通脈丸有效組分配伍濃縮液在大鼠體內的毒代動力學研究＊

陳天朝，劉瑞霞，于蘭蘭

（1. 河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 鄭州 450000；2. 河南中醫(yī)學院藥學院 鄭州 450008）

通脈丸有效組分配伍濃縮液在大鼠體內的毒代動力學研究＊

陳天朝1＊＊，劉瑞霞2，于蘭蘭2

（1. 河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 鄭州 450000；2. 河南中醫(yī)學院藥學院 鄭州 450008）

目的：本研究通過通脈丸方中各味中藥有效組分提取液的不同配伍，研究其內部的減毒機制，為其安全性評價提供依據。方法：分別灌胃給予大鼠8組通脈丸有效組分不同配伍濃縮液，采用UPLC檢測給藥后不同時間點大鼠體內士的寧的血藥濃度，應用SPSS軟件擬合毒代動力學參數。結果：士的寧在大鼠體內符合非房室模型，第1-8組毒代動力學參數AUC（0-t）分別為10.271 9±3.224 7、8.806 1±1.245 8、13.496 6±4.582 5、11.031 5±2.873 2、9.929 1±1.499 7、5.042 0±2.171 2、15.136 2±6.353 3、5.751 5±1.492 8 μg·h·mL-1。通脈丸原方與其余配伍方在大鼠體內產生的毒性不同，AUC減少率大小順序為第6組＞第8組＞第2組＞第5組＞第1組＞第4組＞第3組＞第7組，“丹參、赤芍、琥珀、蜂蜜”減毒作用最強。結論：UPLC分析方法適用于大鼠血漿士的寧的測定。

配伍減毒 士的寧 毒代動力學 藥動學參數

通脈丸是由附子、黃芪、兩頭尖、制馬錢子、當歸、赤芍、甘草等中藥組成的純中藥制劑，已有30余年的使用歷史[1]。具有祛風濕、通經絡、消腫痛之功效，用于治療血栓閉塞性脈管炎、動脈硬化閉塞癥、風寒濕痹、四肢驚攣等肢體缺血性疾病，臨床療效顯著[2]。

通脈丸方中毒性藥材如馬錢子是影響通脈丸安全有效的關鍵，馬錢子的主要成分為生物堿，其中士的寧占總生物堿的35%-50%，其次為馬錢子堿。馬錢子堿是其鎮(zhèn)痛的主要成分，士的寧是其主要毒性成分[3]。目前的研究顯示，小鼠灌服給藥，士的寧的LD50是馬錢子堿的1/71.25，對中樞神經系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)及腎臟有毒性作用，因士的寧的治療劑量和中毒劑量比較接近，其吸收速率大于消除速率，長期、大量服用馬錢子就會造成體內短時間內含量過高而引起中毒[4]。因此本研究以通脈丸方中士的寧作為指標性成分進行其在大鼠體內的毒代動力學研究，得到相關的藥動學參數，探討其體內動力學過程的差異，從數據角度對通脈丸的安全性、減毒機制以及體內釋放過程進行客觀分析。

1 材料

1.1 儀器與試劑

H-Class 超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；ZRS-8C智能溶出試驗儀（天津大學無線電廠）；TGL-16B離心機（上海安亭科學儀器廠）；QL-901混勻儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；BF-2000氮氣吹干儀（北京八方世紀科技有限公司）；Sartorius-CP225D電子天平（德國賽多利斯）；DT300A電子天平（上海醫(yī)用激光儀器廠）；摩爾智能超純水器 （重慶摩爾水處理設備有限公司）；KQ-100DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；士的寧對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110705-200306，純度大于98%）；磷酸二氫鉀（天津市永大化學試劑有限公司，批號：20100110）；庚烷磺酸鈉（山東禹王實業(yè)有限公司，批號：2010073001）；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純（北京迪馬歐泰科技發(fā)展中心）。

