干露脅迫對日本囊對蝦呼吸代謝酶活性和RNA/DNA比值的影響

段亞飛，董宏標(biāo)，王 蕓，李卓佳，張家松

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510300）

干露脅迫對日本囊對蝦呼吸代謝酶活性和RNA/DNA比值的影響

段亞飛，董宏標(biāo)，王 蕓，李卓佳，張家松

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510300）

研究了干露脅迫0.5、1、3 h對日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）肝胰腺呼吸代謝酶活性和肌肉RNA/DNA比值的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，干露脅迫0.5 h和1 h對肝胰腺細(xì)胞色素氧化酶（CCO）、琥珀酸脫氫酶（SDH）、延胡索酸還原酶（FRD）和乳酸脫氫酶（LDH）活性無影響；干露脅迫3 h，CCO和SDH活性顯著降低（P＜0.05），而FRD和LDH活性顯著升高（P＜0.05）。入水恢復(fù)24 h，3個試驗(yàn)組CCO、SDH和FRD活性逐漸恢復(fù)至對照組水平，而干露脅迫3 h試驗(yàn)組LDH活性仍顯著高于對照組（P＜0.05）。干露脅迫0.5 h對肌肉RNA/DNA比值無顯著性影響（P＞0.05），而干露脅迫1 h和3 h RNA/DNA比值顯著降低（P＜0.05），入水24 h時均可恢復(fù)至對照組水平。研究表明，干露脅迫對日本囊對蝦呼吸代謝酶和RNA/DNA比值有顯著影響，會降低其生理代謝能力，但機(jī)體在脅迫3 h內(nèi)具有自我恢復(fù)能力；CCO、SDH、FRD和LDH可以作為其應(yīng)答干露脅迫的監(jiān)測指標(biāo)。

日本囊對蝦；干露脅迫；入水恢復(fù)；呼吸代謝酶；RNA/DNA比值

干露是指水產(chǎn)動物短時間或長時間離開水，而在空氣、沙或土壤等中存活的一種狀態(tài)［1］。干露條件下，水產(chǎn)動物較難直接利用空氣中的氧氣進(jìn)行生存，需要調(diào)整機(jī)體生理生化活動以適應(yīng)環(huán)境的變化［2］。研究表明，干露脅迫會擾亂甲殼類機(jī)體滲透壓，降低其代謝能力，影響蛻皮和生長［3－4］；此外還會影響血藍(lán)蛋白氧氣結(jié)合能力，降低其耗氧率，從而造成低氧脅迫，阻礙呼吸代謝機(jī)制［5－6］。研究干露脅迫對水產(chǎn)動物呼吸代謝酶活性的影響，對了解其對干露脅迫的生理響應(yīng)具有重要意義。

呼吸代謝是動物機(jī)體能量代謝的基本過程，能夠反映環(huán)境條件對生物生理活動的影響狀況，而其代謝能力主要通過呼吸代謝酶的活性變化來體現(xiàn)［7－8］。水產(chǎn)動物主要為有氧呼吸代謝類型，而低氧脅迫時其可通過無氧呼吸代謝方式為機(jī)體供能［9］。線粒體是細(xì)胞呼吸代謝的主要場所，其內(nèi)膜含有呼吸鏈的關(guān)鍵酶，如琥珀酸脫氫酶（SDH）、細(xì)胞色素氧化酶（CCO）等［10－11］。SDH和CCO是線粒體標(biāo)志酶，分別位于呼吸鏈的起始端和最末端，在有氧呼吸代謝中具有重要作用［12－13］。延胡索酸還原酶（FRD）與SDH作用相反，是無氧呼吸代謝關(guān)鍵酶［14］。乳酸脫氫酶（LDH）是機(jī)體無氧糖酵解過程中重要調(diào)節(jié)酶，其活性可以反映無氧呼吸代謝能力［15］。RNA/DNA比值是動物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成能力的評價指標(biāo)，其作為短期內(nèi)反映機(jī)體代謝活動的生長指標(biāo)在水產(chǎn)動物中得到廣泛應(yīng)用［16－17］。

