STZ誘導(dǎo)的中老年食蟹猴糖尿病模型的初步分析

田朝陽(yáng)，王開(kāi)敏，洪傳緒，楊穎珊，張愛(ài)聯(lián)

(1.海南金港生物技術(shù)股份有限公司，海南 ?？?571100；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?571101)

STZ誘導(dǎo)的中老年食蟹猴糖尿病模型的初步分析

田朝陽(yáng)1，王開(kāi)敏1，洪傳緒1，楊穎珊1，張愛(ài)聯(lián)2

(1.海南金港生物技術(shù)股份有限公司，海南 ?？?571100；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?571101)

目的 初步探討鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的中老年食蟹猴糖尿病模型造模前后的體重、血糖和血脂等指標(biāo)的變化。方法5只健康中老年食蟹猴，根據(jù)年齡分為兩組：低劑量組(按體質(zhì)量計(jì)，50 mg/kg STZ)4只和高劑量組(按體質(zhì)量計(jì)，100 mg/kg STZ)1只。通過(guò)靜脈快速推注STZ的方法來(lái)誘導(dǎo)中老年食蟹猴發(fā)生糖尿病，造模前后對(duì)動(dòng)物體重、血糖和血脂等指標(biāo)進(jìn)行跟蹤檢測(cè)。結(jié)果通過(guò)靜脈快速推注STZ能夠在短時(shí)間內(nèi)快速升高血糖并持續(xù)保持高血糖的狀態(tài)，在外源胰島素注射干預(yù)的情況下造模動(dòng)物最長(zhǎng)存活可達(dá)233 d，發(fā)病過(guò)程中出現(xiàn)了“三多一少”的糖尿病典型癥狀，并伴有高甘油三酯血癥的發(fā)生。結(jié)論盡管與人類(lèi)糖尿病的病理過(guò)程存在一定差異，造模發(fā)病較為急促，成模率較高，但STZ靜脈注射誘導(dǎo)中老年食蟹猴發(fā)生糖尿病能夠?yàn)槿祟?lèi)糖尿病的基礎(chǔ)研究及相關(guān)藥效學(xué)評(píng)價(jià)提供食蟹猴動(dòng)物疾病模型，仍具有一定的科研應(yīng)用價(jià)值。

食蟹猴；鏈脲佐菌素；糖尿病

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是一種以糖代謝紊亂為主要表現(xiàn)的內(nèi)分泌代謝疾病，是以多食、多飲、多尿和體重減輕為特點(diǎn)的臨床癥狀[1]。鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)是建立誘導(dǎo)型糖尿病的傳統(tǒng)經(jīng)典方法，通過(guò)特異性損傷胰腺β細(xì)胞而被廣泛地應(yīng)用來(lái)創(chuàng)建糖尿病動(dòng)物模型[2]。非人靈長(zhǎng)類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(應(yīng)用最為廣泛的是獼猴屬的實(shí)驗(yàn)食蟹猴)是與人類(lèi)最為接近的高等級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其糖尿病模型能更好地模擬人類(lèi)糖尿病的病理過(guò)程，因而受到廣大科研工作者的重視和歡迎。本文采取STZ靜脈注射的方式誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)食蟹猴產(chǎn)生糖尿病，并對(duì)動(dòng)物體質(zhì)量、血糖和血脂等指標(biāo)進(jìn)行跟蹤與分析，為糖尿病動(dòng)物模型的建立提供一條研究途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 實(shí)驗(yàn)食蟹猴共5只，雄性2只，雌性3只。級(jí)別：普通級(jí)；年齡：5～14歲；體質(zhì)量：3～8 kg；動(dòng)物生產(chǎn)單位：海南金港生物技術(shù)股份有限公司[SCXK(瓊)2015-0001]；實(shí)驗(yàn)于海南金港生物技術(shù)股份有限公司的普通級(jí)非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行[SYXK (瓊)2014-0017]；飼養(yǎng)條件：?jiǎn)位\飼養(yǎng)，飼喂全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料和青飼料，自由飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前檢測(cè)空腹血糖(＜4.5 mmol/L)和甘油三酯(＜1.0 mmol/L)，結(jié)果均在正常范圍內(nèi)。依據(jù)年齡動(dòng)物分為低劑量組和高劑量組：低劑量組4只，按體質(zhì)量計(jì)，給予50 mg/kg STZ；高劑量組1只，按體質(zhì)量計(jì)，給予100 mg/kg STZ。

