螺旋藻多糖對(duì)阿爾茨海默病模型小鼠腦線粒體氧化應(yīng)激保護(hù)

林智君，陳煜森，鄭選梅，尹小健，劉洲，賈真，趙江浩，趙斌

(1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 湛江 524001；2.嶺南師范學(xué)院體育科學(xué)學(xué)院，廣東 湛江 524048)

螺旋藻多糖對(duì)阿爾茨海默病模型小鼠腦線粒體氧化應(yīng)激保護(hù)

林智君1，陳煜森1，鄭選梅2，尹小健1，劉洲1，賈真1，趙江浩1，趙斌1

(1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 湛江 524001；2.嶺南師范學(xué)院體育科學(xué)學(xué)院，廣東 湛江 524048)

目的 探索螺旋藻多糖對(duì)D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉誘導(dǎo)的阿爾茨海默病(AD)模型小鼠腦線粒體損傷的抗氧化保護(hù)作用。方法小鼠腹腔注射D-半乳糖120 mg/kg和亞硝酸鈉100 mg/kg制備AD模型。將40只小鼠按數(shù)字編號(hào)隨機(jī)分為正常組(C組)、模型組(M組)以及3個(gè)劑量實(shí)驗(yàn)組，每組8只，3個(gè)劑量實(shí)驗(yàn)組分別給予螺旋藻多糖灌胃低劑量(El組)6.7 mg·kg-1·d-1，中劑量(Em組)67.0 mg·kg-1·d-1，高劑量(Eh組)134.0 mg·kg-1·d-1，連續(xù)8周，在給藥第8周后，進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和生化指標(biāo)測(cè)試。結(jié)果與M組相比，Em組、Eh組120 S內(nèi)跨越平臺(tái)的次數(shù)和在目標(biāo)象限的探索時(shí)間均明顯增加(P＜0.05)；小鼠腦部β淀粉樣蛋白(Aβ1～42)含量減少，依次是M組＞El組＞Em組＞C組＞Eh組。氧化應(yīng)激指標(biāo)：與M組相比，錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）活性均有提高(P＜0.05)，依次是C組(64.22±22.31)Um/mg＞Eh組(58.36±21.30)Um/mg＞Em組(56.58±15.66)Um/mg＞E1組(55.32±21.25)Um/mg＞M組(42.68±11.58)Um/mg；活性氧(NOS)含量Eh組(30.70±4.68)mmol/L顯著下降(P＜0.05)，丙二醛(MDA)活性Em、Eh組[(35.55±7.97)nmol/mg、(30.51±8.74)nmol/mg]顯著下降；與E1組相比，Eh組抗氧化效果最好。結(jié)論螺旋藻多糖對(duì)阿爾茨海默病模型小鼠腦線粒體氧化應(yīng)激有保護(hù)作用，是腦線粒體營(yíng)養(yǎng)素，高劑量效果最佳。

腦線粒體；螺旋藻多糖；阿爾茨海默?。谎趸瘧?yīng)激

β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積和神經(jīng)元纖維纏結(jié)以及突觸和神經(jīng)元的缺失是阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)的主要病理特征，主要集中在大腦皮質(zhì)和海馬，而且Aβ在本病形成的過(guò)程中起到了重要作用[1-2]。Aβ含有40～43個(gè)氨基酸殘基的多肽，具有神經(jīng)毒性。線粒體是細(xì)胞有氧呼吸的主要細(xì)胞器，是細(xì)胞的動(dòng)力工廠，線粒體提供細(xì)胞生命活動(dòng)所需80%以上能量，線粒體作為細(xì)胞的能量供應(yīng)站，供給神經(jīng)元幾乎全部能量需求，研究表明AD患者體內(nèi)均存在線粒體功能和線粒體結(jié)構(gòu)的異常導(dǎo)致線粒體損傷。同時(shí)線粒體損傷能誘導(dǎo)自由基的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。劉健康教授[3]把這些能促進(jìn)線粒體生成并改善或者修復(fù)線粒體功能的天然產(chǎn)物稱為線粒體營(yíng)養(yǎng)素，近年的研究提示線粒體是AD防治的新思路、新靶點(diǎn)。因此，尋找修復(fù)腦線粒體損傷的營(yíng)養(yǎng)素對(duì)當(dāng)前研究AD的防治方法具有重要作用。本文就以螺旋藻多糖對(duì)阿爾茨海默病模型小鼠腦線粒體氧化應(yīng)激保護(hù)展開分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與造模 清潔級(jí)昆明小鼠，4周齡，體質(zhì)量(40.1±4.3)g，雄性，由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)：44006400000035)，在自由攝食、飲水環(huán)境中適應(yīng)3 d后，用于實(shí)驗(yàn)。將40只小鼠隨機(jī)分5組：正常組、模型組以及3個(gè)劑量實(shí)驗(yàn)組分別為低劑量、中劑量、高劑量，各8只。除正常組以外，各組小鼠每天腹腔注射D-半乳糖120 mg/kg和亞硝酸鈉100 mg/kg，連續(xù)8周，制備AD小鼠模型。

