鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性與噬菌體的相關(guān)性

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鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性與噬菌體的相關(guān)性

周園王嵐林鴻馮偉1劉新

(遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽110034)

〔關(guān)鍵詞〕噬菌體；鮑曼不動(dòng)桿菌；耐藥性

1沈陽市第四人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科

第一作者：周園(1967-)，女，高級講師，碩士，主要從事微生態(tài)學(xué)及微生物學(xué)研究。

關(guān)于Ab形態(tài)結(jié)構(gòu)與耐藥性關(guān)系鮮有報(bào)告，噬菌體是感染細(xì)菌的病毒，具有溶原性和裂解性兩種生長方式〔1〕，根據(jù)與宿主菌的相互關(guān)系，分為溫和噬菌體、毒性噬菌體兩種類型。過去人們關(guān)注毒性噬菌體裂解宿主菌，期待發(fā)揮治療性應(yīng)用，但長期研究并未取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展〔2〕。鮑曼不動(dòng)桿菌(Ab)為非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，廣泛分布于外環(huán)境中，它黏附力極強(qiáng)，是引起醫(yī)院內(nèi)感染的重要條件致病菌之一，在住院病人尤其是重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)的老年患者中可引起致命性感染。關(guān)于Ab形態(tài)結(jié)構(gòu)與耐藥性關(guān)系鮮有報(bào)告。本研究對ICU 60歲及以上感染患者分離的Ab菌株進(jìn)行耐藥性分析及細(xì)菌超微結(jié)構(gòu)觀察，探討耐藥菌引起醫(yī)院感染的機(jī)制。

1材料和方法

1.1標(biāo)本采集標(biāo)本來自沈陽市第四人民醫(yī)院ICU病房，包括患者痰、呼吸機(jī)導(dǎo)管及手術(shù)的引流管等，臨檢判定為Ab，經(jīng)LB肉湯培養(yǎng)基增菌，然后轉(zhuǎn)種于青霉素·諾氟沙星培養(yǎng)基上培養(yǎng)。單個(gè)菌落經(jīng)中國藍(lán)培養(yǎng)基，44℃連續(xù)傳代純化，生化反應(yīng)測定符合不動(dòng)桿菌屬，細(xì)菌鑒定儀鑒定到種。將經(jīng)過鑒定的菌株通過肉湯培養(yǎng)基增菌24 h，比濁法調(diào)細(xì)菌的密度為1×108/ml，備用。

1.2試劑與儀器營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，中國藍(lán)培養(yǎng)基，M-H培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限公司)，革蘭陰性桿菌鑒定試劑條(REF 32100 梅里埃公司)，藥敏紙片(OXOID 公司)： 哌拉西林(PIP)、 頭孢曲松(CRO)、 頭孢他啶(CAZ)、 頭孢噻肟(CTX)、 頭孢吡肟(FEP)、 亞胺培南(IPM )、美洛培南(MEM)、 氨曲南(AZT)、 頭孢哌酮舒巴坦(CSL)、 替卡西林 /克拉維酸(TCC)、 哌拉西林/他唑巴坦(TZP)。質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC25922、 銅綠假單胞菌ATCC27853，Ab標(biāo)準(zhǔn)株：ATCC 19606(寶特生物公司代購)，本室保存?zhèn)鞔?。自?dòng)化細(xì)菌鑒定儀(ATB，法國生物梅里埃公司)，S-4800冷場發(fā)射掃描電鏡(日立公司北京辦事處)。

1.3菌種鑒定標(biāo)本直接涂片，革蘭染色；氧化酶、觸酶、硝酸鹽還原試驗(yàn)及動(dòng)力試驗(yàn)。ATB鑒定，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.4藥敏試驗(yàn)采用K-B 紙片擴(kuò)散法,判定標(biāo)準(zhǔn)按照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2012版執(zhí)行〔3〕。

1.5掃描電鏡標(biāo)本制備將具有泛耐藥的菌株以1 200 r/min,離心2 min，得到細(xì)菌集團(tuán)，取少量轉(zhuǎn)入盛有預(yù)冷的2.5 %戊二醛固定劑eppendorf管中固定，4℃過夜。4℃條件下0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗 15 min ×3次，1%鋨酸固定液固定2 h，0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗15 min ×3次，脫水：50%乙醇15~20 min ，70%乙醇15~20 min ，90%乙醇15~20 min，90%乙醇90%丙酮(1∶1)15~20 min，90%丙酮15~20 min。固化：37℃過夜。鍍膜20S。S-4800冷場發(fā)射掃描電鏡觀察。

