康復(fù)新液與順鉑、伊立替康聯(lián)用對(duì)大腸癌HCT116荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)和造血系統(tǒng)的影響＊

鄒俊波，熊永愛

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地 成都 610075）

康復(fù)新液與順鉑、伊立替康聯(lián)用對(duì)大腸癌HCT116荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)和造血系統(tǒng)的影響＊

鄒俊波＊＊，熊永愛

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地 成都 610075）

目的：考察康復(fù)新液與順鉑、伊立替康等用人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116荷瘤小鼠的聯(lián)合用藥效果。方法：SPF級(jí)C57BL/6小鼠110只，分別腹水接種HCT116制備種鼠模型，6-7天后，分離腫瘤組織制備HCT116荷瘤小鼠模型90只，隨機(jī)分為模型組、康復(fù)新液組、順鉑組、康復(fù)新液聯(lián)合順鉑組、伊立替康組、康復(fù)新液聯(lián)合伊立替康組共6組，按實(shí)驗(yàn)方案給藥16天，期間每3天測(cè)定一次動(dòng)物體質(zhì)量，16天后荷瘤小鼠摘眼球取血，測(cè)定血常規(guī)，處死后剝離腫瘤組織，測(cè)定腫瘤體積，計(jì)算小鼠FBW/IBW比值，分取骨髓，測(cè)定骨髓DNA含量，觀察造血祖細(xì)胞集落，流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓細(xì)胞CD34+抗原的表達(dá)。結(jié)果：與模型組相比，各給藥組瘤重均顯著減輕（P＜0.05），康復(fù)新液及聯(lián)合用藥組動(dòng)物PLT、RBC、HGB水平均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），順鉑組、伊立替康組小鼠血常規(guī)各項(xiàng)水平和骨髓DNA含量、造血祖細(xì)胞集落數(shù)量以及骨髓細(xì)胞CD34+抗原表達(dá)率均顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）；與順鉑組、伊立替康組相比，與康復(fù)新液聯(lián)合使用可明顯抑制化療藥物導(dǎo)致的體質(zhì)量下降（P＜0.05），升高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血常規(guī)水平（P＜0.05，P＜0.01），提升小鼠骨髓DNA含量、造血祖細(xì)胞集落數(shù)量以及骨髓細(xì)胞CD34+抗原表達(dá)率（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論：康復(fù)新液具有明顯抑制HCT116荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的作用，且與順鉑、伊立替康聯(lián)合應(yīng)用，可有效改善后二者引起的骨髓抑制作用，康復(fù)新液聯(lián)合一線抗腫瘤藥物的應(yīng)用前景廣闊。

康復(fù)新液 結(jié)腸癌 順鉑 伊立替康 聯(lián)合用藥

近年來，中藥對(duì)抗化療方案引起的副作用具有顯著的效果[1]?？祻?fù)新液為美洲大蠊提取物制備的國(guó)家二類新藥，最主要用于消化系統(tǒng)潰瘍，如胃潰瘍、十二支腸潰瘍、結(jié)腸炎等以及外部創(chuàng)傷，如燒燙傷、金創(chuàng)傷等的修復(fù)?？祻?fù)新液在抗腫瘤方面的應(yīng)用受到越來越多的重視，眾多學(xué)者的研究表明其對(duì)呼吸系統(tǒng)腫瘤、生殖系統(tǒng)腫瘤、消化系統(tǒng)腫瘤等均具有明顯的抑制作用。

由此推測(cè)，康復(fù)新液既具有良好的修復(fù)作用，還對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)具有一定的抑制作用。因此，具備與化療藥物聯(lián)合用藥的理論基礎(chǔ)。日本學(xué)者研究[1]表明，中藥在對(duì)抗化療方案引起的副作用方面，具有顯著的效果。本實(shí)驗(yàn)擬開展康復(fù)新液與順鉑、伊立替康等藥物聯(lián)合用于異體移植結(jié)腸癌小鼠的實(shí)驗(yàn)研究，相關(guān)研究未見國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6小鼠，體質(zhì)量16-20 g，雌雄各半，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：川實(shí)動(dòng)管質(zhì)SCXK（川）2013-24。由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院動(dòng)物觀察室飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施條件合格證號(hào)：川實(shí)動(dòng)管使第2009-124號(hào)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

