中華絨螯蟹可視熒光標記應(yīng)用研究

李晶晶，耿緒云，董學旺，魏俊利，孫金生，3，邱高峰

（1.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海201306；2.天津市水生動物疫病預防控制中心，天津300221；3.天津師范大學生命科學學院，天津300387）

中華絨螯蟹可視熒光標記應(yīng)用研究

李晶晶1，2，3，耿緒云2，董學旺2，魏俊利2，孫金生2，3，邱高峰1

（1.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海201306；2.天津市水生動物疫病預防控制中心，天津300221；3.天津師范大學生命科學學院，天津300387）

采用紅色可視嵌入性熒光（visible implantelastomer，VIE）標記中華絨螯蟹（Eriocheir Sinensis），觀察了熒光標記在中華絨螯蟹中的保持率和對其存活、生長、發(fā)育及繁殖的影響。熒光標記幼蟹不同部位在室內(nèi)飼養(yǎng)并觀察8周，結(jié)果表明，在中華絨螯蟹幼蟹不同部位的標記保持率均為100%，對照組和各試驗組幼蟹的存活率無顯著性差異（P＞0.05）。熒光標記幼蟹螯掌節(jié)和腕節(jié)間的關(guān)節(jié)膜后移入室外養(yǎng)殖池養(yǎng)殖，中華絨螯蟹室外養(yǎng)殖的生長和發(fā)育速度與對照組也無顯著差異（P＞0.05）。挑選標記后經(jīng)室外池塘養(yǎng)成的中華絨螯蟹進行小水體繁育實驗，抱卵率為83.3%，平均抱卵量30×104egg·ind－1，與未標記中華絨螯蟹小水體繁育實驗結(jié)果比較，抱卵率、平均抱卵量無顯著性差異，熒光標記不影響中華絨螯蟹交配抱卵。本文結(jié)果表明，VIE可視熒光標記可作為中華絨螯蟹個體識別標記，應(yīng)用于育種、資源調(diào)查等研究和生產(chǎn)實踐。

中華絨螯蟹；熒光標記VIE；存活率；標記保持率；生長；繁殖

中華絨螯蟹（Eriocheir Sinensis）俗稱河蟹，是我國重要經(jīng)濟甲殼動物之一，主要分布于長江、遼河、甌江等水域。經(jīng)過30余年的發(fā)展，中華絨螯蟹養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，養(yǎng)殖區(qū)遍布我國遼寧、河北、天津、山東、江蘇、浙江等沿海省份及廣大內(nèi)陸地區(qū)，已成為淡水漁業(yè)單品中產(chǎn)值最大的產(chǎn)業(yè)。規(guī)模化的養(yǎng)蟹業(yè)需要大量優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的苗種，這就為中華絨螯蟹選育研究和育種生產(chǎn)提出了更高的要求。同時，在市場需求和經(jīng)濟效益的推動下，過度捕撈、生長環(huán)境惡化等原因致使中華絨螯蟹自然資源越來越匱乏，增殖放流工作勢在必行［1］。育種工作尤其是家系選育，為消除環(huán)境差異的影響，確保獲得遺傳參數(shù)的準確性，需要對個體或群體進行標記區(qū)分；對增殖放流效果的科學評價也需要對放流生物進行標記和監(jiān)測，才能有利于漁業(yè)資源長期可持續(xù)發(fā)展。但是，由于中華絨螯蟹的形態(tài)和周期性蛻皮的特性限制了常規(guī)標記技術(shù)的應(yīng)用。

美國西北海洋技術(shù)公司（Northwest Marine Technology，INC）開發(fā)生產(chǎn)的可視嵌入式熒光（visible implant elastomer，VIE）標記，通過注射到動物個體的皮下或皮下的肌肉中進行標記，在魚、蝦、蟹等水產(chǎn)動物中取得了較好的應(yīng)用效果［2－10］，尤其在魚類中已被廣泛用于育種及增殖放流等研究，然而至今未見熒光標記在中華絨螯蟹中應(yīng)用的相關(guān)報道。作者嘗試利用可視嵌入式熒光標記中華絨螯蟹，評估其對蟹類存活、生長發(fā)育及繁殖的影響，以期為中華絨螯蟹人工選育和增殖放流效果評估提供可靠的標記技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗幼蟹取自天津市蟹源水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司河蟹養(yǎng)殖場，平均體長（22.79±1.96）mm，體寬（24.99±2.19）mm，體質(zhì)量（6.50±1.70）g。置室內(nèi)水槽充氣暫養(yǎng)1周后，選取健康幼蟹標記紅色可視嵌入式熒光（VIE）。實驗所用熒光標記購自美國西北海洋技術(shù)公司。