1.2 主要試劑與儀器 鏈脲佐菌素(STZ)為Sigma公司（美國(guó)）產(chǎn)品；檸檬酸由天津耀華化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；檸檬酸鈉由廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；氯胺酮由沈陽(yáng)獸藥廠生產(chǎn)；胰島素注射液由?？诟轻t(yī)院購(gòu)置。WP-UP-UV-10型純水機(jī)(四川沃特浦)；CT15RT型低溫離心機(jī)(上海天美)；安特衛(wèi)便攜式血糖儀及試紙；東芝120全自動(dòng)生化儀(日本)。

1.3 糖尿病模型制作 實(shí)驗(yàn)猴禁食＞16 h后肌注氯胺酮(按體質(zhì)量計(jì)，0.1 mL/kg)全身麻醉，一次性快速靜脈推注STZ(臨用前溶于0.1 mmol/L pH 4.2～4.5檸檬酸緩沖液中，現(xiàn)配現(xiàn)用)，劑量為按體質(zhì)量計(jì)50 mg/kg和100 mg/kg，靜脈推注時(shí)間控制在10 min之內(nèi)完成。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 體質(zhì)量監(jiān)測(cè) 為了觀察STZ誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)食蟹猴糖尿病模型前后體質(zhì)量的變化，定期稱(chēng)量食蟹猴體質(zhì)量，稱(chēng)量時(shí)間一般在早上動(dòng)物飼喂前(8:00～8:30)進(jìn)行，記錄稱(chēng)量結(jié)果，監(jiān)測(cè)造模前后體重變化情況。

1.4.2 血糖監(jiān)測(cè) 為了觀察STZ誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)食蟹猴糖尿病模型前后空腹血糖的變化，定期對(duì)食蟹猴空腹血糖進(jìn)行監(jiān)測(cè)，采血監(jiān)測(cè)血糖的時(shí)間一般在早上動(dòng)物飼喂前(8:00～8:30)進(jìn)行，采用安特衛(wèi)便攜式血糖儀及配套試紙條進(jìn)行測(cè)定。

1.4.3 血液生化指標(biāo)的監(jiān)測(cè) 為了觀察STZ誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)食蟹猴糖尿病模型血生化指標(biāo)的變化，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要對(duì)實(shí)驗(yàn)食蟹猴進(jìn)行采血監(jiān)測(cè)，送至中國(guó)人民解放軍第187中心醫(yī)院體檢中心檢驗(yàn)科進(jìn)行血液生化指標(biāo)的檢測(cè)。

1.4.4 胰島素注射干預(yù) 基于動(dòng)物的健康與代謝需要和延長(zhǎng)動(dòng)物的存活時(shí)間，我們會(huì)根據(jù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)展情況不定期肌注胰島素注射液進(jìn)行干預(yù)，干預(yù)時(shí)間一般在早上動(dòng)物空腹血糖監(jiān)測(cè)后(8:00～8：30)進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 5只實(shí)驗(yàn)食蟹猴的存活時(shí)間 高劑量組動(dòng)物存活時(shí)間僅有1 d，而低劑量組4只動(dòng)物最短存活時(shí)間為14 d，最長(zhǎng)存活時(shí)間為223 d。這表明STZ的注射用量跟動(dòng)物的存活時(shí)間有一定的相關(guān)性，用量越大動(dòng)物存活時(shí)間越短，尤其是大劑量注射極易導(dǎo)致動(dòng)物快速死亡，并且年齡越大對(duì)STZ的耐受性越差，所以注射劑量和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物年齡的選擇是采用該方法造模時(shí)需要注意的兩個(gè)重要事項(xiàng)。在實(shí)驗(yàn)后期每天肌肉注射胰島素0.2 mL(8 U)進(jìn)行干預(yù)以維持代謝穩(wěn)定及動(dòng)物的長(zhǎng)期存活[3]，最長(zhǎng)可維持動(dòng)物存活至223 d，見(jiàn)表1。