康復(fù)新液（100 mL/瓶，湖南中南科倫藥業(yè)有限公司，批號(hào)：M140937）；鹽酸伊立替康注射液（40 mg/支，美國(guó)輝瑞制藥有限公司，批號(hào)：15050611）；順鉑注射液（30 mg/支，太極集團(tuán)四川太極制藥有限公司，批號(hào)：14080014）；重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（Recombinant Human Granulocyte-Colony Stimulating Factor，rhG-CSF）注射液（齊魯制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：S19990049，批號(hào)：140812）；重組小鼠干細(xì)胞因子（Recombinat Mouse Stem Cell Factor，rmSCF）、重組小鼠白介素3（Recombinant Mouse Interleukin-3，rmIL-3）、重組小鼠促血小板生成素（Recombinant Mouse Thrombopoietin，rmTPO）（以色列ProSpec公司，批號(hào)分別為CYT-275、CYT-371 CYT-346）；鼠抗人CD34+單克隆抗體（北京博奧森公司，批號(hào)：BA0763）；胎牛血清（Fetal Calf Serum，F(xiàn)BS）、PBS緩沖液（美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)分別為：SH30084.03、AWJ20601）；青鏈霉素雙抗，青霉素10 000 U·mL-1，鏈霉素10 000 μg·mL-1（北京友康基業(yè)生物科技有限公司，批號(hào)：RS0008；牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）、L-谷氨酰胺、二巰基乙醇（美國(guó)sigma公司，編號(hào)分別為：sigma7888、sigma49419、M3148；RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：12633012）。

1.3 腫瘤細(xì)胞

人結(jié)腸癌HCT116腫瘤細(xì)胞，由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心腫瘤生物治療實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

十萬(wàn)分之一分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；BPH-300倒置相差顯微鏡（上海比目?jī)x器有限公司）；MEK6318K全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（上海廣電醫(yī)用電子儀器有限公司）； BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀（北京東迅天地醫(yī)療儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 HCT116荷瘤小鼠模型制備

將HCT116腫瘤細(xì)胞從液氮罐中取出，37℃迅速解凍，將濃度調(diào)整至1×108個(gè)/mL以供注射。腹腔接種HCT116細(xì)胞小鼠6-7 天后腹水形成明顯[1]，將生長(zhǎng)7天的腹水模型種鼠頸椎脫臼處死，蠟版固定，用碘伏、75%乙醇腹部局部消毒，在無菌條件下取出乳白色濃稠活體腹水，與生理鹽水注射液1:3稀釋，移植于用75%乙醇消毒的受試小鼠，每只小鼠按照0.2 mL接種于右腋下皮膚[2]。

2.2 動(dòng)物分組及給藥

小鼠接種腫瘤細(xì)胞后次日按照體質(zhì)量隨機(jī)分為 6組，每組15只，即模型組（0.5% CMC-Na溶液）、康復(fù)新液組、順鉑組、康復(fù)新液聯(lián)合順鉑組、伊立替康組、康復(fù)新液聯(lián)合伊立替康組。給藥劑量及方式見表1。

表1 康復(fù)新液聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)藥物給藥方案

2.4 抑瘤率的測(cè)定

按表1給藥方案給藥。第16 天處死小鼠，取腫瘤組織稱瘤重，計(jì)算抑瘤率。

抑瘤率（%）=（模型組的平均瘤重-治療組平均瘤重）/模型組的平均瘤重×100%

2.5 小鼠給藥前后體質(zhì)量、體質(zhì)量比值（FBW / IBW）、死亡情況

IBW為給藥前小鼠體質(zhì)量，F(xiàn)BW為16天時(shí)小鼠去除瘤重的體質(zhì)量。采用FBW/IBW比值大小衡量藥物的毒性作用大小。FBW/IBW＞0.85，提示藥物的毒副作用不明顯，小鼠能耐受；比值小于0.85則提示藥物對(duì)小鼠有一定的毒副作用；治療期間如給藥組動(dòng)物死亡超過20%，表示藥物具有毒性反應(yīng)。

2.6 血常規(guī)測(cè)定

各組動(dòng)物摘眼球取血，至于含EDTA-2K的抗凝管中，測(cè)定血常規(guī)。

2.7 骨髓細(xì)胞DNA含量

各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脫頸處死后，以75%酒精浸泡5 min，在超凈工作臺(tái)取左側(cè)股骨，用0.005 mol·L-1CaCl2沖洗骨髓至3 mL 淋巴細(xì)胞分離液中，2 000 r·min-1離心20 min。收集單個(gè)核細(xì)胞層細(xì)胞，用無鈣、鎂離子PBS 液洗滌3次后配成每管109/L 的細(xì)胞懸液，離心棄上清，各管加入0.5 mL 碘化丙啶（PI）染液，置4℃冰箱30 min 混勻，用300目尼龍網(wǎng)過濾后待測(cè)。