日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）廣泛分布于中國東南沿海，具有適溫性廣、抗病力強(qiáng)、生長速度快和耐干露等特點(diǎn)，適于干活運(yùn)銷［18－19］。干露脅迫是日本囊對蝦養(yǎng)殖和干法運(yùn)輸?shù)冗^程中常見的現(xiàn)象。目前關(guān)于甲殼類干露脅迫的研究主要在免疫方面［6，20－22］，而關(guān)于呼吸代謝酶活性和生長指標(biāo)的研究尚未見報(bào)道。本研究通過測定不同干露脅迫時間和入水恢復(fù)條件下日本囊對蝦肝胰腺呼吸代謝酶活性以及肌肉RNA/DNA比值變化，旨在探討日本囊對蝦應(yīng)答干露脅迫的生理學(xué)特征，篩選干露脅迫相關(guān)評價指標(biāo)，以期為其活體干運(yùn)和耐干露機(jī)理研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康日本囊對蝦取自廣東省中山衍生水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，體長（9.56±0.35）cm，體質(zhì)量（10.65±0.34）g。暫養(yǎng)于200 L的PVC桶中，每桶30 ind，暫養(yǎng)1周。暫養(yǎng)水溫25℃，鹽度16，pH 8.5，持續(xù)充氧，每天換水1/3，投喂配合飼料。

1.2 干露脅迫實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)于封閉無風(fēng)的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，空調(diào)控制室溫為25℃。實(shí)驗(yàn)分為兩部分，即：干露脅迫階段和脅迫后入水恢復(fù)階段。

干露脅迫階段：隨機(jī)挑選暫養(yǎng)1周的健康日本囊對蝦分為3個試驗(yàn)組：分別于室溫條件下干露0.5、1、3 h。另設(shè)對照組，在暫養(yǎng)海水中持續(xù)充氧養(yǎng)殖。每組設(shè)3個平行，每個平行40 ind蝦。試驗(yàn)組用蝦從暫養(yǎng)海水中取出后，用紗布將其體表水分吸干，置于解剖盤中室溫下進(jìn)行干露，分別于干露脅迫0.5、1、3 h取肝胰腺組織，用于呼吸代謝酶活性分析。每組每個平行分別取3 ind蝦。

入水恢復(fù)階段：將上述過程中3個試驗(yàn)組剩余的蝦中每個平行分別取30 ind蝦放回暫養(yǎng)海水中進(jìn)行脅迫后恢復(fù)，分別于入水恢復(fù)3、6、12、24 h取肝胰腺和肌肉組織，每個時間點(diǎn)分別取3 ind蝦。其中，肝胰腺用于呼吸代謝酶活性分析，肌肉組織用于RNA/DNA比值的測定。入水恢復(fù)階段和暫養(yǎng)階段的養(yǎng)殖條件一致。

1.3 肝胰腺呼吸代謝酶活性的測定

取肝胰腺組織，加入9倍體積預(yù)冷的勻漿介質(zhì)（0.01 mol·L－1Tris-HCl，0.000 1 mol·L－1EDTA-2Na，0.01 mol·L－1蔗糖，0.8%NaCl，pH 7.4），超聲粉碎，制備10%組織勻漿液。然后將10%組織勻漿液4℃2 000 r·min－1離心10 min，取上清液，4℃10 000 r·min－1離心15 min；上清液用于LDH活性的測定，沉淀物為線粒體，以勻漿介質(zhì)重懸，超聲粉碎，制備勻漿液，用于呼吸代謝酶細(xì)胞色素氧化酶（CCO）、琥珀酸脫氫酶（SDH）、延胡索酸還原酶（FRD）和乳酸脫氫酶（LDH）活性的測定。

CCO活性參照AFFONSO等［23］方法測定；FRD活性參照XIAO等［24］方法測定；SDH和LDH活性以及組織總蛋白含量均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒：SDH采用2，6-二氯酚靛酚還原法，37℃條件下每毫克蛋白每分鐘使反應(yīng)體系的吸光度降低0.01為1個酶活力單位；LDH活性單位定義為：37℃條件下每克組織蛋白與基質(zhì)作用15 min，反應(yīng)體系中產(chǎn)生1μmol丙酮酸為1個酶活力單位；總蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法。

1.4 肌肉RNA/DNA比值的測定

從RNA保存液中取出肌肉組織，參照梁萌青等［25］方法測定肌肉RNA/DNA比值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 11.0進(jìn)行方差分析（ANOVA）和多重比較（LSD法），P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 干露脅迫對日本囊對蝦呼吸代謝酶活性的影響

2.1.1 CCO

與對照組相比，日本囊對蝦肝胰腺中CCO活性隨著干露時間的延長而降低。其中，干露脅迫3 h，CCO活性顯著低于對照組（P＜0.05）；而干露脅迫0.5 h和1 h時CCO活性與對照組差異不顯著（P＞0.05）（圖1-a）。干露脅迫0.5 h組，入水恢復(fù)6 h時肝胰腺中CCO活性升至最大值（P＜0.05），隨后逐漸下降至對照組水平；干露脅迫1 h組，入水恢復(fù)6 h和12 h時，肝胰腺中CCO活性顯著高于對照組（P＜0.05）；干露脅迫3 h組，入水恢復(fù)3 h時，肝胰腺CCO活性仍顯著低于對照組（P＜0.05），隨后CCO活性升高，與對照組無顯著性差異（P＞0.05）（圖1-b）。