1.2 藥物制備與給藥 螺旋藻多糖提取[4-5]螺旋藻干粉凍融、破壁、抽提取后離心去殘?jiān)?，上清液采用三氯乙酸沉淀去蛋白，用無(wú)水乙醇將上清液析出多糖淀，再用有機(jī)溶劑洗滌沉淀物，真空干燥得螺旋藻多糖粉末。正常組(腹腔注射同體積生理鹽水)，模型組(灌胃給予同體積生理鹽水)和低中、高3個(gè)劑量實(shí)驗(yàn)組(灌胃同體積的螺旋藻多糖溶液(6.7 mg·kg-1·d-1，67.0 mg·kg-1·d-1，134.0 mg·kg-1·d-1)，于造模當(dāng)天的每天下午4點(diǎn)開始灌胃給藥，連續(xù)8周(El組和Eh組實(shí)驗(yàn)中各死1只)。

1.3 行為學(xué)測(cè)試 在實(shí)驗(yàn)的第8周結(jié)束后采用Morris水迷宮檢測(cè)各組小鼠定位航行和空間探索行為能力。定位航行實(shí)驗(yàn)：將小鼠從4個(gè)標(biāo)記的入水點(diǎn)依次朝向池壁輕輕放入水中記錄小鼠尋找到并爬上平臺(tái)所用時(shí)間(120 s內(nèi))，即逃避潛伏期?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：撤除平臺(tái)，將小鼠放入水池中，記錄小鼠在穿越平臺(tái)的次數(shù)(120 s)。

1.4 小鼠腦線粒體樣本組織制備 根據(jù)朱宏亮文獻(xiàn)[6]，將小鼠麻醉后斷頭處死，取腦組織(海馬與皮質(zhì))加入分離介質(zhì)勻漿(測(cè)定Aβ1～42含量)；取部分腦組織勻漿液低溫離心，取上清液低溫離心棄上清，加入緩沖液，制成腦組織線粒體懸液。測(cè)定線粒體NOS，Mn-SOD，MDA酶活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 螺旋藻多糖對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 與M組比較，C、Em、Eh組潛伏期顯著縮短，跨越平臺(tái)次數(shù)顯著增多(P＜0.05)；，與E1組相比，Em組潛伏期顯著縮短(P＜0.05)；Eh組潛伏期顯著縮短，跨越平臺(tái)次數(shù)顯著增多(P＜0.05)，見表1。

表1 對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響(±s)

表1 對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響(±s)

注：與M組比較，aP＜0.05；與E1組比較，bP＜0.05。

組別 例數(shù) 潛伏期(s)跨越平臺(tái)次數(shù)C組M組El組Em組Eh組F值P值8 8 7 8 7 9.54±1.21a26.93±5.20 27.25±5.79 15.83±3.61ab11.23±3.11ab24.93 0.00 5.88±1.47a3.25±1.90 3.71±1.41 4.50±1.22a5.00±0.70ab6.34 0.01

2.2 螺旋藻多糖對(duì)小鼠腦線粒體的Aβ1～42含量變化 與M組比較，C、Eh組腦線粒體Aβ1～42含量顯著降低(P＜0.05)；其他組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見圖1。

圖1 各組小鼠腦線粒體Aβ1～42含量變化

2.3 螺旋藻多糖對(duì)小鼠腦線粒體氧化應(yīng)激指標(biāo)影響 與M組相比較，C組NOS，Mn-SOD，MDA差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；E1組Mn-SOD酶活性顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；Em組Mn-SOD，MDA差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；Eh組NOS，Mn-SOD，MDA差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與E1組比較，Eh組MDA顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；其他組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 各組小鼠腦線粒體NOS、Mn-SOD、MDA的含量(±s)

表2 各組小鼠腦線粒體NOS、Mn-SOD、MDA的含量(±s)