2.8 造血祖細(xì)胞集落觀察

2.8.1 單個(gè)有核細(xì)胞懸液（BMC）制備及計(jì)數(shù)

取小鼠脛骨，6號(hào)針頭RPMI 1640沖出骨髓細(xì)胞，4號(hào)針頭過濾制成骨髓單個(gè)有核細(xì)胞懸液，用培養(yǎng)液調(diào)配成1×106/mL有核細(xì)胞懸液，置于4℃冰箱備用。

2.8.2 造血祖細(xì)胞培養(yǎng)

將造血祖細(xì)胞粒單系祖細(xì)胞（CFU-GM）、紅系祖細(xì)胞（BFU-E、CFU-E）、巨核系祖細(xì)胞（CFUMeg）培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每組8孔，培養(yǎng)條件見下表2。將培養(yǎng)板放于在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)7天，并于第3天倒置顯微鏡計(jì)數(shù)CFU-E細(xì)胞集落數(shù)，于第7天分別計(jì)數(shù)CFU-GM、BFU-E、CFU-Meg。其中，BFU-E、CFU-GM以多于50個(gè)細(xì)胞為一個(gè)集落，CFU-E以8-32個(gè)細(xì)胞為一個(gè)集落，CFU-Meg以多于3個(gè)細(xì)胞為一個(gè)集落。

2.9 骨髓細(xì)胞CD34+抗原表達(dá)檢測(cè)

用含0.2%牛血清白蛋白的PBS 1640緩沖液沖洗小鼠右側(cè)股骨骨髓細(xì)胞，取約106個(gè)細(xì)胞混懸液，離心，棄去上清液，加30 μL 正常小鼠血清以封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)，再加入10 μL FITC 標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD34+抗體，對(duì)照管加入10 μL 相應(yīng)對(duì)照抗體，4℃避光反應(yīng)30 min。加入2 mL 紅細(xì)胞裂解液，作用5 min，洗滌細(xì)胞2次，加入終濃度為3 μg·mL-1的PI 染液，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓細(xì)胞CD34+抗原表達(dá)。

表2 造血祖細(xì)胞培養(yǎng)體系

2.10 統(tǒng)計(jì)方法

圖1 康復(fù)新液聯(lián)合用藥對(duì)HCT116 結(jié)腸癌荷瘤小鼠體質(zhì)量（含瘤重）的影響

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 抑瘤率測(cè)定結(jié)果

由表3可知，康復(fù)新液（3.9 mL·kg-1）連續(xù)灌胃給藥15天，可顯著減輕瘤重（P＜0.01），抑瘤率為30.14%，表明康復(fù)新液具有較好的抑制HCT116腫瘤生長(zhǎng)的作用；順鉑抑瘤率為41.45%，具有明顯抑瘤作用（P＜0.05），康復(fù)新液聯(lián)合順鉑可顯著減輕瘤重（P＜0.01），抑瘤率54.78%；伊立替康可顯著減輕瘤重（P＜0.01），抑瘤率42.90%，康復(fù)新液聯(lián)合伊立替康組瘤重顯著減輕（P＜0.01），抑瘤率為56.23%。康復(fù)新液聯(lián)合用藥后具有增加順鉑、伊立替康抑制腫瘤作用的趨勢(shì)。

3.2 小鼠給藥前后體質(zhì)量變化結(jié)果

由圖1可知，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體質(zhì)量與模型組相比，順鉑、伊立替康組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量自第3天開始，即第2次稱量動(dòng)物體質(zhì)量時(shí)明顯下降（P＜0.05），隨著時(shí)間推移，體質(zhì)量下降幅度越來越大（P＜0.05）；與康復(fù)新液聯(lián)用后，可明顯抑制化療藥物引起的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量下降（P＜0.05）。