2.1.2 SDH

與對照組相比，日本囊對蝦干露脅迫0.5 h和1 h，肝胰腺中SDH活性與對照組無顯著性差異（P＞0.05）；干露脅迫3 h組，SDH活性顯著下降（P＜0.05）（圖2-a）。干露脅迫0.5 h組和1 h組，入水恢復(fù)3 h時，肝胰腺SDH活性顯著升高，6 h時活性雖呈降低趨勢，但仍均顯著高于對照組（P＜0.05）；而干露脅迫3 h組，入水恢復(fù)3 h時肝胰腺SDH活性仍顯著低于對照組（P＜0.05）；入水恢復(fù)12 h后，各組SDH活性無顯著性差異（P＞0.05）（圖2-b）。

2.1.3 FRD

與對照組相比，日本囊對蝦干露脅迫3 h，肝胰腺中FRD活性顯著高于對照組（P＜0.05），而干露脅迫0.5 h和1 h對肝胰腺FRD活性無影響（P＞0.05）（圖3-a）。干露脅迫后入水恢復(fù)3 h時，各試驗(yàn)組肝胰腺FRD活性均顯著高于對照組（P＜0.05），其中干露脅迫3 h試驗(yàn)組的SDH活性最高；隨后各組FRD活性逐漸降低，并于24 h恢復(fù)至對照組水平（圖3-b）。

圖1 干露脅迫（a）和入水恢復(fù)（b）對日本囊對蝦肝胰腺CCO酶活性的影響Fig.1 CCO activity in hepatopancreas of M.japonicus after desiccation（a）and subsequent recovery（b）

圖2 干露脅迫（a）和入水恢復(fù)（b）對日本囊對蝦肝胰腺SDH酶活性的影響Fig.2 SDH activity in hepatopancreas of M.japonicus after desiccation（a）and subsequent recovery（b）

2.1.4 LDH

與對照組相比，日本囊對蝦干露脅迫0.5 h，肝胰腺中LDH活性無顯著變化（P＞0.05）；干露脅迫1 h和3 h，LDH活性顯著高于對照組，且隨脅迫時間的延長而逐漸升高（P＜0.05）（圖4-a）。干露脅迫0.5 h組，入水恢復(fù)階段各時間點(diǎn)肝胰腺中LDH活性均與對照組無顯著性差異（P＞0.05）；干露脅迫1 h組和3 h組，入水恢復(fù)3 h時，LDH活性顯著高于對照組（P＜0.05），隨后逐漸降低；入水恢復(fù)24 h時，干露脅迫1 h組LDH活性恢復(fù)至對照組水平，而干露脅迫3 h組LDH活性仍顯著高于對照組（P＜0.05）（圖4-b）。

2.2 干露脅迫對日本囊對蝦肌肉RNA/DNA比值的影響

干露脅迫后入水恢復(fù)階段日本囊對蝦肌肉RNA/DNA比值的測定結(jié)果如圖5所示。與對照組相比，干露脅迫0.5 h對肌肉RNA/DNA比值無顯著性影響（P＞0.05）；干露脅迫1 h組，入水恢復(fù)3 h時，肌肉RNA/DNA比值顯著低于對照組（P＜0.05），隨后于6 h開始恢復(fù)至對照組水平；干露脅迫3 h組，入水恢復(fù)3～12 h時肌肉RNA/DNA比值仍顯著降低（P＜0.05）；入水恢復(fù)24 h時，各試驗(yàn)組肌肉RNA/DNA比值無顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 干露脅迫（a）和入水恢復(fù)（b）對日本囊對蝦肝胰腺FRD酶活性的影響Fig.3 FRD activity in hepatopancreas of M.japonicus after desiccation and subsequent recovery

圖4 干露脅迫（a）和入水恢復(fù)（b）對日本囊對蝦肝胰腺LDH酶活性的影響Fig.4 LDH activity in hepatopancreas of M.japonicus after desiccation（a）and subsequent recovery（b）

圖5 干露脅迫對日本囊對蝦肌肉RNA/DNA比值的影響Fig.5 The ratio of RNA/DNA in muscle of M.japonicus during subsequent recovery after desiccation