1.2 實驗藥材

通脈丸方中各味中藥有效組分提取液，由課題組成員徐麗軍提供。處方所用藥材由河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院段曉穎主任藥師鑒定，結果為：①制附子：毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeliiDebx.的子根炮制品；批號：110107，產地：廣西；②黃芪：豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.Mongholicus(Bge.) Hsiao的干燥根；批號：110601，產地：內蒙古；③兩頭尖：毛茛科植物多被銀蓮花Anemone raddeana Regel的干燥根莖；批號：120308，產地：東北；④馬錢子：馬錢科植物馬錢Strychnosnux-vomica L.的干燥成 熟 種 子；批號：111101，產地：廣西；⑤當歸：傘形科植物當歸Angelica sinensisOliv.Diels的 根；批 號：110701，產地：甘肅；⑥赤芍：毛茛科植物芍藥Paeonialactiflora Pall的干燥根；批號：120310，產地：河北；⑦丹參：唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根莖；批號：120303，產地：安徽；⑧陳皮：蕓香科植物橘Citrus reticulata Blanco的干燥成熟果皮；批號：120303，產地：浙江；⑨洋金花：茄科植物白花曼陀羅Daturametel L.的干燥花；批號：120320，產地：江蘇；⑩甘草：豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖；批號：120303，產地：東北；?琥珀：古代松科屬植物的樹脂埋藏地下后年久凝結而成的化石樣物質；批號：110812，產地：云南。

1.3 實驗動物

清潔級Wistar大鼠，體質量300±30 g，雌雄各半，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供，許可證編號：SCXK（魯）20080002。

表1 因素水平表

2 實驗方法

2.1 通脈丸方中各味中藥有效組分配伍方案

通過對通脈丸的制劑處方分析，結合藥效及毒性等特點將處方中各味中藥為8組，“兩頭尖、附子、馬錢子”為一組，“黃芪、當歸”為一組，“丹參、赤芍”為一組，蜂蜜、甘草、陳皮、琥珀和洋金花分別各為一組。按照正交設計表[5-7]L（827）將其中除去“兩頭尖、附子、馬錢子”這一組之外的7組為7個因素，得到8種不同配比，見表1。兩個水平為有和沒有。將這8種不同配比分別與“兩頭尖、附子、馬錢子”這一組配伍得到八組灌胃用藥。

2.2 灌胃用藥的制備

通脈丸方中各味中藥的有效組分提取液由課題組另一成員徐麗軍提供，徐麗軍已測定飲片中指標成分的含量和所提取有效組分含量，計算出處方比例所需藥液的體積。按照配伍方案設計將相應的有效組分提取液混合，濃縮至4.5 g·mL-1的藥液，其中蜂蜜為河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院制劑室煉制的中蜜，琥珀粉碎直接加入藥液。

2.3 色譜條件

Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）；流速0.18 mL·min-1；檢測波長260 nm；流動相：酸水-乙腈（77：23），酸水：0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀與0.01 mol·L-1庚烷磺酸鈉等量混合，并用10%磷酸調體系pH為2.5；柱溫30 ℃；進樣量1 μL。

2.4 對照品溶液的配制

精密稱取士的寧對照品適量，加甲醇溶解，得到士的寧對照品儲備液。

2.5 方法學考察

進行線性關系、定量限、精密度、穩(wěn)定性、提取回收率等試驗考察。

2.6 大鼠頸外靜脈插管手術[8-10]

2.6.1 插管導管的制作

取PE管長度約11 cm，管兩側剪平口。使用之前用記號筆做兩處位置標記分別為3.5 cm處和5.5 cm處，在一端插入一枚大頭針，將其在生理鹽水中浸泡備用。

2.6.2 插管手術

配制10%水合氯醛溶液，按照300 mg·kg-1大鼠的量進行麻醉，用電推剪剔去大鼠左側頸胸部和頸背部的毛，用碘伏對手術區(qū)域及手術器械進行消毒。將已經麻醉的大鼠背位固定在大鼠固定臺上。于大鼠頸中線偏左側，從外上到內下做一個約1 cm左右的縱切口，使用眼科鑷剝離其皮下組織使其左頸外靜脈顯露并游離，結扎靜脈遠心端，在頸外靜脈管壁制造出一個橫向切口，沿此切口將插管插入頸外靜脈?；爻橛醒?，注入生理鹽水后無滲漏則表明插管位置合適，用0.1 mL的0.1%肝素鈉溶液封管后用大頭針封堵插管，將管固定。將大鼠俯臥于大鼠固定臺上，在其頸后部正上方作一個橫切口，將固定好的插管從大鼠頸胸部切口引至頸背部切口，縫合切口，用碘伏消毒處理，插管完成。

