STZ誘導(dǎo)的中老年食蟹猴糖尿病模型的初步分析

田朝陽，王開敏，洪傳緒，楊穎珊，張愛聯(lián)

(1.海南金港生物技術(shù)股份有限公司，海南 ?？?571100；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?571101)

STZ誘導(dǎo)的中老年食蟹猴糖尿病模型的初步分析

田朝陽1，王開敏1，洪傳緒1，楊穎珊1，張愛聯(lián)2

(1.海南金港生物技術(shù)股份有限公司，海南 ?？?571100；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?571101)

目的 初步探討鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的中老年食蟹猴糖尿病模型造模前后的體重、血糖和血脂等指標(biāo)的變化。方法5只健康中老年食蟹猴，根據(jù)年齡分為兩組：低劑量組(按體質(zhì)量計，50 mg/kg STZ)4只和高劑量組(按體質(zhì)量計，100 mg/kg STZ)1只。通過靜脈快速推注STZ的方法來誘導(dǎo)中老年食蟹猴發(fā)生糖尿病，造模前后對動物體重、血糖和血脂等指標(biāo)進(jìn)行跟蹤檢測。結(jié)果通過靜脈快速推注STZ能夠在短時間內(nèi)快速升高血糖并持續(xù)保持高血糖的狀態(tài)，在外源胰島素注射干預(yù)的情況下造模動物最長存活可達(dá)233 d，發(fā)病過程中出現(xiàn)了“三多一少”的糖尿病典型癥狀，并伴有高甘油三酯血癥的發(fā)生。結(jié)論盡管與人類糖尿病的病理過程存在一定差異，造模發(fā)病較為急促，成模率較高，但STZ靜脈注射誘導(dǎo)中老年食蟹猴發(fā)生糖尿病能夠為人類糖尿病的基礎(chǔ)研究及相關(guān)藥效學(xué)評價提供食蟹猴動物疾病模型，仍具有一定的科研應(yīng)用價值。

食蟹猴；鏈脲佐菌素；糖尿病

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是一種以糖代謝紊亂為主要表現(xiàn)的內(nèi)分泌代謝疾病，是以多食、多飲、多尿和體重減輕為特點的臨床癥狀[1]。鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)是建立誘導(dǎo)型糖尿病的傳統(tǒng)經(jīng)典方法，通過特異性損傷胰腺β細(xì)胞而被廣泛地應(yīng)用來創(chuàng)建糖尿病動物模型[2]。非人靈長類實驗動物(應(yīng)用最為廣泛的是獼猴屬的實驗食蟹猴)是與人類最為接近的高等級實驗動物，其糖尿病模型能更好地模擬人類糖尿病的病理過程，因而受到廣大科研工作者的重視和歡迎。本文采取STZ靜脈注射的方式誘導(dǎo)實驗食蟹猴產(chǎn)生糖尿病，并對動物體質(zhì)量、血糖和血脂等指標(biāo)進(jìn)行跟蹤與分析，為糖尿病動物模型的建立提供一條研究途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 實驗食蟹猴共5只，雄性2只，雌性3只。級別：普通級；年齡：5～14歲；體質(zhì)量：3～8 kg；動物生產(chǎn)單位：海南金港生物技術(shù)股份有限公司[SCXK(瓊)2015-0001]；實驗于海南金港生物技術(shù)股份有限公司的普通級非人靈長類動物實驗室進(jìn)行[SYXK (瓊)2014-0017]；飼養(yǎng)條件：單籠飼養(yǎng)，飼喂全價營養(yǎng)顆粒飼料和青飼料，自由飲水。動物實驗前檢測空腹血糖(＜4.5 mmol/L)和甘油三酯(＜1.0 mmol/L)，結(jié)果均在正常范圍內(nèi)。依據(jù)年齡動物分為低劑量組和高劑量組：低劑量組4只，按體質(zhì)量計，給予50 mg/kg STZ；高劑量組1只，按體質(zhì)量計，給予100 mg/kg STZ。

1.2 主要試劑與儀器 鏈脲佐菌素(STZ)為Sigma公司（美國）產(chǎn)品；檸檬酸由天津耀華化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；檸檬酸鈉由廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；氯胺酮由沈陽獸藥廠生產(chǎn)；胰島素注射液由?？诟轻t(yī)院購置。WP-UP-UV-10型純水機(jī)(四川沃特浦)；CT15RT型低溫離心機(jī)(上海天美)；安特衛(wèi)便攜式血糖儀及試紙；東芝120全自動生化儀(日本)。