1.2 實驗分組和VIE熒光標記方法

中華絨螯蟹甲殼較厚，透明度差，所以選擇可識別度相對較高的部位進行熒光標記試驗。標記幼蟹室內(nèi)觀察實驗分為對照組（不標記）、復眼眼眶標記組、螯掌節(jié)和腕節(jié)間的關(guān)節(jié)膜標記組、腹甲標記組和腹部標記組，每組各30 ind，標記部位如圖1所示。

圖1 熒光標記部位Fig.1 Diagram of tag locations

依據(jù)操作的簡易可行性，熒光標記在螯掌節(jié)和腕節(jié)間的關(guān)節(jié)膜內(nèi)比標記其他部位操作更簡潔方便，幼蟹蛻殼后標記顏色更清晰，且存活率相對較高。所以，室外養(yǎng)殖實驗設(shè)置對照組和螯掌節(jié)和腕節(jié)間的關(guān)節(jié)膜標記組，每組各250 ind。采用注射方法標記熒光，注射劑量為3～5μL· ind－1，當殼下出現(xiàn)明顯的標記斑點時停止注射，將針頭緩慢抽出，并用酒精棉球輕按片刻，防止熒光染料溢出。熒光標記過程嚴格遵照VIE操作說明書（Northwest Marine Technology，Inc.，2008，visible implant elastomer tag project manual）。

1.3 養(yǎng)殖管理

標記的幼蟹于室內(nèi)養(yǎng)殖8周，對照組和4組標記幼蟹分別置于5個40 cm×60 cm×50 cm塑料培養(yǎng)箱中，24 h連續(xù)微充氣養(yǎng)殖。水溫保持在（23±1）℃，投喂幼蟹配合飼料2次·d－1，日投喂量約為體重的10%。利用虹吸方法清理殘餌、注入新水，日換水量50%以上。室外池塘養(yǎng)殖階段，熒光標記組和對照組分別投放于天津市蟹源水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司相鄰兩個667 m2的室外土池中，按七里海河蟹生態(tài)健康養(yǎng)殖技術(shù)規(guī)范管理［11］。

1.4 繁育實驗

在室外池塘養(yǎng)殖實驗中選取熒光標記保持完好的性成熟中華絨螯蟹為親本進行繁育實驗。實驗共分為3個平行組，每組4 ind成蟹，按照♀：♂比例3∶1分別置于室內(nèi)1 m3水體塑料圓缸中，缸底鋪設(shè)20 cm深的細沙，24 h連續(xù)微充氣。采用鹵淡水勾兌方式逐漸增加水體鹽度至20±2，日增加量＜5。投喂魚肉等高營養(yǎng)餌料，隨溫度變化調(diào)整投喂量，并及時清除殘餌。換水次數(shù)和換水量視水質(zhì)而定。經(jīng)過小水體催情、交配、抱卵和越冬，觀測記錄抱卵蟹數(shù)量及抱卵量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗蟹生物學數(shù)據(jù)以平均值±標準差（Mean ±SD）表示。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22統(tǒng)計軟件進行分析處理，列聯(lián)表（Crosstabs）分析幼蟹不同處理組存活率差異的顯著性；單因素方差分析（One-way，ANOVA）檢驗不同標記處理組和空白對照組的各項生長指標是否存在顯著性差異。應(yīng)用Excel 2007作圖，Photoshop 7.0處理圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光標記保持率及其對幼蟹存活的影響

幼蟹標記可視熒光后置于室內(nèi)水槽中養(yǎng)殖，每日觀察和記錄對照組和各試驗組幼蟹存活情況和標記保持效果，按下式計算即時死亡率、存活率和標記保持率。

即時死亡率＝24 h內(nèi)死亡幼蟹數(shù)/每組幼蟹數(shù)×100%

存活率＝存活幼蟹數(shù)/每組幼蟹數(shù)×100%

標記保持率＝能辨識出熒光標記的幼蟹數(shù)/用于檢測標記保持率的幼蟹數(shù)×100%

經(jīng)過8周的觀察和數(shù)據(jù)統(tǒng)計，不同部位標記的熒光保持率均為100%，標記幼蟹蛻殼正常，且對可視熒光的可視度無明顯影響。幼蟹熒光標記24 h后各試驗組即時死亡率均為0%，7 d后開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。8周內(nèi)，各組存活率如圖2所示，對照組存活率為58%，熒光標記組中螯掌節(jié)和腕節(jié)間的關(guān)節(jié)膜標記組幼蟹的存活率最高為53.3%，標記在復眼眼眶的一組存活率最低為36.7%，經(jīng)列聯(lián)表卡方檢驗表明各組幼蟹存活率無顯著性差異（P＞0.05）。

