不同濃度三聚氰胺對裂足臂尾輪蟲急性毒性和生活史參數(shù)的影響

賀 萌， 耿 紅，孟 希

(中南民族大學生命科學學院/武陵山區(qū)特色資源植物種質保護與利用湖北省重點實驗室，湖北武漢 430074)

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不同濃度三聚氰胺對裂足臂尾輪蟲急性毒性和生活史參數(shù)的影響

賀 萌， 耿 紅*，孟 希

(中南民族大學生命科學學院/武陵山區(qū)特色資源植物種質保護與利用湖北省重點實驗室，湖北武漢 430074)

摘要[目的]研究不同濃度三聚氰胺對裂足臂尾輪蟲的急性毒性和生活史參數(shù)的影響。[方法]以裂足臂尾輪蟲為受試動物，研究不同濃度(600、1 200、1 800 mg/L)的三聚氰胺對其存活率、繁殖率、生命期望、凈生殖率、世代時間和內稟增長率的影響。[結果]急性毒性試驗結果表明三聚氰胺對裂足臂尾輪蟲的48 hLC50為2 206.376 mg/L，95%置信區(qū)間為1 822.866~2 850.378 mg/L。與對照組相比，不同濃度三聚氰氨都顯著降低了輪蟲的生命期望、凈生殖率和世代時間。當三聚氰氨濃度達到1 800 mg/L時，輪蟲的內稟增長率顯著降低。[結論]該研究可為評價三聚氰胺的毒性提供一些理論基礎。

關鍵詞三聚氰胺；裂足臂尾輪蟲；急性毒性；生活史參數(shù)

三聚氰胺(Melamine)是一種含氮有機化合物，俗稱蛋白精，主要作為化工原料被大多數(shù)人用于塑料和裝修材料加工等行業(yè)[1]。由于三聚氰胺對受試動物的半致死濃度和EC50值[2，3]較高，三聚氰胺被大多數(shù)人認為是低毒物質[1-4]。研究表明，高劑量三聚氰胺長時間喂養(yǎng)大鼠可能誘發(fā)膀胱結石，進而導致膀胱癌的發(fā)生[2,5]。目前，有關三聚氰胺的毒性研究主要集中在哺乳類動物上，而對水體中浮游動物的生殖及發(fā)育的影響研究較少，因此有必要開展三聚氰胺對浮游動物的毒性的影響的研究。

輪蟲是廣泛分布于淺水湖泊和池塘中的浮游動物，具有生長周期短、易培養(yǎng)和對毒物較敏感等特點，被普遍用于毒理學和水環(huán)境檢測研究中[6]。筆者以裂足臂尾(Brachionusdiversicornis)為受試生物，研究了三聚氰胺對其急性毒性和生活史參數(shù)的影響，旨在為評估三聚氰胺對浮游動物生殖和發(fā)育的影響提供一些基礎資料。

1材料與方法

1.1輪蟲的來源與預培養(yǎng)試驗所用裂足臂尾輪蟲采自武漢市南湖。在實驗室內(25±1) ℃、自然光照下對輪蟲進行純化培養(yǎng)，每天投喂密度約為2.0×106個/mL的蛋白核小球藻[7]，培養(yǎng)3個月以上。所用的輪蟲培養(yǎng)液為EPA[8]，培養(yǎng)容器為50 mL燒杯。預培養(yǎng)期間，每天投喂密度約為2.0×106個/mL的蛋白核小球藻并且更換1次輪蟲培養(yǎng)液，同時去除部分個體使輪蟲始終處于指數(shù)增長期[7,9-10]；每12 h懸浮1次培養(yǎng)體系，使藻液均勻。

1.2餌料蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)，購自中國科學院武漢水生生物研究所；采用SE培養(yǎng)基，置于光照強度2 000 lx、光照周期L∶D=12∶12、溫度25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使用前需要離心濃縮。