1.3 糖尿病模型制作 實驗猴禁食＞16 h后肌注氯胺酮(按體質(zhì)量計，0.1 mL/kg)全身麻醉，一次性快速靜脈推注STZ(臨用前溶于0.1 mmol/L pH 4.2～4.5檸檬酸緩沖液中，現(xiàn)配現(xiàn)用)，劑量為按體質(zhì)量計50 mg/kg和100 mg/kg，靜脈推注時間控制在10 min之內(nèi)完成。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 體質(zhì)量監(jiān)測 為了觀察STZ誘導(dǎo)實驗食蟹猴糖尿病模型前后體質(zhì)量的變化，定期稱量食蟹猴體質(zhì)量，稱量時間一般在早上動物飼喂前(8:00～8:30)進(jìn)行，記錄稱量結(jié)果，監(jiān)測造模前后體重變化情況。

1.4.2 血糖監(jiān)測 為了觀察STZ誘導(dǎo)實驗食蟹猴糖尿病模型前后空腹血糖的變化，定期對食蟹猴空腹血糖進(jìn)行監(jiān)測，采血監(jiān)測血糖的時間一般在早上動物飼喂前(8:00～8:30)進(jìn)行，采用安特衛(wèi)便攜式血糖儀及配套試紙條進(jìn)行測定。

1.4.3 血液生化指標(biāo)的監(jiān)測 為了觀察STZ誘導(dǎo)實驗食蟹猴糖尿病模型血生化指標(biāo)的變化，根據(jù)實驗需要對實驗食蟹猴進(jìn)行采血監(jiān)測，送至中國人民解放軍第187中心醫(yī)院體檢中心檢驗科進(jìn)行血液生化指標(biāo)的檢測。

1.4.4 胰島素注射干預(yù) 基于動物的健康與代謝需要和延長動物的存活時間，我們會根據(jù)實驗進(jìn)展情況不定期肌注胰島素注射液進(jìn)行干預(yù)，干預(yù)時間一般在早上動物空腹血糖監(jiān)測后(8:00～8：30)進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 5只實驗食蟹猴的存活時間 高劑量組動物存活時間僅有1 d，而低劑量組4只動物最短存活時間為14 d，最長存活時間為223 d。這表明STZ的注射用量跟動物的存活時間有一定的相關(guān)性，用量越大動物存活時間越短，尤其是大劑量注射極易導(dǎo)致動物快速死亡，并且年齡越大對STZ的耐受性越差，所以注射劑量和實驗動物年齡的選擇是采用該方法造模時需要注意的兩個重要事項。在實驗后期每天肌肉注射胰島素0.2 mL(8 U)進(jìn)行干預(yù)以維持代謝穩(wěn)定及動物的長期存活[3]，最長可維持動物存活至223 d，見表1。

表1 5只實驗食蟹猴的存活時間

2.2 4只存活時間較長實驗食蟹猴的體質(zhì)量變化 STZ誘導(dǎo)實驗食蟹猴糖尿病后導(dǎo)致動物出現(xiàn)糖尿病的典型臨床癥狀“三多一少”(多飲、多食、多尿及日漸消瘦，體質(zhì)量減輕)，這點與人類糖尿病的發(fā)病特征較為近似。與此同時，實驗過程中發(fā)現(xiàn)造模動物與一般正常動物在外觀和氣味上存在明顯的差異，造模動物會出現(xiàn)被毛凌亂和體表骯臟，并散發(fā)出異常的氣味，尤其是糖尿病發(fā)病病程后期的動物表現(xiàn)更為明顯。此方法應(yīng)作為后續(xù)糖尿病動物模型建立或篩查的重要臨床觀察指標(biāo)，見圖1。

圖1 4只實驗食蟹猴的體質(zhì)量變化圖

2.3 4只實驗食蟹猴空腹血糖監(jiān)測結(jié)果 STZ注射誘導(dǎo)后1～2 d即出現(xiàn)空腹血糖值快速上升，遠(yuǎn)高于正常值，直至動物死亡前均保持較高的水平。見圖2。

圖2 4只實驗食蟹猴的空腹血糖值變化圖

2.4 3只存活時間較長實驗食蟹猴的血生化檢測結(jié)果 與造模前結(jié)果比較，造模后空腹血糖值和甘油三酯值均顯著升高，見表2。

表2 3只實驗食蟹猴的血生化檢測結(jié)果(mmol/L)

3 討 論

鏈脲佐菌素(STZ)是一種常用的致糖尿病毒素，能選擇性地破壞胰島β細(xì)胞，并已廣泛地用于嚙齒類動物、猴子和其他動物中誘導(dǎo)胰島素依賴型糖尿病[4]。通過靜脈快速注射STZ能夠在較短時間內(nèi)升高血糖，并保持在較高的水平不降低，病程中出現(xiàn)了“三多一少”的糖尿病典型臨床病癥，后期并伴有高甘油三酯血癥的發(fā)生，這些均表明STZ對動物胰腺β細(xì)胞的損傷是不可逆的。這種方法造出的實驗食蟹猴糖尿病模型較為穩(wěn)定，成模率高。

