極端環(huán)境微生物中獲得抗腫瘤藥物的先導(dǎo)化合物，采集內(nèi)蒙古鹽湖沉積物并從中分離了96株耐鹽真菌，通過海蝦生物致死活性法篩選，獲得了1株具有較強活性的耐鹽真菌Aspergillus variecolor B-17，采用活性追蹤分離方法，從該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物的石油醚層提取物中分離得到了3個具有細(xì)胞毒活性的單體化合物。2009年，Shagufta H等[26]人為從植物共生菌中尋找具有抗菌、抗癌的藥物，從不同農(nóng)作物的種子中分離得到8株鐮刀菌（Fusarium solani），對其培養(yǎng)液進(jìn)行海蝦致死試驗，從中分離得到5株較高毒性的菌株，從中分離得到的化合物可開發(fā)為毒性化合物使用。

2.2 海蝦致死試驗用于抗癌活性篩選

1982年，Mclaughlin JL教授試驗證明，海蝦致死率與人鼻咽癌細(xì)胞（9KB）的抑制率之間呈正相關(guān)性，推薦海蝦致死試驗作為一種試驗室常規(guī)的抗癌活性篩選工具使用[3]。1991年，美國國立腫瘤研究所的Suffness MA博士采用已知的抗腫瘤藥物（體內(nèi)抗P388腫瘤），用雙盲法對不同的抗癌活性篩選法的準(zhǔn)確度進(jìn)行比較，包括土豆碟法、海蝦致死法和3種人體實體瘤（肺癌A-549，乳腺癌MCF-7，結(jié)腸癌HT-29）細(xì)胞毒性法，結(jié)果證明海蝦致死試驗比3種人體實體瘤細(xì)胞毒性法更準(zhǔn)確[19]。由此，海蝦致死試驗被廣泛地應(yīng)用于合成藥物、微生物、低等生物、海洋低等動物及高等植物抗癌活性篩選和活性追蹤分離研究。朱天嬌等[20]采用海蝦致死試驗對259株極地微生物進(jìn)行了抗腫瘤活性篩選，從中選出具有顯著抗腫瘤活性的細(xì)菌20株、真菌3株和放線菌6株，活性篩出率達(dá)到11%，顯示出極地微生物在活性物質(zhì)研究方面具有良好的應(yīng)用潛力。方玉春等[21]對青島沿海海洋附著生物資源進(jìn)行調(diào)查，采用海蝦細(xì)胞毒性法對已鑒定的18種附著生物進(jìn)行抗腫瘤活性篩選，從中發(fā)現(xiàn)了5種具有抗腫瘤活性的附著生物，包括美洲海鞘、大菊海鞘、山形海綿紅藻、海黍子及山形海綿，并對其活性部位追蹤分離，為進(jìn)一步尋找抗腫瘤活性先導(dǎo)化合物進(jìn)行了初步探索。陳學(xué)敏等[22]設(shè)計出一種合成噢嚌的簡便方法并合成了4種不同的化合物，當(dāng)對產(chǎn)物進(jìn)行海蝦幼蟲致死性生物測定時發(fā)現(xiàn)6-羥基噢嚌有很強的抗癌活性。付明海等[23]對內(nèi)蒙古阿拉善地區(qū)芹葉鐵線蓮提取分離出來的24個樣品作了抗癌活性的初步篩選，得到了具有抗腫瘤活性的有效部位。

2.3 海蝦致死試驗用于殺原蟲活性篩選

錐蟲病是一種流行于熱帶地區(qū)的疾病，幾乎沒有適當(dāng)?shù)乃幬锟梢杂糜谥委熢摷膊。瑥亩觿×隋F蟲耐藥性的發(fā)展。2001年，Olila D等[27]采用海蝦致死試驗追蹤分離法對烏干達(dá)藥用植物Warburgia ugandensis進(jìn)行化學(xué)成分研究，從中分離得到了一個倍半萜類化合物Muzigadial，具有很好的抗錐蟲耐藥株IL 3338和IL1180的活性，可作為殺錐蟲先導(dǎo)藥物開發(fā)，同時提出海蝦致死試驗很可能成為一種有效的殺錐蟲活性篩選法。

3 海蝦致死試驗特點和優(yōu)勢

海蝦致死性試驗作為一種活性篩選和活性追蹤分離方法，廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物活性研究，旨在從中篩選結(jié)構(gòu)新穎且具有生物活性的新藥和先導(dǎo)化合物。該方法已成為現(xiàn)如今科學(xué)家們最信賴的試驗方法之一，具有的諸多特點和優(yōu)勢。

首先，海蝦幼蟲卵孵化及獲得條件的簡便快速，海蝦幼蟲卵在干燥狀態(tài)下可存活數(shù)年，用時在室溫將其置于海水中數(shù)小時內(nèi)即可孵化成許多幼蟲,這樣供藥物篩選的動物材料來源簡便快捷，無需無菌操作，成本極低，且其樣品消耗量在20 mg以下?？梢娫摲椒ㄊ且环N快捷、方便、可以在化學(xué)實驗室進(jìn)行的方法，適用于天然產(chǎn)物活性篩選和活性追蹤分離。