3 討論

干露條件下甲殼類所處的環(huán)境更為復(fù)雜多變，多種環(huán)境脅迫因子如低氧、pH和滲透壓等，其聯(lián)合作用引發(fā)的機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)更為強(qiáng)烈，對動物存活會造成嚴(yán)重影響［20］。研究表明，蟹類的耐干露時間取決于其鰓部的保水能力和機(jī)體對低含水量的耐受性，與環(huán)境相對濕度呈正相關(guān)［26－27］。此外，干露脅迫會影響甲殼類機(jī)體正常的免疫功能［6，20－22］。不同條件干露脅迫下，脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）HSP70和鐵蛋白基因表達(dá)量顯著上調(diào)，在干露脅迫中發(fā)揮抗氧化作用［6］。姜娜等［20］研究表明，隨干露脅迫時間的增加，三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）肝胰腺總抗氧化能力（T-AOC）水平顯著降低。

3.1 干露脅迫對日本囊對蝦呼吸代謝酶活性的影響

水生動物正常情況下以有氧呼吸方式生存，但在環(huán)境供氧不足條件下，機(jī)體會通過無氧呼吸方式維持正常生命活動。在脅迫環(huán)境中，生物體對能量需求增大，而自身基礎(chǔ)代謝水平降低，對無氧代謝供能依賴增加。CCO和SDH是2種重要的有氧呼吸代謝酶，其活力可以反映動物的有氧代謝水平。CCO是呼吸鏈的末端酶，其活性與機(jī)體耗氧量成正相關(guān)，在電子傳遞和能量產(chǎn)生中具有重要作用［10－11］。SDH是呼吸鏈的第一個酶，有氧呼吸時其在三羧酸循環(huán)中可以將琥珀酸氧化成延胡索酸［13］。FRD和SDH結(jié)構(gòu)相似，但作用相反，無氧呼吸時FRD將延胡索酸還原為琥珀酸，也可為機(jī)體提供ATP［28］。LDH是無氧呼吸代謝的標(biāo)志酶，其可催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，乳酸分解為機(jī)體提供ATP［15］。姜娜等［20］研究發(fā)現(xiàn)，干露脅迫后三疣梭子蟹肌肉組織中乳酸含量顯著升高，表明無氧代謝水平增加對三疣梭子蟹適應(yīng)干露脅迫環(huán)境具有重要作用。

肝胰腺是蝦類消化和代謝中心，其組織內(nèi)代謝酶活性處于較高水平。因此，本研究以日本囊對蝦肝胰腺呼吸代謝酶活性變化作為評價指標(biāo)，以探討干露脅迫對日本囊對蝦呼吸代謝功能的影響。干露脅迫階段，隨干露脅迫時間增加，有氧呼吸代謝酶CCO和SDH活性下降，無氧呼吸代謝酶FRD和LDH活性增加，可能是干露脅迫抑制了組織CCO和SDH活性，導(dǎo)致日本囊對蝦機(jī)體有氧呼吸代謝減弱，依靠無氧呼吸代謝為生理活動供能，表明無氧呼吸代謝水平增加對日本囊對蝦耐干露具有重要作用；另一方面可能是日本囊對蝦機(jī)體主動減少其有氧呼吸代謝耗氧量，對干露脅迫的“應(yīng)激適應(yīng)”，具體原因及其機(jī)制仍需進(jìn)一步的深入研究。入水恢復(fù)階段，3個干露脅迫組的呼吸代謝酶CCO、SDH和FRD均可以在24 h內(nèi)逐漸恢復(fù)至對照組水平，但干露脅迫3 h試驗(yàn)組LDH活性在入水恢復(fù)24 h時仍顯著高于對照組（P＜0.05），表明干露脅迫3 h后其機(jī)體雖具有自我恢復(fù)能力，但干露脅迫仍可能會損傷機(jī)體代謝功能。

3.2 干露脅迫對日本囊對蝦肌肉RNA/DNA比值的影響

生物體的生長過程主要是通過蛋白質(zhì)合成進(jìn)行的，而mRNA和tRNA是蛋白質(zhì)合成過程中重要的參與者。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)合成速度加快時，組織中的RNA含量增加，但細(xì)胞中DNA由于對環(huán)境條件的改變不敏感而相對穩(wěn)定。因此，RNA/DNA比值反映了機(jī)體蛋白質(zhì)合成狀況，是評價動物短期生長的敏感指標(biāo)［16，29］。劉存歧等［30］研究表明，RNA/DNA比值可以作為蝦類生長指標(biāo)，相較于肝胰腺，蝦體肌肉RNA/DNA比值更適于蝦體生長情況的評價。梁萌青等［25］認(rèn)為，凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）肌肉中的DNA和RNA含量比較穩(wěn)定，且RNA/DNA比值與生長呈正相關(guān)。

