川芎赤芍對腦缺血再灌注大鼠模型GFAP、VEGF及Notch1表達(dá)的影響＊

馬 進(jìn)，甘 雨，袁 媛，黃 赫，焦富英，喬 鐵，崔英海

（1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院 沈陽 110034；2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 沈陽 110032）

川芎赤芍對腦缺血再灌注大鼠模型GFAP、VEGF及Notch1表達(dá)的影響＊

馬 進(jìn)1＊＊，甘 雨1，袁 媛1，黃 赫1，焦富英1，喬 鐵2，崔英海1

（1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院 沈陽 110034；2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 沈陽 110032）

目的：本研究主要觀察川芎赤芍對大鼠腦梗死再灌注后外周血膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和腦內(nèi)Notch1表達(dá)的影響。方法：采用線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型，將健康SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白組、模型組、川芎赤芍低劑量組、川芎赤芍高劑量組、銀杏葉片組。采用ELISA法測定大鼠外周血GFAP、VEGF含量，采用real-time PCR法檢測缺血腦組織Notch1 mRNA表達(dá)。結(jié)果：與模型組相比，川芎赤芍能夠提高外周血GFAP、VEGF水平，上調(diào)腦組織Notch1 mRNA的表達(dá)。結(jié)論：川芎赤芍可升高缺血再灌注大鼠外周血GFAP、VEGF的水平及缺血腦組織Notch1 mRNA的表達(dá)。

腦缺血再灌注 川芎 赤芍 膠質(zhì)纖維酸性蛋白 血管內(nèi)皮生長因子 Notch1

急性腦血管病是目前導(dǎo)致人類死亡的第二大因素，對老年人的健康危害嚴(yán)重[1]。缺血性腦卒中的病因主要是血管性的，但是腦功能的主要承擔(dān)者是神經(jīng)細(xì)胞，由缺血造成的神經(jīng)細(xì)胞不可逆損傷一直是人們研究的重點(diǎn)，并誕生了一系列的神經(jīng)保護(hù)策略[2]。川芎赤芍是傳統(tǒng)名方及現(xiàn)代經(jīng)常一起配伍應(yīng)用的藥對，具有行氣活血化瘀功效。本研究觀察川芎赤芍配伍應(yīng)用對大鼠腦缺血膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及Notch1的影響，探討其調(diào)控腦缺血損傷腦保護(hù)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

選用健康雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量240-260 g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司[許可證編號：SYXK（遼）2012-0003]。川芎和赤芍（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院），銀杏葉片（安徽圣鷹藥業(yè)有限公司，批號：150806。血管內(nèi)皮生長因子ELISA試劑盒（北京誠林生物科技有限公公司,批號：E-30443）。膠質(zhì)纖維酸性蛋白ELISA試劑盒（北京誠林生物科技有限公司，批號：E-33093）。MagNA Pure LC RNA Isolation Kit（瑞士羅氏公司，批號：11471300），PrimeScript RT reagent Kit（日本TaKaRa公司，批號：AK3401）。MagNA Lyser Green Beads（瑞士羅氏公司，批號：03358941001)。

1.2 模型制備

采用線栓法制備大鼠大腦中動脈局灶性腦缺血再灌注模型[3]，步驟為：3%水合氯醛腹腔注射麻醉后，將SD大鼠仰臥固定于手術(shù)臺，在頸部正中劃開長約3厘米的切口，鈍性分離皮下筋膜和肌肉組織，暴露頸前肌群，將肌肉向兩側(cè)分開，完全暴露出右側(cè)頸總動脈；接著用眼科鑷和眼科剪分離出右側(cè)頸內(nèi)、外動脈，在頸內(nèi)外動脈分叉處用4號線結(jié)扎頸外動脈，右側(cè)頸總動脈處剪一約0.5 mm小切口，插入頭端圓鈍直徑為0.28 mm 的栓線，進(jìn)栓線長度約18-19 mm，在大腦中動脈起始端線栓大鼠大腦中動脈。手術(shù)區(qū)使用少許青霉素粉,逐層縫合手術(shù)切口后用碘伏進(jìn)行皮膚消毒。手術(shù)中采用加熱毛毯保持大鼠體溫直至清醒。術(shù)后單籠飼養(yǎng)，栓塞2 h后取出栓線。

動物清醒2 h后參照Longa Z[4]的5分制法進(jìn)行神經(jīng)功能評分，分值在1-3分者入組。評分標(biāo)準(zhǔn)為：0分：無神經(jīng)損傷癥狀；1分：不能完全伸展對側(cè)前爪；2分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。神經(jīng)功能評分分?jǐn)?shù)越高，神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重，反之亦然。未到時間點(diǎn)死亡等不足動物隨機(jī)替補(bǔ)。