1.3試驗藥品三聚氰胺(Melamine)，分析標準純，純度99%，購自上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.4急性毒性試驗三聚氰胺呈白色粉末狀，水中溶解度較小(3 240 mg/L，23 ℃)[11]。以EPA為溶劑，將三聚氰胺配制成濃度3 000 mg/L的母液，常溫下保存。急性毒性試驗共設置6個濃度梯度，分別為500、1 000、1 500、2 000、2 500和3 000 mg/L，另設置1個空白對照。每組3個重復[10]。試驗在容積為6 mL的特制玻璃杯中進行。試驗所需濃度皆使用EPA進行稀釋。

試驗期間，隨機吸取預培養(yǎng)體系中的非混交雌體若干，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)。約2~4 h后，吸取大小相當?shù)慕】涤左w[7]，每組10只輪蟲幼體，并加入6 mL特定濃度的三聚氰胺溶液。試驗在25 ℃的光照培養(yǎng)箱中進行，在此期間不喂食。48 h后，在解剖鏡下觀察輪蟲存活情況。根據(jù)輪蟲的死亡情況，采用Probit法[10,12]計算半致死濃度(Median lethal concentration，48 hLC50)。

1.5生活史參數(shù)試驗試驗時，隨機吸取預培養(yǎng)體系中的非混交雌體若干，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)。約2~4 h后，吸取大小相當?shù)慕】涤左w[7]。設置試驗Ⅰ組(600 mg/L三聚氰胺)、試驗Ⅱ組(1 200 mg/L三聚氰胺)、試驗Ⅲ組(1 800 mg/L三聚氰胺)和1個對照組。每組10只幼體，均設3個重復。

試驗在每孔容積為2 mL的定制24孔板中進行。每孔放1只幼體并加入含有2×106個/mL小球藻的各濃度測試液，使總體積達到1 mL[7]。試驗在25 ℃的光照培養(yǎng)箱中進行。試驗開始后，每12 h觀測1次輪蟲存活情況、產卵數(shù)、孵化的幼體數(shù)，并記錄觀察結果。然后，除去幼體并重懸1次測試液，每24 h換1次測試體系。

1.6數(shù)據(jù)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與分析，運用單因素分析(One-wayANOVA)和多重比較(LSD檢驗)，分析各處理組與對照組的差異顯著性。

2結果與分析

2.1急性毒性試驗急性毒性試驗表明，三聚氰胺對裂足臂尾輪蟲的48hLC50值為2 206.376mg/L，95%的置信區(qū)間為1 822.866~2 850.378mg/L。

2.2 三聚氰胺對特定年齡輪蟲存活率和繁殖率的影響從圖1可以看出，對照組與3個試驗組均隨著時間的推移，裂足臂尾輪蟲的存活率逐漸下降，且3個試驗組較對照組呈明顯下降的趨勢。前48h內，對照組沒有死亡個體，而3個試驗組均出現(xiàn)死亡個體，其中試驗Ⅱ組在24h出現(xiàn)死亡個體；240h，試驗Ⅱ組的個體全部死亡；252h，試驗Ⅲ組裂足臂尾輪蟲全部死亡；300h，對照組和試驗Ⅰ組裂足臂尾輪蟲全部死亡。

從圖2可以看出，對照組和各試驗組均從24h開始繁殖，但是與對照組相比3個試驗組的繁殖時間明顯縮短。其中，132h時，試驗Ⅲ組裂足臂尾輪蟲不再繁殖；144h，試驗Ⅱ組不再繁殖；240h，試驗Ⅰ組裂足臂輪蟲不再繁殖，而對照組在300h時仍有個體繁殖。另外，除了對照組的最高峰值出現(xiàn)在48h外，3個試驗組的最高峰值均出現(xiàn)在36h。

圖1　不同濃度的三聚氰胺對裂足臂尾輪蟲存活率的影響Fig.1　Effects of different concentrations of melamine on survival rate of Brachionus diversicornis

圖2　不同濃度的三聚氰胺對裂足臂尾輪蟲繁殖率的影響Fig.2　Effects of different concentrations of melamine on reproduction rate of Brachionus diversicornis