注：與M組比較，aP＜0.05；與E1組比較，bP＜0.05。

組別 只數(shù)NOS(mmol/L)Mn-SODU(Um/mg)MDAn(nmol/mg) C組M組El組Em組Eh組F值P值8 8 7 8 7 26.97±6.13ab35.60±5.32 35.99±7.46 34.53±5.67 30.70±4.68b3.29 0.02 64.22±22.31ab42.68±11.69 55.32±21.25ab56.58±15.66ab58.36±21.30ab2.58 0.05 28.38±9.39ab41.25±11.58 39.57±8.90 35.55±7.97ab30.51±8.74ab7.14 0.00

3 討 論

AD是進(jìn)行性神經(jīng)退變性疾病，目前病因尚未明確，其發(fā)病率隨著年齡的增長(zhǎng)而上升[7]，其主要病理特征是腦神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Aβ沉淀[8]。研究發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)Aβ的異常沉積導(dǎo)引起神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)毒性，可引起膜脂質(zhì)過(guò)氧化和通透性增加，誘發(fā)鈣離子內(nèi)流和升高鈣離子對(duì)各種刺激的反應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡。此外，Aβ還可增強(qiáng)或放大各種傷害性刺激，產(chǎn)生間接神經(jīng)毒性，會(huì)引起腦細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，破壞腦細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，激活膠質(zhì)細(xì)胞，產(chǎn)生炎癥物質(zhì)從而誘導(dǎo)腦細(xì)胞凋亡等。研究表明Aβ從腦細(xì)胞內(nèi)特別是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中產(chǎn)生，然后會(huì)逐漸在這些部位堆積，最后導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙[9-12]。自由基是導(dǎo)致線粒體功能損傷的直接原因，正常情況下自由基的產(chǎn)生和清除保持動(dòng)態(tài)平衡，然而，線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷打破了這種平衡，使大量自由基堆積，而過(guò)多的自由基或抗氧化物質(zhì)減少又可與線粒體膜脂蛋白相互作用進(jìn)一步加重線粒體和細(xì)胞的損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示M組的Aβ1～42含量都高于其他4組，而且除E1組以外其他三組(C、Em、Eh)與M組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，再一步證明本實(shí)驗(yàn)的模型是成功的，同時(shí)也表明螺旋藻多糖對(duì)清除Aβ的堆積和沉淀有顯著作用。

腦組織是人體內(nèi)氧負(fù)荷最大的器官之一，盡管人腦僅大約總重量的3%，卻消耗機(jī)體20%的氧，而且腦部的糖代謝、呼吸代謝、不飽和脂肪酸組成腦神經(jīng)元的膜結(jié)構(gòu)，以及反應(yīng)鐵離子較機(jī)體其他組織都高，這使得人體腦組織更容易受到氧化應(yīng)激的損傷，以及有一些抗氧化物質(zhì)不容易透過(guò)血腦屏障，因而也使得腦組織對(duì)氧化應(yīng)激特別敏感。線粒體是體內(nèi)生成腦細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的主要場(chǎng)所，研究已證實(shí)Aβ可以導(dǎo)致氧化應(yīng)激及ROS生成增加[13]，人體正常情況下線粒體在氧化磷酸化的過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生少量ROS，但在AD患者腦神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)因Aβ的沉積，ROS會(huì)大量生產(chǎn)，就會(huì)產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA，而體內(nèi)重要的抗氧化酶如Mn-SOD清除能力下降，當(dāng)機(jī)體自由基增多，超過(guò)了機(jī)體的清除能力，使得氧自由基的產(chǎn)生和抗氧化酶是處于一種動(dòng)態(tài)失衡狀態(tài)，從而破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，最后導(dǎo)致腦線粒體損傷。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Eh的NOS含量低于M組(P＜0.05)，而且El、Em組也有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而從Mn-SOD、MDA的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組抗氧化能力從強(qiáng)到弱依次是Eh組＞Em組＞El組，其中Eh組甚至逼近C組，表明服用螺旋藻多糖后，小鼠腦內(nèi)線粒體Mn-SOD活性增加，而MDA、NOS產(chǎn)物下降。從結(jié)果來(lái)看螺旋藻多糖AD小鼠的腦線粒體抗氧化性，清除自由基效果較好，其中高劑量組的效果最好，從而對(duì)小鼠的皮質(zhì)和海馬細(xì)胞起到保護(hù)作用。說(shuō)明服用螺旋藻多糖可以提高腦組織中某些抗氧化酶的活性，降低脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞膜的毒性效應(yīng)，從而保護(hù)因神經(jīng)毒性以及自由基產(chǎn)物損傷的腦線粒體損傷，腦部線粒的功能得到一定的修復(fù)。