1.3 分組與給藥

按照隨機(jī)數(shù)字表分為：①空白組：正常大鼠不手術(shù)、②模型組、③川芎赤芍低劑量組、④川芎赤芍高劑量組、⑤銀杏葉片組，每組24只，②-⑤組根據(jù)缺血2 h再灌注后3天、7天、14天各分3個亞組。銀杏葉片配制成濃度為0.32 g·mL-1，川芎、赤芍提取液濃度為1.08 g生藥/mL，原液稀釋后取得1.08 g·mL-1、0.54 g·mL-1的高劑量、低劑量兩組。川芎赤芍高、低劑量組按相應(yīng)劑量給藥，銀杏葉提取物組予銀杏葉提取物，空白組、模型組動物均給予等體積無菌蒸餾水，自由飲食、活動。

1.4 ELISA法測定外周血GFAP和VEGF

各組大鼠于3天、7天、14天取材，每組8只。采用腹主動脈采血法，待血標(biāo)本靜置2 h后，置于4℃離心機(jī)內(nèi)，以3 000 r·min-1離心15 min，取血清置-20℃冰箱待用。按ELISA 試劑盒內(nèi)說明書進(jìn)行檢測。

1.5 real-time PCR檢測Notch1 mRNA的表達(dá)

采用羅氏全自動核酸提取系統(tǒng)（MPLC 2.0）提取缺血腦組織總RNA，測定Notch1 RNA 濃度。羅氏cDNA合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，在羅氏PCR儀上檢測Notch1 mRNA 的吸光度。實(shí)驗(yàn)采取3次生物學(xué)重復(fù)、3次實(shí)驗(yàn)學(xué)重復(fù)取平均值以避免誤差。采用2-ΔΔCT的方法計算Notch1 mRNA的相對表達(dá)量。引物如下：Notch1：Forward：GTTTGTGCAAGGATGGTGTG，Reverse：CCTTGAGGCATAAGCAGAGG；Actb：Forward：AGCCATGTACGTAGCCATCC，Reverse：CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA。PCR反應(yīng)條件：95℃10 min，95℃ 10 s，55℃ 20 s，72℃ 20 s，共40個循環(huán)，95℃ 5s，65℃ 1 min，4℃ 30 s。

1.6 TTC染色觀察腦梗死面積

各組大鼠在7天后用3%水合氯醛麻醉，斷頭取腦。將大鼠大腦置于-20℃冷凍20 min后，去掉嗅球、小腦和低位腦干，冠狀切分腦組織成5片。用2%的紅四氮唑?qū)⒛X片染色，37℃培養(yǎng)箱中避光染色30 min，期間不斷翻轉(zhuǎn)腦片，使兩面染色均勻。正常腦組織呈紅色，而梗死腦組織為白色。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 川芎赤芍對大鼠腦梗死面積的影響

如圖1所示，除空白組無梗死灶外，其余各組大鼠均出現(xiàn)不同程度的腦梗死。與模型對照組相比，川芎赤芍低、高劑量組，銀杏葉片組大鼠腦梗死灶面積明顯減少。

2.2 川芎赤芍對各組大鼠外周血GFAP含量的影響

給藥3天、7天、14天后，與空白組相比，模型組、川芎赤芍低劑量組、川芎赤芍高劑量組、銀杏葉組GFAP水平均明顯升高（P＜0.05），與模型組相比，川芎赤芍低劑量組、川芎赤芍高劑量組和銀杏葉組GFAP水平明顯升高（P＜0.05）。以上結(jié)果提示川芎赤芍可能通過調(diào)節(jié)與神經(jīng)再生有關(guān)因子的變化，促進(jìn)了神經(jīng)功能修復(fù)。詳見表1。

2.3 川芎赤芍對各組大鼠外周血VEGF表達(dá)的影響

給藥3天、7天、14天后，與空白組相比，模型組、川芎赤芍低劑量組、川芎赤芍高劑量組、銀杏葉組大鼠外周血VEGF水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，川芎赤芍低劑量組、川芎赤芍高劑量組、銀杏葉組VEGF水平明顯升高（P＜0.05）。詳見表2。

2.4 川芎赤芍對各組大鼠腦組織Notch1 mRNA表達(dá)的影響

給藥3天、7天、14天后，與空白組相比，模型組、川芎赤芍低劑量組、川芎赤芍高劑量組和銀杏葉組大鼠腦組織Notch1 mRNA表達(dá)增加（P＜0.05）；與模型組相比，川芎赤芍低劑量組、川芎赤芍高劑量組和銀杏葉組腦組織Notch1 mRNA表達(dá)增加（P＜0.05）。以上結(jié)果提示川芎赤芍對腦缺血損傷后Notch1 mRNA表達(dá)水平有影響，提示川芎赤芍可能增加具有血管新生因子作用。詳見表3。