圖2 不同標記部位幼蟹的存活率Fig.2 Survival rate of different tag locations in juvenile crabs

2.2 熒光標記對幼蟹生長發(fā)育的影響

室外池塘養(yǎng)殖實驗選取熒光標記部位為螯掌節(jié)和腕節(jié)間的關(guān)節(jié)膜幼蟹。幼蟹入池前逐個測量初始體長、體寬和體質(zhì)量生長指標。養(yǎng)成后起捕全部中華絨螯蟹，再逐個測量上述3個生長指標，并檢查熒光標記保持效果，計算標記保持率和特定生長率（SGR）。

SGR＝（ln最終數(shù)據(jù)－ln初始數(shù)據(jù)）/實驗時間×100%

經(jīng)80 d土池養(yǎng)殖，對照組捕獲成蟹109 ind，熒光標記組捕獲成蟹103 ind，兩組存活率分別為43.6%和41.2%。熒光標記組中VIE標記可識的75 ind（圖3），標記保持率為72.8%。對照組和熒光標記組生長指標體長、體寬和體質(zhì)量變化情況見表1，單因素方差分析表明，熒光標記組與對照組的體長、體寬和體質(zhì)量均沒有顯著性差異（P＞0.05），熒光標記對中華絨螯蟹的生長發(fā)育沒有顯著影響。

2.3 熒光標記對中華絨螯蟹繁殖的影響

實驗采用小水體催情、交配、抱卵和越冬，觀察熒光標記對中華絨螯蟹繁殖的影響，并按下式計算抱卵率和抱卵量。

抱卵率＝抱卵蟹數(shù)/用于觀測記錄的雌蟹數(shù)×100%

抱卵量＝1 g卵子數(shù)×卵子總重

結(jié)果表明，存活的6 ind雌蟹中有5 ind成功交配和抱卵（圖4），抱卵率為83.3%，平均抱卵量30×104egg·ind－1，卵子外觀呈深棕色，富有光澤。與未標記中華絨螯蟹小水體繁育實驗結(jié)果（抱卵率85.0%，平均抱卵量30×104egg· ind－1）比較，抱卵率、平均抱卵量無顯著性差異（P＞0.05），表面VIE熒光標記對中華絨螯蟹的發(fā)育和繁殖無明顯影響。

表1 對照組和標記組生長指標比較Tab.1 G row th over 80 days of the control and tagged E.Sinensis

圖3 幼蟹養(yǎng)成后VIE標記的可識別效果（箭頭所指為熒光標記部位）Fig.3 Persistence of elastomer of crabs in the field（Arrows indicate the locations of VIE）

圖4 VIE標記的抱卵蟹（箭頭所指為熒光標記部位）Fig.4 Tagged crab w ith eggs（Arrows indicate the locations of VIE）

3 討論

本研究首次開展中華絨螯蟹熒光標記應(yīng)用實驗，VIE分別標記在幼蟹不同部位（復眼眼眶、螯掌節(jié)和腕節(jié)間的關(guān)節(jié)膜、腹甲和腹部），以期獲得最佳標記效果，確定中華絨螯蟹最適標記部位。實驗持續(xù)8周后各組的即時死亡率、存活率和標記保持率均無顯著性差異（P＞0.05），但標記在螯掌節(jié)和腕節(jié)間的關(guān)節(jié)膜的一組幼蟹存活率略高于其它標記組，且幼蟹正常蛻殼后該組標記的可視性優(yōu)于其它3組，這與VIE標記紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）［4］和達烏爾鰉（Husodauricus）［12］所得結(jié)論一致：應(yīng)選擇動物透明度相對較高的部位進行標記，由此可見在中華絨螯蟹中熒光標記最佳部位就是螯掌節(jié)和腕節(jié)間的關(guān)節(jié)膜。