2.6.3 插管后的護理

手術完成后將大鼠單籠飼養(yǎng)，注意保暖。待大鼠清醒后注意觀察大鼠有無異常、切口有無感染等，如果發(fā)現有異常應及時處理，術后隔天疏通導管，用0.1%肝素鈉溶液封管。

2.7 血漿樣品預處理方法

取待測大鼠肝素抗凝全血,4000 r·min-1離心15 min，用取樣器精密吸取上層血漿200 μL，置離心管中,加入25%-28%氨水100 μL，置旋渦混合器上混合30 s，然后加入甲基叔丁基醚1.5 mL，再渦旋1 min，離心10 min，收集甲基叔丁基醚液；剩余物重復以上萃取操作一次，合并兩次萃取液后40℃氮氣流吹干。殘渣加入甲醇100 μL溶解，渦旋，15 000 r·min-1離心10 min，取上清液進樣測定[3]。

2.8 大鼠血漿樣品測定

正常大鼠8組，每組各5只，給藥前禁食12 h，不禁水。給藥前稱體重，給藥劑量為0.64 mL藥液/100 g大鼠，記下各只大鼠給藥的準確時間，于給藥后2、4、6、24、28、31、48、52、55 h不同時間點大鼠靜脈插管取血0.45 mL，同時注入等體積生理鹽水，全血置于含有肝素鈉的離心管中備用。按照血漿樣品的處理方法將血漿樣品處理后，使用UPLC測定不同時間點的血漿藥物濃度。

2.9 數據處理

采用已建立的UPLC法測定不同時間點大鼠血漿中士的寧的濃度，以時間為橫坐標，血藥濃度為縱坐標，建立士的寧的血藥濃度-時間曲線以及各個組的平均血藥濃度-時間曲線；采用藥動學軟件Winnonlin 5.2，計算各個組的毒代動力-學參數。本實驗所得的計量資料用均數±標準差±s表示，各個組的毒代動力學參數比較采用t檢驗[11，12]，P＜0.05為差異有顯著性意義，其他配伍組的AUC與通脈丸原方組（第1組）的AUC進行比較，計算AUC減少率[AUC減少率（%）=（通脈丸原方組AUC－其他配伍組AUC）／通脈丸原方組AUC]。

3 結果

3.1 線性范圍及最小檢測限

取大鼠空白血漿200 μL，分別加入一定濃度的士的寧對照品溶液，制成系列濃度的對照品溶液，按實驗方法“2.7項”操作，吸取上述一系列不同濃度血漿質控樣品溶液1 μL進樣測定峰面積，以士的寧峰面積對含士的寧血漿濃度進行線性回歸，得回歸方程Y=10 336 665X+148.822 5，R=0.999 9，結果表明士的寧在進樣量0.000 043 2-0.010 800 0 μg與峰面積呈良好線性關系，按峰高為基線噪音3倍計算，血漿中士的寧最低檢測濃度為0.043 2 μg·mL-1。

3.2 回收率實驗

將一定量的士的寧對照品溶液加入到空白血漿樣品制成高、中、低 3個濃度的樣品,依實驗方法“2.7項”下處理。測得血漿高、中、低濃度樣品絕對回收率為85.48-87.94，平均相對回收率為99.31%-105.54%，RSD（%）值均小于15%，n=6，符合生物樣品含量測定要求。

3.3 精密度實驗

取大鼠空白血漿，分別加入高、中、低濃度士的寧對照品溶液，按標準曲線制備方法進行測定。日內差異: 一天內重復 5 次,RSD（%）均小于10%，日內精密度良好。日間差異：每天測定一次,連續(xù)測定 5 天，結果RSD（%）均小于10%，日間精密度良好。

圖1 大鼠灌胃第1-8組通脈丸有效組分濃縮液后士的寧的平均血藥濃度-時間曲線

3.4 穩(wěn)定性考察

將生物樣品按相應的“2.7項”下進行樣品處理,室溫25℃放置,分別在0、6、12、24 h進樣測定，結果RSD（%）均小于15%。樣品在室溫下24 h內穩(wěn)定性良好。-20 ℃冷凍，室溫下自然溶解，反復凍融3次，測得士的寧的濃度RSD值均小于15%，顯示血漿樣品反復凍融3次后穩(wěn)定性良好。

