老年非小細(xì)胞肺癌中Raf激酶抑制蛋白與p-AKT的表達及意義

楊大運　邢亞威　張月花　齊　戰(zhàn)

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院內(nèi)科，河北　石家莊　050011)

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老年非小細(xì)胞肺癌中Raf激酶抑制蛋白與p-AKT的表達及意義

楊大運邢亞威張月花齊戰(zhàn)1

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院內(nèi)科，河北石家莊050011)

〔摘要〕目的探討Raf激酶抑制蛋白(RKIP)及p-AKT在老年非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的表達及意義。方法對RKIP和p-AKT的蛋白進行間接免疫熒光標(biāo)記，采用流式細(xì)胞儀對78例NSCLC及相應(yīng)癌旁正常肺組織進行定量檢測。結(jié)果RKIP在 NSCLC組織中的表達量明顯低于癌旁正常肺組織(P<0.05)；p-AKT在NSCLC組織中的表達量明顯高于癌旁正常肺組織(P<0.05)；RKIP、p-AKT的表達量均與肺癌分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后生存期有關(guān)(P<0.05)。結(jié)論在肺癌發(fā)生中RKIP表達減少，p-AKT表達上調(diào)，可能是導(dǎo)致NSCLC發(fā)生、發(fā)展的原因，可作為NSCLC惡性程度及預(yù)后判斷的指標(biāo)。

〔關(guān)鍵詞〕非小細(xì)胞肺癌；流式細(xì)胞術(shù)；Raf激酶抑制蛋白；p-AKT

1河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科

第一作者：楊大運(1973-)，女，副主任醫(yī)師，博士，主要從事肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移研究。

以非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占肺癌總數(shù)的80%，腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是NSCLC患者死亡的主要原因。 Raf激酶抑制蛋白(RKIP)是磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白家族成員，是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子，具有抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用〔1〕。AKT是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是原癌基因之一〔2〕。磷酸化的AKT(p-AKT)是其活化形式，它參與多種腫瘤的形成。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測RKIP和p-AKT在NSCLC及正常肺組織中的表達情況，探討兩者與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2011年1~12月我院病理科確診為NSCLC的手術(shù)標(biāo)本78例，對照組為相應(yīng)癌旁正常肺組織(距腫瘤邊緣5 cm以上)。年齡60~75歲，平均年齡65.5歲；其中男46例，女32例；吸煙者44例，非吸煙者34例；鱗癌43例，腺癌35例；肺癌分期采用2009年IASLC/UICC公布的第7版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ+Ⅱ期48例，Ⅲa+Ⅲb期30例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者38例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者40例。所有標(biāo)本均由病理學(xué)教授進行HE染色切片，明確病理診斷?；颊咝g(shù)前均未行放療或化療。兔抗人RKIP多抗、兔抗人p-AKT多抗均為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。 FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.2流式細(xì)胞檢測(FCM)

1.2.1樣品的制備切取組織塊，網(wǎng)搓法制備細(xì)胞濃度為1×106/ml的單細(xì)胞懸液。

1.2.2間接免疫熒光法標(biāo)記取0.1 ml單細(xì)胞懸液，分別加入1∶100稀釋的RKIP兔抗人多克隆抗體和兔抗人p-AKT多克隆抗體工作液各0.1 ml。室溫孵育30 min，加入PBS洗滌后，棄上清，加入1∶50稀釋的異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗工作液0.1 ml。避光室溫孵育30 min，PBS洗滌，離心，棄上清除去未結(jié)合的熒光抗體，將細(xì)胞重新懸浮于1 ml PBS中，過濾后流式細(xì)胞儀檢測。每次檢測除以同一患者正常肺組織作為正常對照外，還設(shè)有PBS代替一抗和二抗的陰性對照，以及只加一抗或二抗的陽性對照和同型對照。

1.2.3流式資料分析方法按Morkve等〔3〕提出的分析方法，以熒光指數(shù)(FI)表示它們的相對含量，公式為：FI=(樣品基因蛋白表達的平均熒光強度-陰性對照的平均熒光強度)/陰性對照的平均熒光強度。FI>1.0為RKIP或p-AKT陽性表達，F(xiàn)I≤1.0為陰性表達。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SAS13.00軟件行t檢驗和One-Way ANOVA。

2結(jié)果

2.1RKIP、p-AKT在NSCLC與正常肺組織中的表達在NSCLC與正常肺組織中，RKIP的表達量分別為1.563±0.132和1.114±0.107，二者差異顯著(t=18.380，P<0.05)；p-AKT的表達量分別為1.113± 0.125和1.529±0.124，二者差異顯著(t=19.260，P<0.05) 。

2.2RKIP、p-AKT的表達與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系RKIP、p-AKT均與NSCLC的臨床分期、腫瘤的分化程度、生存期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，而與性別、吸煙史、腫瘤大小以及病理類型無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1　肺癌組織中RKIP的表達與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系±s)

3討論

RKIP是一種高度保守、廣泛表達的小分子胞質(zhì)蛋白，參與細(xì)胞凋亡、神經(jīng)發(fā)育以及精子發(fā)生等病理生理過程。目前研究發(fā)現(xiàn)，RKIP具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的功能，是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，它參與細(xì)胞內(nèi)ERK/MAPK、NF-κB等信號通路的調(diào)控〔4〕，通過上調(diào)E-cadherin和下調(diào)MMPs的表達，抑制上皮-間葉轉(zhuǎn)變，降低對細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的破壞，進而發(fā)揮其抗侵襲、轉(zhuǎn)移的功能〔5,6〕。多項研究顯示，RKIP在結(jié)直腸癌〔7〕、胃癌〔8〕、肝癌〔9〕等多種腫瘤組織中表達下調(diào)，本結(jié)果顯示，NSCLC中RKIP的表達量明顯低于正常肺組織，其表達量與肺癌的分化程度、TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及生存時間有關(guān)。表明RKIP表達量減少在NSCLC的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，p-AKT在鱗狀上皮化生和不典型增生組織中高度活化，遠高于肺癌組織，正常的支氣管上皮組織中表達較少或缺失，說明p-AKT參與了癌變的早期階段〔10〕。研究發(fā)現(xiàn)，p-AKT在多種腫瘤組織中過度表達〔11~14〕。關(guān)于p-AKT的表達對于NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后的意義，仍然存在著爭議，更多的研究傾向于p-AKT過度活化預(yù)示NSCLC預(yù)后較差。本實驗結(jié)果顯示，NSCLC中p-AKT的表達量明顯高于正常肺組織，其表達量與肺癌的分化程度、TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及生存時間有關(guān)，表明原癌基因AKT參與了NSCLC的發(fā)生發(fā)展，p-AKT表達量增加在NSCLC的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用。

4參考文獻

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〔2014-08-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

通訊作者：齊戰(zhàn)(1971-)，男，主任醫(yī)師，博士，主要從事肺癌以及食管癌的侵襲轉(zhuǎn)移研究。

〔中圖分類號〕R734.2

〔文獻標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)03-0644-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.058