3.3 小鼠給藥前后體質(zhì)量比值（FBW / IBW）及死亡比例測(cè)定結(jié)果

由表4可知，順鉑組FBW /IBW值小于0.85，提示順鉑毒副作用明顯，聯(lián)合應(yīng)用康復(fù)新液后，F(xiàn)BW / IBW值達(dá)到0.85，表明康復(fù)新液對(duì)順鉑的副作用有明顯改善；伊立替康組FBW /IBW值小于0.85，提示其有副作用，與康復(fù)新液聯(lián)合應(yīng)用后FBW /IBW值顯著提高至0.86，表明康復(fù)新液對(duì)伊立替康的副作用減少。各給藥組連續(xù)灌胃給藥16天，康復(fù)新液組因動(dòng)物打架意外致死1只，伊立替康組因接種操作的失誤（可能由于接種時(shí)腫瘤細(xì)胞液外漏），致使1只小鼠無腫瘤生長(zhǎng)，順鉑組及相關(guān)聯(lián)合用藥組動(dòng)物各死亡2只，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)未計(jì)入這些小鼠的體質(zhì)量數(shù)據(jù)。

表3 康復(fù)新液聯(lián)合用藥對(duì)HCT116 結(jié)腸癌荷瘤小鼠抑瘤率的影響（±s）

表3 康復(fù)新液聯(lián)合用藥對(duì)HCT116 結(jié)腸癌荷瘤小鼠抑瘤率的影響（±s）

注：與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與順鉑組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與伊立替康組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01，下同。

組別 劑量（mg/kg） 動(dòng)物數(shù)量（n） 瘤重（g） 抑瘤率（%）模型組 -- 15 3.45±0.88 0.00康復(fù)新液組 3.9 ml 14 2.41±0.99** 30.14**順鉑組 10 13 2.02±0.72* 41.45*康復(fù)新液聯(lián)合順鉑組 等劑量聯(lián)用 13 1.56±0.93** 54.78**伊立替康組 44.5 14 1.97±0.64** 42.90**康復(fù)新液聯(lián)合伊立替康組 等劑量聯(lián)用 15 1.51±1.02** 56.23**

3.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外周血象測(cè)定結(jié)果

由表5、6可知，①PLT水平：與模型組相比，康復(fù)新液聯(lián)合用藥組動(dòng)物PLT水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），與順鉑組、伊立替康組相比，康復(fù)新液聯(lián)合用藥組動(dòng)物PLT水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。②HGB水平：與模型組相比，康復(fù)新液組以及康復(fù)新液聯(lián)合用藥組HGB水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），順鉑、伊立替康組HGB水平顯著下降（P＜0.01），聯(lián)用康復(fù)新液后顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。③RBC水平：與模型組相比，康復(fù)新液及聯(lián)合用藥組RBC水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），與順鉑、伊立替康組相比，聯(lián)合應(yīng)用康復(fù)新液后動(dòng)物RBC水平顯著升高（P＜0.01）。④WBC水平：與模型組相比，康復(fù)新液均可顯著升高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物WBC水平（P＜0.05，P＜0.01），順鉑、伊立替康組WBC水平顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），聯(lián)用康復(fù)新液可顯著提高順鉑、伊立替康導(dǎo)致的WBC水平下降（P＜0.01）。⑤NEU水平及NEU百分比：與模型組相比，各實(shí)驗(yàn)組無顯著差異（P＞0.05），與順鉑、伊立替康組組相比，康復(fù)新液組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物NEU水平及NEU百分比顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

3.5 骨髓DNA含量測(cè)定結(jié)果

由圖2可知，與模型組比較，順鉑組、伊立替康組小鼠骨髓DNA極含量顯著下降（P＜0.01）；與順鉑組比較，康復(fù)新液聯(lián)合順鉑組小鼠骨髓DNA含量顯著升高（P＜0.05）；與伊立替康組相比，康復(fù)新液聯(lián)合伊立替康組小鼠骨髓DNA含量顯著升高（P＜0.05）。

圖2 康復(fù)新液聯(lián)合用藥對(duì)HCT116 結(jié)腸癌荷瘤小鼠骨髓DNA含量的影響（±s）

表4 康復(fù)新液聯(lián)合用藥對(duì)HCT116 結(jié)腸癌荷瘤小鼠體質(zhì)量及死亡比例的影響（±s）

表4 康復(fù)新液聯(lián)合用藥對(duì)HCT116 結(jié)腸癌荷瘤小鼠體質(zhì)量及死亡比例的影響（±s）

組別 劑量/mg?kg-1 動(dòng)物數(shù)量/n 體質(zhì)量/g FBW/IBW FBW IBW模型組 -- 15 16.12±1.86 18.32±1.11 0.88±0.14康復(fù)新液組 3.9 ml 14 16.02±1.56 18.41±1.43 0.87±0.32順鉑組 10 13 14.89±1.11 18.38±2.51 0.81±0.77康復(fù)新液聯(lián)合順鉑組 等劑量聯(lián)用 13 15.86±2.37 18.66±2.63 0.85±0.89伊立替康組 44.5 14 11.22±1.94 18.01±2.17 0.62±0.57康復(fù)新液聯(lián)合伊立替康組 等劑量聯(lián)用 15 15.90±2.33 18.49±2.05 0.86±0.82