衡量熒光標記VIE適用性的重要指標是其對水生生物存活和生長發(fā)育的影響及其在生物體內(nèi)的保持率。通常認為影響標記保持率的因素主要是標記的顏色、動物大小和種類以及標記部位等［14－15］。本研究選取可識別性最強的紅色熒光標記中華絨螯蟹幼蟹，實驗室內(nèi)養(yǎng)殖的標記幼蟹持續(xù)觀察8周后的標記保持率為100%，這與ESBEN等［13］用VIE標記褐鱒（Salmo trutta），77 d后的標志保持率為100%、BURICˇ等［5］用VIE標記小龍蝦（Orconectes limosus）腹部，70 d后標記保持率也為100%的結(jié)果相同。標記螯掌節(jié)和腕節(jié)間的關(guān)節(jié)膜的幼蟹放養(yǎng)于室外土池，80 d后養(yǎng)成成蟹其標記保持率僅為72.8%，大大低于陳雷等［4］標記紅鰭東方鲀尾柄80 d后標記保持率為93%、羅坤等［6］標記中國明對蝦（Fennerpenaeus chinensis）210 d后標志保持率在90%以上。幼蟹養(yǎng)成后標記保持率的降低可能是由于中華絨螯蟹生長過程中蛻殼造成標記破損脫落；也可能是VIE標記隨著中華絨螯蟹生長而被包裹遷移至較深的組織中，加之中華絨螯蟹結(jié)構(gòu)特殊，生長過程中外殼不斷變硬變厚，致使熒光可識別度降低，造成熒光標記在中華絨螯蟹上應(yīng)用的保持率低于其它水生動物的相關(guān)研究結(jié)果。因此，熒光染料應(yīng)盡可能注射到中華絨螯蟹皮下的肌肉層，以減少熒光標記物在中華絨螯蟹蛻殼過程中的損失；但又不能注射太深，以免降低熒光的體外可識別度。

除標記保持率外，熒光標記應(yīng)用研究要分析的其它重要指標就是標記對動物生存和生長發(fā)育的影響。本研究不但統(tǒng)計分析了VIE標記對中華絨螯蟹存活和生長發(fā)育的影響，更進一步檢驗了熒光標記對中華絨螯蟹繁殖的影響，結(jié)果顯示：VIE熒光標記對中華絨螯蟹的存活、生長發(fā)育及繁殖均無顯著性影響，這一結(jié)論與國內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果相同［6－7，16－17］。VIE熒光標記應(yīng)用于中華絨螯蟹育種研究和增殖放流具有可行性。

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Evaluation of visible imp lant elastomer tags in Chinesem itten crab Eriocheir Sinensis

LI Jing-jing1，2，3，GENG Xu-yun2，DONG Xue-wang2，WEIJun-li2，SUN Jin-sheng2，3，QIU Gao-feng1
（1.College of Fisheries and Science，Shanghai Ocean University，Shanghai201306；2.Tianjin Diseases
Prevention and Control Center of Aquatic Animals，Tianjin300221；3.College of Life Sciences，Tianjin Normal University 300387）

Chinese mitten crabEriocheir Sinensisis one of the most economically important aquaculture species in China due to its taste and nutritious value.However，the wild population ofE.sinensishas experienced a dramatic decline in the past decades because of overfishing and water pollution.Thus enhancement and releasing ofE.Sinensisis imperative.At present，the yield ofE.Sinensisis almost completely from artificial breeding.Unfortunately，like many other cultured species，the aquaculture performance ofE.Sinensishas declined significantly.In order to evaluate the effects of selective breeding and enhancement and releasing inE.Sinensis，a suitable tag is important.In this study，the use of red visible implant elastomer（VIE）tagging system inE.Sinensiswas examined for tag retention rate，crab mortality，growth，developmentand reproduction.Four tag locations are tested in juvenile crabs kept in laboratory.After 8 weeks，all groups showed the same tag retention rate of100%，and therewas no significant difference（P＞0.05）in survival rates between the control group and label groups.Whether VIE affected the growth and/or development ofE.Sinensiswas evaluated with outdoor cultured crabs.And therewas no significant difference between the control and label crabs（P＞0.05）.The findings of crab breeding experiment taken in small water bodies show that the egg holding rate is 83.3%and the egg amount per crab is 30 millions.These are equal to unlabeled crabs in the same condition.All results suggest that VIE tagging system is useful as individual identification tag in researches of resource survey，breeding and production inE.Sinensis.

Eriocheir Sinensis；visible implant elastomer；survival；retention；growth；reproduction

S 931.5；S 968.25

A

1004－2490（2016）04－0400－06

2015－12－07

天津市水產(chǎn)局科研推廣項目（J2013－21）、（J2013－7）；國家科技支撐計劃項目（2012BAD26B04）；上海高校水產(chǎn)學一流學科建設(shè)項目

李晶晶（1982－），女，河北唐山人，博士研究生，助理研究員，從事水產(chǎn)動物遺傳育種方向研究。

E-mail：jingjingli206＠163.com

孫金生，教授，E-mail：jinshsun＠163.com；邱高峰，教授，E-mail：gfqiu＠shou.edu.cn