2.3三聚氰胺對輪蟲生活史參數(shù)的影響單因素方差分析表明，不同濃度三聚氰胺對輪蟲各生活史參數(shù)均有顯著影響(P<0.05)。多重比較分析表明，與對照組相比，600、1 200和1 800 mg/L的三聚氰胺均顯著降低了輪蟲的生命期望、凈繁殖率和世代時間(P<0.05)；當三聚氰胺濃度為1 800 mg/L時，輪蟲的內稟增長率顯著降低(P<0.05)(表1)。

表1　不同濃度的三聚氰胺對裂足臂尾輪蟲生活史參數(shù)的影響

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lowercases in the same column stand for significant differences(P<0.05).

3討論與結論

已有研究表明，三聚氰胺對小鼠等哺乳動物均表現(xiàn)為無毒或弱毒[14]。在水生動物的急性毒性試驗中，以斑馬魚為受試對象時，低濃度(0.1和0.5 g/L)的三聚氰胺對斑馬魚幾乎沒有影響，而較高濃度(1.5、2.0和2.5 g/L)的三聚氰胺對其影響較大[15]。以花鱸、吉富羅非魚為受試對象時，LC50大于3 500 mg/L，均沒有表現(xiàn)出毒性[3,16]。以萼花臂尾輪蟲為受試對象時，24 hLC50值為2 627.00 mg/L，已接近水中最大溶解度，表明高濃度三聚氰胺對萼花臂尾輪蟲有一定的毒性，但毒性較弱[10]。筆者以裂足臂尾輪蟲為受試動物，48 hLC50值為2 206.376 mg/L，說明高濃度三聚氰胺對裂足臂尾輪蟲也有一定的毒性，但毒性較弱。

三聚氰胺不僅是含有環(huán)丙氨嗪成分的殺蟲劑在動、植物體內代謝之后的產物[14]，同時也是一種常用的有機化工的中間產品，可以通過裝修業(yè)、造紙業(yè)和紡織業(yè)的等生產途徑進入自然環(huán)境中，但目前尚未見到三聚氰胺在水體中存在大量殘留的相關報道，只在日本的某河水中檢測到三聚氰胺的含量僅為0.000 1~0.007 6 mg/L[10,17]。結合已有的研究結果以及該研究中急性毒性試驗結果，基本可以認為自然水體中的三聚氰胺濃度幾乎不會對水生動物產生毒性。

生活史參數(shù)試驗不僅是研究種群生態(tài)學的一種基本方法，而且對評價生態(tài)毒理學有著重要意義[18]。在毒性試驗中，不僅受試動物會受到有毒物質的影響，而且試驗中作為食物的藻類也會受到有毒物質的影響。研究表明，不同濃度的三聚氰胺對近頭狀偽蹄形藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)和斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)的生長存在不同程度的影響[19]，這就意味著生活在含有三聚氰胺水體中的輪蟲將面臨來自三聚氰胺本身和藻類富集所造成的2個方面的毒性效應，該試驗中暫沒有考慮藻類富集這個方面的影響，今后有待進一步研究。由于輪蟲從外界獲取的能量主要是用于自身的生長和生殖，所以在其面臨外界毒物的影響時，其存活率和繁殖率會首先做出響應[20]，因此筆者選取存活率和繁殖率作為觀測指標。

已有研究表明輪蟲生活史參數(shù)會隨著污染物的種類以及濃度的不同而表現(xiàn)出不同的敏感程度。A.Fernandez-Casalderrey等[21]研究發(fā)現(xiàn)低濃度硫丹對輪蟲的生命期望值沒有影響，但高濃度硫丹卻使生命期望值顯著降低。Zha等[22]研究發(fā)現(xiàn)十氯丹對輪蟲的生命期望值沒有影響。 Huang等[23]研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的艾氏劑能使凈生殖率和內稟增長率顯著上升。Ferrando等[24]研究發(fā)現(xiàn)輪蟲的凈增長率和種群增長率比生命期望和世代時間更加敏感[9]。Rao等[25]和Xi等[26]研究表明，輪蟲的種群內稟增長率是監(jiān)測水體污染物毒性的較敏感指標，但Janssen等[27]研究發(fā)現(xiàn)內稟增長率并不總是最敏感的的指標，有時凈繁殖率更為敏感。該試驗結果發(fā)現(xiàn)，隨著三聚氰胺濃度的增加，世代時間是最為敏感的指標，而種群內稟增長率是最不敏感的指標，這可能與筆者選取的污染物種類及設置的三聚氰胺濃度等因素有關。