表5 康復(fù)新液聯(lián)合用藥對(duì)HCT116 結(jié)腸癌荷瘤小鼠外周血象的影響（±s）

表5 康復(fù)新液聯(lián)合用藥對(duì)HCT116 結(jié)腸癌荷瘤小鼠外周血象的影響（±s）

血象指標(biāo)PLT/109·L-1 HGB/g·L-1 RBC/×1012·L-1模型組 836.46±23.93 93.92±5.30 5.54±0.37康復(fù)新液組 902.59±25.28 137.26±7.04** 7.73±0.46*順鉑組 883.90±26.94 49.62±4.99** 3.63±0.39**康復(fù)新液聯(lián)合順鉑組 933.87±21.03*## 121.08±13.00**## 7.59±0.86*#伊立替康組 637.07±19.10** 56.22±3.57** 4.75±0.34**康復(fù)新液聯(lián)合伊立替康組 896.03±25.48**ΔΔ 117.16±11.20**Δ 8.04±0.41**ΔΔ組別

表6 康復(fù)新液聯(lián)合用藥對(duì)HCT116 結(jié)腸癌荷瘤小鼠外周血象的影響（±s）

表6 康復(fù)新液聯(lián)合用藥對(duì)HCT116 結(jié)腸癌荷瘤小鼠外周血象的影響（±s）

血象指標(biāo)NEU/109·L-1 NEU/% WBC/109·L-1模型組 7.25±0.48 52.04±1.68 5.99±0.39康復(fù)新液組 7.49±0.74 53.21±1.59 9.45±0.71*順鉑組 3.72±0.43* 35.04±1.89* 3.47±0.21**康復(fù)新液聯(lián)合順鉑組 7.46±0.78# 46.27±3.45## 7.83±0.57**#伊立替康組 3.81±0.54** 34.75±1.51* 2.08±0.16**康復(fù)新液聯(lián)合伊立替康組 7.79±0.65Δ 58.09±3.81Δ 7.21±0.72**ΔΔ組別

3.6 對(duì)造血祖細(xì)胞的影響

由表7可知，與模型組相比，順鉑組、伊立替康組以及相關(guān)聯(lián)合用藥組骨髓CFU-GM、BFU-E、CFU-E與CFU-Meg集落數(shù)量均顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）；與順鉑組相比，康復(fù)新液聯(lián)合順鉑組能顯著升高骨髓CFU-GM、BFU-E、CFU-E與CFU-Meg集落數(shù)（P＜0.05，P＜0.01）；與伊立替康組相比，康復(fù)新液聯(lián)合伊立替康組能顯著升高BFU-E、CFU-GM、CFU-E與CFU-Meg集落數(shù)（P＜0.05，P＜0.01）。

3.7 骨髓細(xì)胞CD34+表達(dá)率測(cè)定結(jié)果

由圖3可知，與模型組比較，除康復(fù)新液組外，其余各組小鼠骨髓細(xì)胞CD34+表達(dá)率顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）；與順鉑組比較，康復(fù)新液聯(lián)合順鉑組骨髓細(xì)胞CD34+表達(dá)率明顯升高（P＜0.05）；與伊立替康組比較，康復(fù)新液聯(lián)合伊立替康組骨髓細(xì)胞CD34+表達(dá)率極顯著升高（P＜0.01）。各實(shí)驗(yàn)組小鼠骨髓造血干細(xì)胞CD34+流式細(xì)胞檢測(cè)分別見圖4-9。

圖3 康復(fù)新液聯(lián)合用藥對(duì)HCT116 結(jié)腸癌荷瘤小鼠骨髓細(xì)胞CD34+表達(dá)率的影響（±s）

4 討論

大腸癌，又稱結(jié)腸癌，是常見的消化道惡性腫瘤，可發(fā)生在結(jié)腸的任何部位。在北美、西歐發(fā)病率有較高，美國(guó)結(jié)腸癌占全部癌死亡原因的第2位。在中國(guó)大部分省市死亡率占全部惡性腫瘤死亡率的第5-6位，近年來有上升趨勢(shì)。其發(fā)病率隨年齡而增長(zhǎng)，從40歲開始上升，60-75歲達(dá)到峰值。