本研究中，隨著干露脅迫時間的增加，日本囊對蝦肌肉RNA/DNA比值逐漸降低；干露脅迫3 h組入水恢復(fù)24 h時肌肉RNA/DNA比值雖仍可恢復(fù)正常，但在12 h內(nèi)仍顯著降低，因此干露脅迫對其生長可能產(chǎn)生了一定的不利影響。我們推測，干露脅迫誘導(dǎo)的多種環(huán)境脅迫因子間的聯(lián)合作用使對蝦機(jī)體新陳代謝發(fā)生紊亂，機(jī)體消耗大量能量用于抵御環(huán)境脅迫，從而使得用于合成蛋白質(zhì)的能量減少，RNA/DNA比值降低。此外，研究表明，長時間的干露脅迫會導(dǎo)致對蝦機(jī)體產(chǎn)生大量活性氧（ROS）［20］，過量的ROS會導(dǎo)致DNA發(fā)生脂質(zhì)過氧化，影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄過程［31］，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成受阻，使得 RNA/DNA比值下降。由此可知，長時間的干露脅迫會抑制對蝦生長，但是有關(guān)引發(fā)RNA/DNA比值發(fā)生變化的機(jī)理，仍有待進(jìn)一步的深入研究。

綜上所述，干露脅迫對日本囊對蝦呼吸代謝酶有顯著影響，并降低肌肉RNA/DNA比值，影響其生理代謝過程；但干露脅迫3 h內(nèi)，機(jī)體尚基本具有自我恢復(fù)能力。日本囊對蝦肝胰腺CCO、SDH、FRD和LDH對干露脅迫的反應(yīng)均較敏感，可以作為監(jiān)測指標(biāo)。本研究有助于了解干露脅迫對日本囊對蝦生理生化方面的影響，為日本囊對蝦活體干運(yùn)和耐干露機(jī)理研究提供基礎(chǔ)資料。

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Respiratory metabolic enzyme activities and RNA/DNA ratio of Marsupenaeus japonicus after desiccation

DUAN Ya-fei，DONG Hong-biao，WANG Yun，LIZhuo-jia，ZHANG Jia-song
（Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation＆Utilization，Ministry of Agriculture，South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Guangzhou510300，China）

The effects of desiccation and subsequent recovery on respiratory metabolic enzyme activities and the RNA/DNA ratio ofMarsupenaeus japonicuswere investigated.Shrimpswere performed under desiccation individually withoutwater at25℃for 0.5，1 and 3 h，respectively，then subsequent recovery for 24 h in aerated seawater was observed.Compared with the control group，the respiratory metabolic enzyme activities of cytochrome c oxidase（CCO），succcinate dehydrogenase（SDH），fumarate reductase（FRD）and lactate dehydrogenase（LDH）showed no significant change in hepatopancreas after desiccation for0.5 and 1 h（P＞0.05）.After desiccation for 3 h，CCO and SDH activities decreased significantly，meanwhile FRD and LDH increased significantly（P＜0.05）.After recovery for 24 h，CCO，SDH and FRD activities in three desiccation groups returned to the control level，but LDH activity in the desiccation 3 h group was significantly higher than that of the control group（P＜0.05）.The RNA/DNA ratio in muscle showed no significant change after desiccation for 0.5 h（P＞0.05），but it decreased significantly after desiccation for 1 and 3 h（P＜0.05）.The RNA/DNA ratios in three desiccation groups could return to the control level after recovery for 24 h.Results indicated that desiccation had noticeable impacts on respiratorymetabolic enzyme activities and the RNA/DNA ratio ofM.japonicus，and showed significantly destructive effects on the shrimp’s physiologicalmetabolism ability.But the shrimps could recover to the normal by themselves under desiccation for 3 h.CCO，SDH，F(xiàn)RD and LDH could be regarded asmonitor indices for desiccation inM.japonicus.This study can provide insights into the transportation without water and regulatory mechanisms of the resistance to desiccation inM.japonicus.

Marsupenaeus japonicus；desiccation；recovery；respiratorymetabolic enzyme；RNA/DNA ratio

S 917.4

A

1004－2490（2016）01－0042－09

2015－04－30

國家十二五科技支撐計(jì)劃（2011BAD13B10）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2014TS15，2012YD02）；廣東省海洋漁業(yè)科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)項(xiàng)目（A201501B15，A201508b05）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013B021100014）

段亞飛（1989－），男，碩士，助理研究員，從事蝦類健康養(yǎng)殖技術(shù)研究。E-mail：duanyafei89＠163.com

張家松，副研究員。E-mail：jiasongzhang＠hotmail.com