圖1 TTC 染色大鼠腦切片

表1 川芎赤芍對各組大鼠外周血GFAP含量的影響/pg·mL-1（±s，n=8）

表1 川芎赤芍對各組大鼠外周血GFAP含量的影響/pg·mL-1（±s，n=8）

注：與空白組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

組別 3天 7天 14天空白組 274.00±52.43 283.88±45.46 287.38±54.56模型組 413.25±74.05* 451.75±46.59* 417.25±60.93*川芎赤芍低劑量組 527.00±75.42*# 539.63±67.13*# 527.88±61.42*#川芎赤芍高劑量組 503.50±57.92*# 525.88±44.42*# 505.63±46.70*#銀杏葉組 489.88±51.25*# 510.00±65.01*# 487.38±61.31*#

表2 川芎赤芍對各組大鼠外周血VEGF表達(dá)的影響/pg·mL-1（±s，n=8）

表2 川芎赤芍對各組大鼠外周血VEGF表達(dá)的影響/pg·mL-1（±s，n=8）

注：與空白組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

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表3 川芎赤芍對各組大鼠腦組織Notch1 mRNA表達(dá)的影響（-±s，n=8）

表3 川芎赤芍對各組大鼠腦組織Notch1 mRNA表達(dá)的影響（-±s，n=8）

注：與空白組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

組別 3天 7天 14天空白組 0.60±0.06 0.64±0.05 0.59±0.08模型組 1.15±0.17* 1.42±0.09* 1.26±0.16*川芎赤芍低劑量組 1.87±0.17*# 2.22±0.16*# 2.09±0.18*#川芎赤芍高劑量組 1.95±0.14*# 2.30±0.15*# 2.21±0.16*#銀杏葉組 1.84±0.13*# 2.18±0.15*# 2.05±0.16*#

3 討論

GFAP 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特有的細(xì)胞骨架蛋白，是星形膠質(zhì)細(xì)胞主要的中間絲蛋白，公認(rèn)為是星形細(xì)胞的特征性標(biāo)志蛋白。GFAP對于維持星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定是至關(guān)重要的，并決定著星形膠質(zhì)細(xì)胞對損傷反應(yīng)的程度。在正常情況下,星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要膠質(zhì)細(xì)胞，對于神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)、支持及參與其代謝的作用[5]。有研究發(fā)現(xiàn)[6]通過對血清膠質(zhì)纖維酸性蛋白濃度變化的動態(tài)觀察，可為顱腦損傷程度的判斷提供較為實(shí)用的指標(biāo)；監(jiān)測血清膠質(zhì)纖維酸性蛋白濃度，聯(lián)合CT影像學(xué)改變，可更準(zhǔn)確地判斷病情。有研究報道，血清膠質(zhì)纖維酸性蛋白在維持星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和功能上都有作用，它在細(xì)胞核和細(xì)胞膜之間形成連接，參與了細(xì)胞內(nèi)骨架重建、細(xì)胞黏附、維持腦內(nèi)髓鞘形成和神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整以及作為細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等[7]。

VEGF是最早用于腦缺血疾病研究的血管生長因子，是血管生成的關(guān)鍵性因子之一，VEGF表達(dá)可在腦缺血缺氧的誘導(dǎo)下迅速增多，啟動血管生成，改善腦循環(huán)，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。有研究表明[8]，VEGF 在病理過程中參與神經(jīng)和血管的重塑。Silvare等[9]通過向腦缺血的大鼠模型腦內(nèi)注射VEGF，發(fā)現(xiàn)具有一定神經(jīng)保護(hù)功能。有研究者[10]發(fā)現(xiàn)腦梗死患者血清 VEGF 濃度與新生血管形成及腦神經(jīng)功能恢復(fù)有關(guān)，但目前其濃度還不能作為評判神經(jīng)功能康復(fù)程度的指標(biāo)。有研究顯示[11]，急性腦梗死患者血清VEGF和VEGFR 水平于發(fā)病后至第 14 天呈現(xiàn)持續(xù)高表達(dá)狀態(tài)。VEGF可在血管新生及神經(jīng)保護(hù)等方面發(fā)揮生物學(xué)保護(hù)作用，改善預(yù)后。VEGF 在血管生成方面作用最強(qiáng)，已經(jīng)成為治療性血管形成的研究重點(diǎn)。