螺旋藻是營(yíng)養(yǎng)全面、均衡的生物，是一種極具開發(fā)潛力的水生生物資源，被譽(yù)為21世紀(jì)最理想的綠色食品。螺旋藻含有多種生物活性，可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，提高免疫力，抗損傷、抗輻射、抗衰老、抗疲勞，對(duì)核酸內(nèi)切酶和DNA修復(fù)合成有增強(qiáng)作用。本實(shí)驗(yàn)AD小鼠服用不同劑量的的螺旋藻多糖，而且通過(guò)自身所含抗氧化物和提高機(jī)體Mn-SOD活性和降低MDA含量，達(dá)到減弱脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)有效清除自由基來(lái)延緩機(jī)體衰老，減少Aβ對(duì)腦的神經(jīng)毒性的效果，而且是高劑量的效果最佳。因此，螺旋藻多糖是作為抗氧化性獲得天然活性抗氧化劑的潛在寶貴資源，是AD腦線粒體的營(yíng)養(yǎng)素，被譽(yù)為微型綠色功能型營(yíng)養(yǎng)寶庫(kù)；同時(shí)本實(shí)驗(yàn)提示利用線粒體作為藥物運(yùn)載的靶點(diǎn)，修復(fù)線粒體損傷以及人為調(diào)整線粒體功能是治療AD的關(guān)鍵所在。

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Protective effect of spirulina polysaccharide against cerebral mitochondrial oxidative stress in Alzheimer's disease mice model.

LIN Zhi-jun1,CHEN Yu-sen1,ZHENG Xuan-mei2,YIN Xiao-jian1,LIU Zhou1,JIA Zhen1,ZHAO Jiang-hao1,ZHAO Bin1.1.Department of Neurology,the Affiliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang 524001,Guangdong,CHINA;2.College of Physical Education,Lingnan Normal University,Zhanjiang 524048,Guangdong, CHINA

ObjectiveTo study the protective effect of spirulina polysaccharide against cerebral mitochondrial oxidative stress induced by D-galactose and sodium nitrite in Alzheimer's disease(AD)mice model.MethodsA total of 40 mice were randomly divided into the normal group(C),model group(M),and other three experimental groups(spirulina polysaccharide,El group of 6.7 mg·kg-1·d-1,Em group of 67.0 mg·kg-1·d-1,and Eh group of 134.0 mg·kg-1·d-1,8 weeks), with 8 mice in each group.The model group and three experimental groups were injected with D-galactose 120 mg/kg and sodium nitrite 100 mg/kg for AD model.Morris water maze(MWM)experiment and Biochemical index test were performed after 8 weeks.ResultsCompared with group M,the number of crossed platform in 120 s and target exploration time in Em group and Eh group were significantly increased(P＜0.05);While the Aβ1～42content in brain were decreased with the order:M＞El＞Em＞C＞Eh.Compared with group M,the activity of manganese superoxide dismutase(MnSOD) were improved with the order:C[(64.22±22.31)Um/mg]＞Eh[(58.36±21.30)Um/mg]＞Em[(56.58±15.66)Um/mg]＞E1[(55.32±21.25)Um/mg]＞M[(42.68±11.58)Um/mg].The activities of reactive oxygen species(ROS)in Eh group [30.70±4.68 mmol/L]and Malondialdehyde(MDA)in Em group[(35.55±7.97)nmol/mg]and Eh group[(30.51±8.74)nmol/mg] were significantly decreased(P＜0.05).Compared with El group,Eh group had the best protective effect against oxidative stress.ConclusionSpirulina polysaccharide can protect AD model mice from the damage of cerebral mitochondrial oxidative stress,which is the nutrients of cerebral mitochondria,and high dose of spirulina polysaccharide has the best protective effect.

Cerebral mitochondria;Spirulina polysaccharide;Alzheimer's disease;Oxidative stress

R-332

A

1003—6350（2016）11—1731—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.11.003

2016-01-05)

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81400986)；廣東省自然科學(xué)基金(編號(hào)：2014A030313541)；廣東省湛江市科技攻關(guān)項(xiàng)目(編號(hào)：2014B01201)

陳煜森。E-mail：chenyusen925@163.com