按體質(zhì)量計，本文采取了100 mg/kg和50 mg/kg STZ注射誘導(dǎo)劑量，前者劑量過大，加上動物年齡較大的原因?qū)е聞游飪H存活1 d，后者劑量較為適宜，誘導(dǎo)后在外源性胰島素注射干預(yù)下最長存活時間可達(dá)223 d。由此表明，STZ劑量的選用及動物年齡等都是需要重點考慮的因素。因為不同年齡的食蟹猴對STZ處理有不同反應(yīng)，Koulmanda等[5]在食蟹猴(3～6歲，3～9 kg)的研究中發(fā)現(xiàn)，55 mg/kg STZ能成功誘導(dǎo)食蟹猴糖尿病模型，且肝腎毒性很小；徐傳磊等[6]研究表明給4只食蟹猴靜脈注射STZ 45 mg/kg可在第3天出現(xiàn)空腹血糖濃度呈持續(xù)性升高。因此，只有選取了較為合適的注射劑量才能既達(dá)到造模效果又不至于導(dǎo)致動物快速死亡的目的。筆者認(rèn)為，本研究中，STZ誘導(dǎo)的實驗食蟹猴糖尿病造模發(fā)病快，成模率高，成模后動物的狀態(tài)較為穩(wěn)定持久，即使在外源性胰島素注射干預(yù)的情況下也不降低；STZ誘導(dǎo)的實驗食蟹猴糖尿病動物模型在血糖升高的同時也導(dǎo)致脂代謝的紊亂，伴隨高甘油三酯血癥的發(fā)生，這點與人類糖尿病的發(fā)病特征較為近似，針對中老年實驗食蟹猴而言，50 mg/kg的STZ誘導(dǎo)劑量是較為合適的，它能夠在降低動物死亡的情況下保證動物較高的成模率。

總之，STZ誘導(dǎo)的實驗食蟹猴糖尿病動物模型具有人類糖尿病“三多一少”的典型臨床癥狀，并伴有高甘油三酯血癥的發(fā)生，其缺點是發(fā)病較為急促，與人類糖尿病發(fā)病過程存在著一定的差異，因為人類糖尿病的發(fā)生不是唯一病因所致的單一疾病，而是復(fù)合病因的綜合征，與遺傳、自身免疫及環(huán)境因素有關(guān)[7]。所以如何找尋出一種更符合人類糖尿病發(fā)生發(fā)展過程的實驗食蟹猴糖尿病模型仍需下一步繼續(xù)研究。

[1]和占龍,魯帥堯,趙遠(yuǎn),等.獼猴自發(fā)性糖尿病的臨床病理學(xué)分析[J].中國獸醫(yī)科技,2001,31(11):40-41.

[2]梁斌,吳曉云.非人靈長類糖尿病動物模型研究進(jìn)展[J].動物學(xué)研究,2011,32(1):91-96.

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[4]鄒春林,王佳茵,黃淑艷,等.不同劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)青少年食蟹猴糖尿病模型的特性[J].中國科學(xué):生命科學(xué),2012,42(7): 562-571.

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[6]徐傳磊,陳艷明,徐志勇,等.建立食蟹猴糖尿病模型的研究[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2009,26(1):91-94.

[7]覃雯,唐愛華.糖尿病實驗性動物模型研究概況[J].時珍國醫(yī)國藥, 2007,18(6):1511-1512.

Primary analysis of streptozotocin-induced diabetes mellitus in middle and old-aged cynomolgus monkeys.

TIAN Chao-yang1,WANG Kai-min1,HONG Chuan-xu1,YANG Ying-shan1,ZHANG Ai-lian2.1.Hainan Jingang Biotech Co., Ltd,Haikou 571100,Hainan,CHINA;2.Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Haikou 571101,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the changes of body weight,blood glucose and blood lipid of the streptozotocin(STZ)-induced diabetes mellitus in middle and old-aged cynomolgus monkeys.MethodsFive middle and old-aged cynomolgus monkeys were divided into two groups according to the age:low dose group(50 mg/kg STZ,n=4) and high dose group(100 mg/kg STZ,n=1).The two groups were induced by one-dose intravenous injection of streptozotocin.The body weight,blood glucose and blood lipid before and after induction were measured.ResultsIntravenous injection of streptozotocin could increase the food intake volume,water intake volume and urine volume,and decrease the body weight.Two days after the modeling,the fasting glucose was increased and kept a high level until death.Accompanied by the occurrence of hyperlipidemia,the model animals can live for up to 233 days under the intervention of exogenous insulin injection.ConclusionAlthough there are certain differences with diabetes mellitus in human,the incidence of modeling is more rapid and the formation rate is higher than human.The diabetes mellitus cynomolgus models induced by intravenous injection of STZ also have certain application value for human diabetes mellitus basic research and pharmacodynamics evaluation.

Cynomolgus monkeys;Streptozotocin;Diabetes mellitus

R-332

A

1003—6350（2016）14—2240—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.14.002

2016-03-03)

2007年海南省重點科技計劃項目(編號：070117)

田朝陽。E-mail:chaoyangtian@163.com