表1 5只實(shí)驗(yàn)食蟹猴的存活時(shí)間

2.2 4只存活時(shí)間較長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)食蟹猴的體質(zhì)量變化 STZ誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)食蟹猴糖尿病后導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)糖尿病的典型臨床癥狀“三多一少”(多飲、多食、多尿及日漸消瘦，體質(zhì)量減輕)，這點(diǎn)與人類(lèi)糖尿病的發(fā)病特征較為近似。與此同時(shí)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)造模動(dòng)物與一般正常動(dòng)物在外觀和氣味上存在明顯的差異，造模動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)被毛凌亂和體表骯臟，并散發(fā)出異常的氣味，尤其是糖尿病發(fā)病病程后期的動(dòng)物表現(xiàn)更為明顯。此方法應(yīng)作為后續(xù)糖尿病動(dòng)物模型建立或篩查的重要臨床觀察指標(biāo)，見(jiàn)圖1。

圖1 4只實(shí)驗(yàn)食蟹猴的體質(zhì)量變化圖

2.3 4只實(shí)驗(yàn)食蟹猴空腹血糖監(jiān)測(cè)結(jié)果 STZ注射誘導(dǎo)后1～2 d即出現(xiàn)空腹血糖值快速上升，遠(yuǎn)高于正常值，直至動(dòng)物死亡前均保持較高的水平。見(jiàn)圖2。

圖2 4只實(shí)驗(yàn)食蟹猴的空腹血糖值變化圖

2.4 3只存活時(shí)間較長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)食蟹猴的血生化檢測(cè)結(jié)果 與造模前結(jié)果比較，造模后空腹血糖值和甘油三酯值均顯著升高，見(jiàn)表2。

表2 3只實(shí)驗(yàn)食蟹猴的血生化檢測(cè)結(jié)果(mmol/L)

3 討 論

鏈脲佐菌素(STZ)是一種常用的致糖尿病毒素，能選擇性地破壞胰島β細(xì)胞，并已廣泛地用于嚙齒類(lèi)動(dòng)物、猴子和其他動(dòng)物中誘導(dǎo)胰島素依賴(lài)型糖尿病[4]。通過(guò)靜脈快速注射STZ能夠在較短時(shí)間內(nèi)升高血糖，并保持在較高的水平不降低，病程中出現(xiàn)了“三多一少”的糖尿病典型臨床病癥，后期并伴有高甘油三酯血癥的發(fā)生，這些均表明STZ對(duì)動(dòng)物胰腺β細(xì)胞的損傷是不可逆的。這種方法造出的實(shí)驗(yàn)食蟹猴糖尿病模型較為穩(wěn)定，成模率高。