筆者對三聚氰胺的毒性有了更深入地了解，并在一定程度上彌補了三聚氰胺對輪蟲的生命表參數(shù)的不足，為三聚氰胺的合理使用提供了一定的依據(jù)。然而，該試驗只研究了水體中的三聚氰胺對輪蟲的影響，忽略了三聚氰胺對藻類的富集毒性而對輪蟲造成的二次影響，因此值得以后進一步研究。

筆者對不同濃度三聚氰胺對裂足臂尾輪蟲的急性毒性試驗表明裂足臂尾輪中的48 hLC50值為2 206.376 mg/L，說明了高濃度的三聚氰胺對輪蟲還是有一定的毒性，但是，毒性較弱。但是，自然水體中的三聚氰胺濃度不如試驗中設置濃度那么高，可以認為自然水體中三聚氰胺對水生動物幾乎無毒。生活史參數(shù)試驗表明，裂足臂尾輪的存活率隨著三聚氰胺濃度的增加呈明顯下降趨勢；繁殖時間也隨著濃度的增加而明顯縮短，3個試驗組較對照組的峰值提前，試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組的最高峰值大于對照組，可以認為低濃度的三聚氰胺可以在短時間內刺激輪蟲的繁殖，說明在受到外來毒物的脅迫時輪蟲能夠在一定濃度下通過提高繁殖率來對抗不良環(huán)境，從而保證種群的延續(xù)性。另外，生命期望、凈繁殖率和時代時間均隨著三聚氰胺濃度的增加而顯著下降(P<0.05)，而內稟增長率在600和1 200 mg/L的三聚氰胺作用下均沒有顯著差異(P>0.05)，當三聚氰胺濃度達到1 800 mg/L時內稟增長率才顯著下降(P<0.05)。該試驗中裂足臂尾輪蟲的較敏感指標為世代時間，進一步驗證了不同污染物及其濃度對不同的受試動物具有不同的敏感性。

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Effects of Different Concentrations of Melamine on Acute Toxicity and Life History Parameters ofBrachionusdiversicornis

HE Meng,GENG Hong*,MENG Xi (College of Life Sciences of South-Central University for Nationalities/Hubei Provincial Key Laboratory for Protection and Application of Special Plants in Wuling Area of China, Wuhan,Hubei 430074)

Abstract[Objective] The aim was to study the effect of different concentrations of melamine on acute toxicity and life history parameters ofBrachionusdiversicornis.[Method] TakingBrachionusdiversicornisas test animal,effects of different concentrations(600,1 200 and 1 800 mg/L)of melamine on survival and reproduction rate,life expectation,net reproductive rate,generation rate and intrinsic growth rate were studied.[Result] The results showed that the 48 hLC50value of melamine toBrachionusdiversicorniswas 2 206.376 mg/L,with 95% confidence interval of 1 822.866-2 850.378 mg/L.Compared with the control,different concentrations of melamine significantly decreased the life expectation,net reproductive rate and generation time.The intrinsic growth rate was significantly suppressed only when the concentration of melamine was 1 800 mg/L.[Conclusion] The study can provide some theoretical basis for toxicity evaluation of melamine.

Key wordsMelamine;Brachionusdiversicornis; Acute toxicity; Life history parameters

收稿日期2015-12-16

作者簡介賀萌(1989- )，女，湖北孝感人，碩士研究生，研究方向：生態(tài)學。*通訊作者，副教授，博士，碩士生導師，從事淡水生態(tài)學研究。

中圖分類號963.21+4

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)02-104-03