Notch1是細(xì)胞膜上的跨膜受體分子蛋白，通過細(xì)胞分子間的相互作用，介導(dǎo)體內(nèi)多種重要的生物學(xué)功能，包括器官發(fā)生、干細(xì)胞的自我更新、細(xì)胞分化和死亡等。從人的出生到死亡的生命過程，Notch1 對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能發(fā)揮都起到了至關(guān)重要的作用。在神經(jīng)系統(tǒng)的整個發(fā)育過程中，Notch1維持了神經(jīng)干細(xì)胞的未分化狀態(tài)，調(diào)控著神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新和分化過程；亦有研究表明血管內(nèi)皮生長因子與Notch信號通路交互對話對動靜脈分化起著舉足輕重的調(diào)控作用。在缺少血管內(nèi)皮生長因子信號的斑馬魚胚胎，背大動脈內(nèi)皮Notch信號通路不會激活，但是在這些胚胎中過表達(dá)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，可以維持動脈表型，提示Notch信號通路處于血管內(nèi)皮生長因子下游介導(dǎo)動脈分化行為[12-15]。有研究表明，GFAP 表達(dá)與Notch1 呈正相關(guān)， 神經(jīng)元特異性烯醇化酶與GFAP均可以作用于Notch1 受體，進(jìn)而調(diào)控下游基因的表達(dá)[16]。

中藥治療缺血性腦血管病的療效確切，是通過多途徑、多靶點(diǎn)的作用機(jī)制而實(shí)現(xiàn)的。

腦缺血后促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)和完整性是至關(guān)重要的。川芎赤芍為經(jīng)典名方血府逐瘀湯的主要組成藥物，在臨床上兩藥常作為藥對配伍運(yùn)用，具有行氣活血的作用。經(jīng)檢索《普濟(jì)方》數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)，同時含川芎赤芍的方劑多達(dá)3 546首，現(xiàn)代藥理研究表明，兩藥合用對腦缺血有改善作用[17]。本研究顯示，川芎赤芍能提高 GFAP水平及Notch1 mRNA的表達(dá)。GFAP能產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)因子，有利于神經(jīng)元的修復(fù)，Notch信號通路與神經(jīng)增殖與分化有密切關(guān)系，可見川芎赤芍配伍應(yīng)用對腦缺血后神經(jīng)元的修復(fù)新生起作用，進(jìn)而起到腦保護(hù)作用。

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Effects of Ligusticum Chuanxiong and Radix Paeoniae Rubra on the Expressions of GFAP,VEGF and Notch1 in Rats with Cerebral Ischemia-Reperfusion

Ma Jin1,Gan Yu1,Yuan Yuan1,Huang He1,Jiao Fuying1,Qiao Tie2,Cui Yinghai1
(1. Second Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110034,China; 2.School of Basic Medicine,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032,China)

This study aimed to elucidate the effects of Ligusticum Chuanxiong and Radix Paeoniae Rubra on plasma glial fibrillary acidic protein (GFAP) and vascular endothelial growth factor (VEGF),and Notch1 expression in the brain in rats with cerebral ischemia-reperfusion. The model of cerebral ischemia-reperfusion was established with suture-occluded method. SD rats were randomly divided into the control group,the model group,and low dose of Ligusticum Chuanxiong and Radix Paeoniae Rubra group (the low dose group),the high dose of Ligusticum Chuanxiong and Radix Paeoniae Rubra group,and the ginkgo leaf group. Levels of plasma GFAP and VEGF were detected by ELISA,while the Notch1 mRNA expression in the brain was quantified by real-time PCR. It was found that plasma GFAP and VEGF levels were increased in rats administered with Ligusticum Chuanxiong and Radix Paeoniae Rubra,while Notch1 mRNA expression was also up-regulated compared with the model tgroup. In conclusion,it was demonstrated that Ligusticum Chuanxiong and Radix Paeoniae Rubra enhanced the plasma GRAP and VEGF and cerebral Notch1 mRNA expressions in rats with cerebral ischemia-reperfusion.

Cerebral ischemia-reperfusion,Ligusticum Chuanxiong,Radix Paeoniae Rubra,glial fibrillary acidic protein,vascular endothelial growth factor,Notch1

10.11842/wst.2016.05.017

R2-031

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-05-02

修回日期：2016-05-11

＊ 遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（L2013362）：益氣活血法干預(yù)腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)保護(hù)實(shí)驗(yàn)研究，負(fù)責(zé)人：馬進(jìn)。

＊＊ 通訊作者：馬進(jìn)，博士后，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：中醫(yī)藥防治疾病的理論和臨床研究。