3.5 毒代動力學研究結果

3.5.1 不同時間點大鼠血漿樣品中士的寧含量測定結果

大鼠灌胃通脈丸方有效組分配伍濃縮液后所測得的士的寧平均血藥濃度-時間數據曲線見下圖1。

堿成鹽，降低生物堿在體內的毒性，分析實驗結果與以后研究結果不相符合的原因一方面可能為第7組實驗配伍中除了甘草和蜂蜜之外，還有另一個因素陳皮的有效組分，陳皮與甘草、蜂蜜產生了相互作用，影響了甘草、蜂蜜的減毒作用，另一方面可能為處方量的甘草和蜂蜜不足夠產生減毒作用，同時經過單獨的工藝優(yōu)選后提取的甘草有效組分與蜂蜜配伍不能達到甘草與蜂蜜配伍后的減毒作用。

中藥毒代動力學作為中藥安全性評價研究中的重要部分，能夠有效解釋毒性試驗結果和預測人體安全性，是連接毒理試驗現象和人用中藥可能發(fā)生的不良反應評價之間的橋梁[15]。但中藥復方化學成分的復雜性和多樣性、中藥配伍的變異性和機體狀態(tài)的不可預測性，給中藥復方藥代動力學研究帶來許多問題[16]。因此應注重采用新技術、新方法，對中藥復方的代謝過程及毒效機制進行探索，以尋求更好的復方藥代動力學研究途徑，為中藥的臨床安全性評價提供更為可靠的依據。

本課題選擇的是單次給藥，采用灌胃給藥的方式進行實驗。毒代動力學是在毒性劑量下進行的實驗研究，根據通脈丸方濃縮液急性毒性實驗得出灌胃給藥LD50為107.48 g·kg-1[17]，再結合課題前期研究結果確定給藥劑量為28.8 g·kg-1，相當于人臨床服用劑量（按每天10 g計）的33倍。

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Toxicokinetics of Tongmai Pills and the Effectiveness of Its Combination Components Concentrate in Rats

Chen Tianchao1,Liu Riuxia2,Yu Lanlan2
(1. The First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 450000,China; 2. School of Pharmacy,Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 450008,China)

This study aimed to investigate the mechanism of internal attenuation and provide references for safety evaluation by extracting effective components from the Chinese herbs of Tongmai pills. Rats were dividedinto eight groups and intragastrically administered with the concentrated decoction of the Tongmai prescription. Serum strychnine levels of all groups were detected by UPLC at various time points after administration. At last,its fitting parameters in toxicokinetic were calculated using SPSS software. It was found that the parameters of serum strychnine in rats fitted with the non-compartmental model with the AUC(0-t)outputs as follows: 10.271 9±3.224 7,8.806 1±1.245 8,13.496 6±4.582 5,11.031 5±2.873 2,9.929 1±1.499 7,5.042 0±2.171 2,15.136 2±6.353 3,5.751 5±1.492 8 μg·h·mL-1. Different toxicities between the concentrated decoction from Tongmai pills (group 1) and other decoctions consisting of the some herbs in Tongmai pills (group 2-group 8) were showed in this study with the AUC outputs ranging from the most to the least as follows: group 6,group 8,group 2,group 5,group 1,group 4,group 3 and group 7. So the decoction with salvia,red peony,amber and honey presented the strongest toxicity attenuated effect. In conclusion,it was demonstrated that UPLC worked well in determining serum strychnine of rats.

Compatibility for toxicity attenuation,strychnine,toxicokinetic,pharmacokinetic parameters

10.11842/wst.2016.05.024

R285

A

（責任編輯：朱黎婷，責任譯審：朱黎婷）

2016-03-11

修回日期：2016-04-07

＊ 河南省教育廳科技攻關項目（2011A360003）：基于系統(tǒng)論通脈丸減毒機制的研究，負責人：陳天朝；河南省教育廳重點項目（13A350597）：基于藥輔統(tǒng)一的中藥丸劑釋藥機制研究，負責人：陳天朝。

＊＊ 通訊作者：陳天朝，主任藥師，碩士研究生導師，主要研究方向：中藥新劑型研究。