大腸癌目前常用的治療方案仍為單一藥物化療，較為有效的化療藥物主要包括順鉑類（DDP）、伊立替康（CPT-11）、氟尿嘧啶類、亞硝脲類、絲裂霉素（MMC）、蒽環(huán)類抗生素等，但這些藥物的療效仍有一定的局限。

如順鉑是以二價(jià)鉑同兩個(gè)氯原子和兩個(gè)氨分子結(jié)合的重金屬絡(luò)合物，類似于雙功能烷化劑，可抑制DNA的復(fù)制過程[2-4]。骨髓抑制為最主要的劑量限制性毒性[5]。1995年WHO（世界衛(wèi)生組織）對(duì)上百種化療藥進(jìn)行綜合排名，順鉑名列第2；另?yè)?jù)統(tǒng)計(jì)在中國(guó)以順鉑為主的化療方案或含順鉑的聯(lián)合化療方案占所有化療方案的70%-80%[6]。

伊立替康是喜樹堿的半合成衍生物。中性粒細(xì)胞減少癥為該藥的劑量限制性毒性[7]。在伊立替康單藥治療中：78.7%的患者均出現(xiàn)過中性粒細(xì)胞減少癥，嚴(yán)重者（中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)＜500/mm3）占22.6%。在可評(píng)價(jià)的周期內(nèi)，18%出現(xiàn)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)＜1 000/mm3，其中7.6%中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)＜500/mm3。通常在第22天完全恢復(fù)正常。62%的患者，按周期為17%，出現(xiàn)嚴(yán)重中性粒細(xì)胞減少癥合并發(fā)熱。10.3%的患者（按周期為2.5%）出現(xiàn)感染；5.3%的患者（按周期為1.1%）出現(xiàn)嚴(yán)重中性粒細(xì)胞減少癥引起的感染，2例出現(xiàn)過中性粒細(xì)胞減少癥，嚴(yán)重者（中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)＜500/mm3）占22.6%。

表7 康復(fù)新液聯(lián)合用藥對(duì)HCT116 結(jié)腸癌荷瘤小鼠造血祖細(xì)胞的影響（±s）

表7 康復(fù)新液聯(lián)合用藥對(duì)HCT116 結(jié)腸癌荷瘤小鼠造血祖細(xì)胞的影響（±s）

組別 CFU-GM（×105） BFU-E（×105） CFU-E（×105） CFU-Meg（×105）模型組 86.61±2.07 39.82±2.43 64.36±2.02 159.46±5.64康復(fù)新液組 87.40±1.74 40.86±1.37 67.88±1.33 158.36±3.52順鉑組 30.85±0.46** 19.66±0.68** 35.79±0.75* 46.38±1.73**康復(fù)新液聯(lián)合順鉑組 62.43±1.70**## 31.80±1.38*## 62.33±1.57*# 144.82±4.24*#伊立替康組 34.14±1.03** 19.85±2.19** 35.12±3.10* 52.63±2.92**康復(fù)新液聯(lián)合伊立替康組 59.07±2.77*Δ 31.51±2.06*ΔΔ 55.44±0.94*Δ 141.79±1.03**ΔΔ

近年來，在這些藥物基礎(chǔ)上制定了針對(duì)結(jié)腸癌的化療方案，主要包括FM方案、5-FU/CF方案、5-FU/LV和5-FU/CF/LV方案，上述方案成本高昂，帶給患者沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，更重要的是化療藥物引起的副作用嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，其中最突出的仍是骨髓抑制作用，表現(xiàn)為骨髓造血功能低下，血細(xì)胞前體活性下降，周圍血細(xì)胞數(shù)量減少，骨髓抑制進(jìn)一步限制了相關(guān)化療藥物的臨床使用，目前尚無理想應(yīng)對(duì)方案。

圖4 模型組小鼠骨髓細(xì)胞CD34+抗原表達(dá)

圖5 康復(fù)新液組小鼠骨髓細(xì)胞CD34+抗原表達(dá)

圖6 順鉑組小鼠骨髓細(xì)胞CD34+抗原表達(dá)

圖7 康復(fù)新液聯(lián)合順鉑組小鼠骨髓細(xì)胞CD34+抗原表達(dá)

圖8 伊立替康組小鼠骨髓細(xì)胞CD34+抗原表達(dá)