按體質(zhì)量計(jì)，本文采取了100 mg/kg和50 mg/kg STZ注射誘導(dǎo)劑量，前者劑量過(guò)大，加上動(dòng)物年齡較大的原因?qū)е聞?dòng)物僅存活1 d，后者劑量較為適宜，誘導(dǎo)后在外源性胰島素注射干預(yù)下最長(zhǎng)存活時(shí)間可達(dá)223 d。由此表明，STZ劑量的選用及動(dòng)物年齡等都是需要重點(diǎn)考慮的因素。因?yàn)椴煌挲g的食蟹猴對(duì)STZ處理有不同反應(yīng)，Koulmanda等[5]在食蟹猴(3～6歲，3～9 kg)的研究中發(fā)現(xiàn)，55 mg/kg STZ能成功誘導(dǎo)食蟹猴糖尿病模型，且肝腎毒性很??；徐傳磊等[6]研究表明給4只食蟹猴靜脈注射STZ 45 mg/kg可在第3天出現(xiàn)空腹血糖濃度呈持續(xù)性升高。因此，只有選取了較為合適的注射劑量才能既達(dá)到造模效果又不至于導(dǎo)致動(dòng)物快速死亡的目的。筆者認(rèn)為，本研究中，STZ誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)食蟹猴糖尿病造模發(fā)病快，成模率高，成模后動(dòng)物的狀態(tài)較為穩(wěn)定持久，即使在外源性胰島素注射干預(yù)的情況下也不降低；STZ誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)食蟹猴糖尿病動(dòng)物模型在血糖升高的同時(shí)也導(dǎo)致脂代謝的紊亂，伴隨高甘油三酯血癥的發(fā)生，這點(diǎn)與人類(lèi)糖尿病的發(fā)病特征較為近似，針對(duì)中老年實(shí)驗(yàn)食蟹猴而言，50 mg/kg的STZ誘導(dǎo)劑量是較為合適的，它能夠在降低動(dòng)物死亡的情況下保證動(dòng)物較高的成模率。

總之，STZ誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)食蟹猴糖尿病動(dòng)物模型具有人類(lèi)糖尿病“三多一少”的典型臨床癥狀，并伴有高甘油三酯血癥的發(fā)生，其缺點(diǎn)是發(fā)病較為急促，與人類(lèi)糖尿病發(fā)病過(guò)程存在著一定的差異，因?yàn)槿祟?lèi)糖尿病的發(fā)生不是唯一病因所致的單一疾病，而是復(fù)合病因的綜合征，與遺傳、自身免疫及環(huán)境因素有關(guān)[7]。所以如何找尋出一種更符合人類(lèi)糖尿病發(fā)生發(fā)展過(guò)程的實(shí)驗(yàn)食蟹猴糖尿病模型仍需下一步繼續(xù)研究。

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Primary analysis of streptozotocin-induced diabetes mellitus in middle and old-aged cynomolgus monkeys.

TIAN Chao-yang1,WANG Kai-min1,HONG Chuan-xu1,YANG Ying-shan1,ZHANG Ai-lian2.1.Hainan Jingang Biotech Co., Ltd,Haikou 571100,Hainan,CHINA;2.Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Haikou 571101,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the changes of body weight,blood glucose and blood lipid of the streptozotocin(STZ)-induced diabetes mellitus in middle and old-aged cynomolgus monkeys.MethodsFive middle and old-aged cynomolgus monkeys were divided into two groups according to the age:low dose group(50 mg/kg STZ,n=4) and high dose group(100 mg/kg STZ,n=1).The two groups were induced by one-dose intravenous injection of streptozotocin.The body weight,blood glucose and blood lipid before and after induction were measured.ResultsIntravenous injection of streptozotocin could increase the food intake volume,water intake volume and urine volume,and decrease the body weight.Two days after the modeling,the fasting glucose was increased and kept a high level until death.Accompanied by the occurrence of hyperlipidemia,the model animals can live for up to 233 days under the intervention of exogenous insulin injection.ConclusionAlthough there are certain differences with diabetes mellitus in human,the incidence of modeling is more rapid and the formation rate is higher than human.The diabetes mellitus cynomolgus models induced by intravenous injection of STZ also have certain application value for human diabetes mellitus basic research and pharmacodynamics evaluation.

Cynomolgus monkeys;Streptozotocin;Diabetes mellitus

R-332

A

1003—6350（2016）14—2240—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.14.002

2016-03-03)

2007年海南省重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：070117)

田朝陽(yáng)。E-mail:chaoyangtian@163.com