其次，海蝦致死試驗較容易地應(yīng)用了較多數(shù)目的生物個體，便于進(jìn)行大量生物學(xué)統(tǒng)計，所得結(jié)果受動物個體差異影響較小。本實驗無需無菌操作，試驗條件極易控制，其結(jié)果海蝦死亡率可準(zhǔn)確統(tǒng)計。以上特點保證了該方法的準(zhǔn)確性，是其在微觀尺度上分析細(xì)胞毒性的突出優(yōu)點[28]。

最后，海蝦致死試驗不僅可以對多種不同生物活性進(jìn)行有效的、低成本的篩選，是一種快速的廣譜的活性篩選方法,而且其研究對象范圍極廣，可用于微生物、低等生物、海洋低等動物，也可以用于指導(dǎo)高等植物活性成分的篩選和分離、檢測。

4 結(jié)論與展望

海蝦致死試驗活性篩選和活性追蹤分離方法的建立和發(fā)展，是近20年來天然活性成分研究中的一個重要內(nèi)容。它建立在海蝦幼蟲對有毒物質(zhì)敏感的基礎(chǔ)之上，測試有毒物質(zhì)對海蝦的致死能力，與細(xì)胞毒性呈正相關(guān)性，并具有廣譜細(xì)胞毒的特點，可用于細(xì)胞毒、抗癌、殺原蟲等活性的初篩和活性追蹤分離。該方法具有操作簡單、快速、經(jīng)濟(jì)、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好和樣品用量少等優(yōu)點，適合在化學(xué)實驗室推廣應(yīng)用。

海蝦致死性試驗也存在一些不足之處。第一，以致死率為單一判斷指標(biāo)，試驗過程中海蝦幼蟲游動性減少且尚未死亡的現(xiàn)象無法列入統(tǒng)計計算死亡率；第二，所需樣品量在20 mg范圍內(nèi)，遠(yuǎn)超體外細(xì)胞實驗，因此在天然產(chǎn)物研究中主要用于粗組分的活性測定和活性追蹤分離；第三，不能用于抗腫瘤機(jī)理研究。近年來，出現(xiàn)了一些海蝦致死試驗與其它生物模型聯(lián)用方法，如海蝦致死試驗與流式細(xì)胞術(shù)的分級組合篩選[29],多種活性模型（抗菌、海蝦致死、細(xì)胞毒、抗癌）組合篩選[30，31]，生物活性與HPLC-PAD化學(xué)組合篩選[31]等，組合篩選模式與單獨篩選模式相比，無漏篩，具有成本低、速度快、易于大規(guī)模篩選等優(yōu)勢。隨著活性篩選和分離技術(shù)的不斷提高，人們必將從天然產(chǎn)物這個巨大的資源庫中尋找到更多結(jié)構(gòu)新穎、療效顯著的藥物和先導(dǎo)化合物。

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Research Progress on Natural Active Ingredients by the Screening Method of Brine Shrimp Lethality Test

Guo Jingjing,Zhang Ping,Li Ruijuan,Zhao Hongmei,Yue Xin,Bao Baoquan
(College of Pharmacy,Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010059,China)

The brine shrimp lethality test (BSLT),a kind of activity screening method,that rapidly developed in recent years is widely used for screening cytotoxicity,anticancer and protozoacide natural products,as well as a major assessment of preliminary toxicities. BSLT is operated using a primitive organism nauplii of brine shrimp (Artemia sp.) which is administered by unknown samples with various concentrations. The survivals are counted and the bioactivity index LD50 is calculated after a specified period of the cultivation in vitro. BSLT is performed on intact animals with the advantages of simple steps,short period,low cost,accurate output,as well as good repeatability. Moreover,the test normally needs only a dosage of analytes less than 20 mg,which is suitable for screening and separation of bioactive natural ingredients in pharmaceutical research work.

Brine shrimp lethality test,cytotoxicity,anticancer bioactivity,protozoacide bioactivity

10.11842/wst.2016.05.027

R284

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-01-30

修回日期：2016-03-13

＊ 國家自然科學(xué)基金委地區(qū)項目（81160551）：破痞去滯蒙藥特穆日-敖日陽古抗腫瘤活性成分及其構(gòu)效關(guān)系研究，負(fù)責(zé)人：包保全；內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)2015中青年人才團(tuán)隊項目（NYTD-2015004）：蒙藥新藥創(chuàng)制產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新人才團(tuán)隊，負(fù)責(zé)人：包保全。

＊＊ 郭晶晶與張屏為共同第一作者。

＊＊＊ 通訊作者：包保全，博士，教授，主要研究方向：蒙藥活性物質(zhì)基礎(chǔ)及資源研究。