圖9 康復(fù)新液聯(lián)合伊立替康組小鼠骨髓細(xì)胞CD34+抗原表達(dá)

目前康復(fù)新液最主要用于消化系統(tǒng)潰瘍，如胃潰瘍、十二支腸潰瘍、結(jié)腸炎等以及外部創(chuàng)傷，如燒燙傷、金創(chuàng)傷等的修復(fù)。近年來其在抗腫瘤方面的應(yīng)用受到越來越多的重視，有學(xué)者研究表明康復(fù)新液具有誘導(dǎo)胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡的作用，且抑制作用呈時(shí)間濃度依賴關(guān)系[8]，美洲大蠊提取物通過上調(diào)Fas、Fas R和P53等凋亡基因，下調(diào)Bcl-2抑制凋亡基因，阻止細(xì)胞于G0/G1期從而抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而顯著抑制3LL細(xì)胞肺癌在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)[9]，通過線粒體途徑誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡抑制人肝癌細(xì)胞Bel-7402的增殖[10]，下調(diào)小鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，抑制腫瘤血管生成從而抑制H22肝癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)[11]。尚有研究表明美洲大蠊醇提取物對(duì)白血病細(xì)胞和生殖系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒性，可明顯抑制相關(guān)腫瘤細(xì)胞的增殖[12-13]。

從本實(shí)驗(yàn)可知，康復(fù)新液（3.9 ml/kg）連續(xù)給藥15 d，均具有明顯抑制HCT116荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的作用，且與順鉑、伊立替康聯(lián)合應(yīng)用，可有效改善后二者引起的骨髓抑制，也可改善順鉑、伊立替康導(dǎo)致的骨髓抑制狀況。

與順鉑聯(lián)合應(yīng)用后，康復(fù)新液可明顯提高順鉑的抑瘤率，與其所含CⅡ-3等抗腫瘤活性成分相關(guān)；同時(shí)康復(fù)新液修復(fù)作用明顯，因此其對(duì)順鉑引起的副作用具有一定的干預(yù)作用，本實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為有效緩解動(dòng)物體質(zhì)量的下降，提高FBW/IBW值，增加外周血PLT、RBC水平，增加骨髓DNA含量，增加小鼠骨髓細(xì)胞CD34+抗原表達(dá)，升高骨髓CFUGM、BFU-E、CFU-E與CFU-Meg集落數(shù)。與伊立替康聯(lián)用后，康復(fù)新液同樣表現(xiàn)為在提升抑瘤率的同時(shí)，有效緩解化療藥物導(dǎo)致的骨髓抑制情況，具體表現(xiàn)為有效提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外周血白細(xì)胞水平和中性粒細(xì)胞數(shù)量，升高骨髓CFU-GM、BFU-E、CFU-E與CFU-Meg集落數(shù)，增加骨髓DNA含量，提高小鼠骨髓細(xì)胞CD34+抗原的表達(dá)。但本實(shí)驗(yàn)未考察康復(fù)新液與不同劑量化療藥物的聯(lián)用效果，即康復(fù)新液可能通過減少順鉑、伊立替康的用量而降低化療藥物的相關(guān)副作用，此為后續(xù)研究應(yīng)重點(diǎn)考察的方向。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，康復(fù)新液具有與一線抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用的廣闊前景。

1 Mochiki E,Yanai M,Ohno T,et al. The effect of traditional Japanese medicine （Kampo） on gastrointestinal function. Surg Today,2010,40（12）: 1105-1111.

2 郗照勇,劉揚(yáng)中. 順鉑耐藥的分子機(jī)制. 中國(guó)科學(xué):化學(xué),2014,4: 410-422.

3 劉敏. 順鉑聯(lián)合電離輻射在肺癌細(xì)胞殺傷作用機(jī)制的研究.吉林大學(xué)博士學(xué)位論文,2014.

4 史春山. 順鉑/聚（L-谷氨酸）接枝聚（乙二醇）納米粒體內(nèi)外抗腫瘤效果研究. 吉林大學(xué)博士學(xué)位論文,2015.

5 唐春蘭,楊和平,周向東. DNA損傷修復(fù)與肺癌順鉑耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展. 中國(guó)肺癌雜志,2011,14（12）: 960-964.

6 楊一昆,普紹平,高文桂. 順鉑的應(yīng)用及鉑族金屬抗癌藥物的研究進(jìn)展. 中國(guó)新藥雜志,1999,8（12）: 797-800.

