miRNA-126在頸動脈粥樣硬化患者中的表達(dá)及意義

駱　瑜　熊　瑋　梁　旭

(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院　深圳市人民醫(yī)院老年病科，廣東　深圳　518020)

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miRNA-126在頸動脈粥樣硬化患者中的表達(dá)及意義

駱瑜熊瑋1梁旭

(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院老年病科，廣東深圳518020)

〔摘要〕目的研究頸動脈粥樣硬化患者中血液中小分子RNA-126(miR-126)與斑塊穩(wěn)定性之間的關(guān)系。方法選擇可能存在頸動脈硬化的患者，根據(jù)頸動脈超聲檢測結(jié)果分為正常組、穩(wěn)定斑塊組和不穩(wěn)定斑塊組，常規(guī)檢測血壓、體重指數(shù)(BMI)、肝腎功能、血糖、血脂、尿酸、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)，采用real time PCR檢測外周血中的miRNA-126的表達(dá)水平。結(jié)果三組患者的年齡、BMI、血壓、血糖、血脂、尿酸、肝腎功能均無明顯差異(P>0.05)；不穩(wěn)定斑塊組患者的hs-CRP明顯升高(P<0.05)；與正常組相比，穩(wěn)定斑塊組患者血液中的miR-126水平上升(P<0.05)，不穩(wěn)定斑塊組患者的miR-126水平更加顯著(P<0.01)。miR-126與hs-CRP具有相關(guān)性。結(jié)論miR-126可能參與了頸動脈粥樣硬化發(fā)展的病理過程，可能是易損斑塊的生物學(xué)標(biāo)志之一。

〔關(guān)鍵詞〕小分子RNA-126；頸動脈；不穩(wěn)定斑塊

1暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院心內(nèi)科

第一作者：駱瑜(1979-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事老年病學(xué)研究。

動脈粥樣硬化(AS)是臨床上常見的心血管疾病，也是危害人群健康的主要心血管疾病。由于AS導(dǎo)致的腦卒中和冠心病已成為導(dǎo)致我國居民死亡的首要原因〔1〕。miRNA (microRNA，miR)是一類長度21～29個核苷酸的小分子非編碼RNA，它們能夠識別特定的目標(biāo)mRNA，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控基因表達(dá)，編碼超過30%的基因，與人類的生命活動和疾病的發(fā)生關(guān)系十分密切〔2〕。miR-126是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的miRNA，它的缺乏會損害胚胎血管的完整性，使新生血管減少，導(dǎo)致血管的形態(tài)和功能出現(xiàn)改變〔3〕。本文通過研究頸動脈粥樣硬化患者血液中miR-126的水平變化，探討miR-126與AS及斑塊穩(wěn)定性之間的關(guān)系。

1材料與方法

1.1研究對象2011年7月至2013年9月在我院就診的門診和住院患者。所有病例均為無血緣關(guān)系的華南地區(qū)漢族人群，經(jīng)相關(guān)檢查排除急慢性感染、手術(shù)、創(chuàng)傷、肝腎疾病、惡性腫瘤、類風(fēng)濕性疾病、繼發(fā)性高血壓、心力衰竭、心瓣膜病以及存在酗酒、服用避孕藥的患者。

1.2研究方法

1.2.1一般項(xiàng)目檢測所有患者常規(guī)檢查血壓，連續(xù)測量3次，取平均值作為該患者的血壓。測量身高、體重，計(jì)算體重指數(shù)(BMI)。所有受試者空腹8 h以上于清晨取臥位肘靜脈血4 ml，-80℃保存待測。所有患者常規(guī)測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、血肌酐、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL)、空腹血糖(FPG)、血尿酸(UA)、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)。

1.2.2頸動脈彩色多普勒超聲檢查采用飛利浦公司IE33型彩色多普勒超聲顯像儀，由專人進(jìn)行檢查，探頭頻率7.5~10.0 MHz，常規(guī)檢查頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈。測量血管內(nèi)徑、頸動脈內(nèi)中膜厚度(IMT)，觀察斑塊的部位、大小、形態(tài)、數(shù)量、回聲特點(diǎn)、血流信號、有無充盈缺損等。將IMT>1.0 mm定義為頸動脈內(nèi)膜增厚；IMT>1.3 mm并明顯突出內(nèi)膜為頸動脈斑塊形成。硬斑為斑塊呈強(qiáng)回聲；軟斑為斑塊呈中等或弱回聲，形態(tài)規(guī)則或不規(guī)則，內(nèi)膜向腔內(nèi)凸起，內(nèi)部結(jié)構(gòu)均勻或不均勻；混合斑形態(tài)介于硬斑及軟班之間。硬斑為穩(wěn)定性斑塊，軟斑和混合斑為不穩(wěn)定性斑塊。所有患者均連續(xù)測量每側(cè)頸動脈3次，取平均值計(jì)算IMT。