2結(jié)果

2.1藥敏試驗(yàn)見表1。Ab為革蘭陰性球桿菌，多成對排列；無芽胞、無鞭毛，較難脫色，氧化酶、硝酸鹽還原動(dòng)力試驗(yàn)陰性。

表1　45株Ab對抗生素的藥敏試驗(yàn)〔n(%)〕

2.2耐藥Ab超微結(jié)構(gòu)觀察經(jīng)呼吸機(jī)導(dǎo)管分離的耐藥Ab表面可見數(shù)個(gè)噬菌體附著，噬菌體頭部呈多邊形，噬菌體頭部直徑小于200 nm，菌體形態(tài)保持球桿狀；菌體球桿狀，表面光滑，無細(xì)胞壁破裂；菌毛附著于菌體：短而直、中空管狀,末端有多處分枝；菌體間可見分枝的菌毛呈多向接合。未見尾絲結(jié)構(gòu)，菌體完整無破損，非耐藥Ab對照株菌體表面光滑，未見噬菌體吸附；耐藥株菌體尚可見中空管狀的性菌毛及多向接合(圖1)。

圖1　Ab掃描電鏡圖片

3討論

目前報(bào)告Ab的耐藥機(jī)制比較復(fù)雜，包括耐藥酶或稱藥物滅活酶的產(chǎn)生；外膜蛋白的減少、缺失或突變；藥物外排泵的形成；藥物作用靶位：青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)表達(dá)減低或缺乏及可移動(dòng)遺傳元件參與的耐藥基因的傳遞等。噬菌體在自然界廣泛分布，凡是有細(xì)菌的場所，就有相應(yīng)噬菌體的存在。噬菌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)一般分成三種類型：即無尾部結(jié)構(gòu)的二十面體，有尾部結(jié)構(gòu)的二十面體和線狀體〔4〕。本試驗(yàn)中觀察到Ab耐藥株的噬菌體為多邊形，未見尾絲結(jié)構(gòu)，故應(yīng)屬無尾部結(jié)構(gòu)的二十面體噬菌體，本室保存的Ab標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19606，為細(xì)菌生物被膜模式株〔5〕，未見噬菌體存在，藥敏試驗(yàn)表明對多種抗生素敏感，提示耐藥菌株上的溫和噬菌體可能與其耐藥有關(guān)。

溫和噬菌體是指噬菌體感染細(xì)菌后，并不裂解宿主菌引起死亡，關(guān)于溫和噬菌體與不動(dòng)桿菌溶原性及與耐藥相關(guān)性目前未見有報(bào)道。本研究說明宿主菌處于溶原狀態(tài)，如果噬菌體將其自身的基因組整合于宿主菌中的染色體中，這種整合意味著宿主菌基因組變化，是否因此導(dǎo)致耐藥性有待于進(jìn)一步研究。

另外，本研究在電鏡下還觀察到Ab存在性菌毛多重接合現(xiàn)象，值得加以關(guān)注。呈分枝狀的性菌毛，使接合的機(jī)會(huì)更多，這種現(xiàn)象未見有文獻(xiàn)報(bào)道。因?yàn)樾跃茉诩?xì)菌之間傳遞DNA，是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的原因之一，本研究結(jié)果提示溶原性細(xì)菌可能通過噬菌體啟動(dòng)耐藥基因，而由性菌毛多重接合，將耐藥基因廣泛傳遞使細(xì)菌快速產(chǎn)生了耐藥性，因此深入研究噬菌體在細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生過程中的作用機(jī)制有望在預(yù)防和治療老年患者細(xì)菌感染方面提供新的思路。

4參考文獻(xiàn)

1李凡,涂志凱.醫(yī)學(xué)微生物學(xué) 〔M〕.第7版. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：43-5.

2梁莉，楊洪江，金鑫.鮑曼不動(dòng)桿菌烈性噬菌體的分離與純化〔J〕.生物學(xué)雜志，2010;27(4)：88-90,93.

3孫長貴，成軍，楊燕.2012年CLSI M100-S22文件主要更新內(nèi)容的解〔J〕.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012;35(8)：676-8.

4聞?dòng)衩?精編現(xiàn)代醫(yī)學(xué)微生物學(xué)〔M〕.上海： 復(fù)旦大學(xué)出版社，2002：61-2.

5Gaddy JA，Tomaras AP,Actis LA. The Acinetobacter baumannii 19606 OmpA protein plays a role in biofilm formation on abiotic surfaces and in the interaction of this pathogen with eukaryotic cells〔J〕.Infect Immu,2009;77(8):3150-60.

〔2014-06-09修回〕

(編輯張慧)

通訊作者：劉新(1961-)，女，教授，碩士，碩士生導(dǎo)師，主要從事醫(yī)院感染研究。

基金項(xiàng)目：沈陽醫(yī)學(xué)院科學(xué)研究基金項(xiàng)目(20111029)

〔中圖分類號〕Q939.48

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)03-0709-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.088

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