7 王麗焱. 抗腫瘤藥伊立替康的研究進(jìn)展. 國(guó)外醫(yī)學(xué).藥學(xué)分冊(cè),2004,31（1）: 7-11.

8 蔣永新,王熙才,金從國(guó),等. 康復(fù)新體外誘導(dǎo)胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究. 昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2006,27（2）: 5-9.

9 蔣永新,王熙才,金從國(guó),等. 美洲大蠊提取物對(duì)小鼠3LL肺癌的抑制作用及其機(jī)制探討.中國(guó)肺癌雜志,2006,9（6）: 488-491.

10 王晶,李鑫. 美洲大蠊提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel-7402作用機(jī)制的研究. 中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2012,29（10）: 876-880.

11 陳俊雅,耿玲,張旭強(qiáng),等. 美洲大蠊提取物CⅡ-3對(duì)H22肝癌小鼠血管生成作用的研究. 腫瘤學(xué)雜志,2012,18（4）: 274-276.

12 何正春,胡明輝,王曉雨,等. 美洲大蠊提取物對(duì)3株人及小鼠白血病細(xì)胞的細(xì)胞毒性研究.云南中醫(yī)中藥雜志,2009,30（5）: 56-57.

13 何正春,王曉雨,楊雷香,等. 美洲大蠊提取物對(duì)3株人體生殖系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性研究. 西北藥學(xué)雜志,2009,24（4）: 271-272.

Impacts of Kangfuxin Decoction Combined with Cisplatin and Irinotecan on Cancer Cell Reproduction and Hemopoietic System in Tumor-Bearing Mice

Zou Junbo,Xiong Yongai

(The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine / Key Laboratory of Systematic Research / Development and Utilization of Chinese Medicine Resources in Sichuan Province Key Laboratory Breeding Base of Co-Founded by Sichuan Province and MOST,Pharmacy College,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 610075,China)

This study aimed to investigate the effects of Kangfuxin decoction （KFXD） combined with cisplatin and irinotecan on HCT116 cells reproduction and hemopoietic system in tumor-bearing mice. 110 C57BL/6 mice were implanted with HCT116 cells through abdominal injection,while 90 mice were randomly divided into the model group,the KFXD group,the cisplatin group,KFXD + cisplatin group,the irinotecan group and KFXD + irinotecan group. Mice of each group had been administered by corresponding medication for 16 days. The body weight were detected every 3 days. Blood routine examination were observed,while neoplastic tissues were separated and measured,FBW / IBW was counted,and DNA content of marrow,progenitor colony assay and expression rates of medullary cell CD34+were also measured and analyzed,respectively. It was found that in the medication groups the weights of neoplastic tissues were decreased compared with the model group （P＜ 0.05）,while the levels of WBC,PLT,RBC and HGB of KFXD and the relevant combination groups were obviously increased （P ＜ 0.05,P ＜ 0.01,respectively）. Routine blood indexes,DNA content of marrow,progenitor colony assay and expression rates of medullary cell CD34+in the cisplatin group and the irinotecan group were decreased（P ＜ 0.05,P ＜ 0.01,respectively）. Compared with the cisplatin geoup and the irinotecan group, levels of PLT,RBC and HGB of relevant the combination groups were increased （P ＜ 0.05,P ＜ 0.01,respectively）,DNA content of marrow,progenitor colony assay and expression rates of medullary cell CD34+in the relevant combination groups were also increased （P ＜ 0.05,P ＜ 0.01,respectively）. It was concluded that KFXD inhibited the growth of HCT116 cells in the tumor tissues of mice,and improved the suppressant of bone marrow caused by cisplatin and irinotecan in the drug combination. The prospect of combination of KFXD and initial antitumor drugs were spacious.

Kangfuxin decoction,colorectal cancer,cisplatin,irinotecan,drug combination

10.11842/wst.2016.05.022

R285.5

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2015-12-12

修回日期：2016-03-12

＊ 國(guó)家自然科學(xué)基金委青年項(xiàng)目（30902005）：基于本草挖掘的中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)理研究—蜣螂抗良性前列腺增生癥的實(shí)驗(yàn)研究，負(fù)責(zé)人：譚承佳；四川省科技廳項(xiàng)目（2014TD0007）：中藥藥理四川省青年科技創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)，負(fù)責(zé)人：曾南。

＊＊ 通訊作者：鄒俊波，博士，主要研究方向：中藥藥效與毒理學(xué)。