1.2.3real time PCR檢測miR-126按照RNeasy Mini Kit試劑盒(Qiagen公司)說明書提取RNA，紫外分光光度儀(260/280 nm)檢測RNA濃度(1.8~2.0者采用)，聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定總RNA的純度。cDNA合成：按照miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR試劑盒(EXIQON公司)說明書操作。取模板RNA 14 μl，Enzyme mix 2 μl，5×RT緩沖液4 μl，總體積20 μl，于PCR儀42℃1 h，95℃5 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。合成的cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆?。熒光定量PCR：反應(yīng)體系20 μl，包括SYBR Green mix 10 μl，PCR primer mix 2 μl，稀釋的cDNA模板8 μl。反應(yīng)條件：95℃10 min，95 ℃10 s，60℃1 min，40次循環(huán)。每標(biāo)本均做3個復(fù)孔。以U6作為內(nèi)參，放入7900熒光定量PCR儀中檢測，根據(jù)公式miR-126相對表達(dá)量=2-(ΔCt sample-ΔCt control)計(jì)算。miR-126上下游引物由EXIQON公司合成。

2結(jié)果

2.1一般情況在83例患者中，男54例，女29例，年齡30~87〔平均(53.3±8.4)〕歲，其中正常組患者21例，穩(wěn)定斑塊組36例，不穩(wěn)定斑塊組患者26例。3組患者的平均年齡、血壓、BMI、GPT、血肌酐、血脂、血糖、血UA均無明顯差異(P>0.05)。與正常組相比，穩(wěn)定斑塊組患者的血hs-CRP水平上升，但差異不顯著(P>0.05)，不穩(wěn)定斑塊組患者的hs-CRP則顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1　3組患者的臨床資料

與正常組比較:1)P<0.05

2.2miR-126表達(dá)與正常組患者(1.02±0.12)相比，穩(wěn)定斑塊組(1.54±0.25)及不穩(wěn)定斑塊組(2.68±0.44)患者血液miR-126水平均上升(P<0.05，P<0.01)；不穩(wěn)定斑塊組患者的miR-126水平與hs-CRP水平之間呈正相關(guān)(r=0.722，P<0.05)。

3討論

小分子RNA作為一個廣泛分布的重要的基因調(diào)節(jié)子，在機(jī)體的正常生長、發(fā)育、分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、疾病和死亡等生理和病理過程均發(fā)揮著重要作用。近年來，對miRNA表達(dá)調(diào)控機(jī)制及其調(diào)控相關(guān)疾病如惡性腫瘤、病毒感染、炎癥和免疫性疾病、內(nèi)分泌及代謝性疾病以及作為基因靶向藥物的研究表明miRNA不僅參與了疾病的發(fā)生發(fā)展，同時也可以作為疾病的生物學(xué)診斷標(biāo)志用于疾病的診斷，作為基因藥物可用于疾病的治療〔3~6〕。

miRNA的表達(dá)具有組織特異性和時序性。miR-126在呼吸系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和胚胎組織均有表達(dá)，但在心血管系統(tǒng)中的特異性最高〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)，敲除斑馬魚的miR-126基因后，胚胎血管的發(fā)育受損害，血管的完整性被破壞從而導(dǎo)致出血〔3〕。該作用的發(fā)生與血管內(nèi)皮生長因子信號通路的抑制或SPRED-1的表達(dá)增加有關(guān)〔3〕。敲除小鼠的miR-126基因后，血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移能力下降，血管完整性破壞導(dǎo)致出血和死亡，而缺乏miR-126基因的成年小鼠因?yàn)樾呐K血管的缺陷而發(fā)生心肌梗死〔3〕。血流刺激是促進(jìn)血管形成的因素之一。在血流機(jī)械力的作用下，鋅指蛋白誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子klf2a表達(dá)增加，促進(jìn)內(nèi)源性的miR-126生成，miR-126激活血管內(nèi)皮生長因子信號通路，促進(jìn)血管的生成和發(fā)育〔8〕。在心肌梗死的動物模型研究發(fā)現(xiàn)，局部注射miR-126可以促進(jìn)缺血心肌的血管再生，改善心肌的血液灌注〔9〕。血管細(xì)胞間黏附分子-1被發(fā)現(xiàn)是miR-126的靶基因之一，miR-126通過抑制血管細(xì)胞間黏附分子-1的表達(dá)，阻斷血液中的白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，抑制的發(fā)生〔10〕。在冠心病導(dǎo)致的慢性心功能衰竭時循環(huán)miR-126水平顯著下降，其水平與腦鈉肽負(fù)相關(guān)，隨著心功能改善，miR-126水平上升，表明miR-126亦可作為心力衰竭的循環(huán)標(biāo)志物〔11〕。

斑塊破裂、血管痙攣和隨之發(fā)生的血小板黏附、聚集及繼發(fā)性血栓形成是急性冠狀動脈綜合征和腦卒中發(fā)生的主要病理生理機(jī)制。本研究結(jié)果提示miR-126可能參與了頸動脈粥樣硬化的病理發(fā)展過程。且隨著miR-126水平的升高，不穩(wěn)定斑塊患者的hsCRP水平也升高，兩者呈正相關(guān)，表明miR-126與頸動脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)具有相關(guān)性。

本研究雖然發(fā)現(xiàn)頸動脈粥樣硬化患者的循環(huán)miR-126升高，促進(jìn)中國患者頸動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，但也有研究發(fā)現(xiàn)冠心病患者的血液miR-126水平下降，miR-126可能對冠心病進(jìn)行負(fù)調(diào)控〔12〕。如何解釋這種研究結(jié)論的差異并闡明miR-126參與AS病理過程的分子機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。

4參考文獻(xiàn)

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〔2014-11-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

〔中圖分類號〕R5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)03-0577-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.027