口腔鱗狀細(xì)胞癌患者唾液的代謝組學(xué)分析

及　昕　崔磊華　張　寧　韓明林　韓成敏

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，吉林　長(zhǎng)春　130021)

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口腔鱗狀細(xì)胞癌患者唾液的代謝組學(xué)分析

及昕崔磊華張寧韓明林韓成敏

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130021)

〔摘要〕目的利用基于液相-質(zhì)譜聯(lián)用的代謝組學(xué)研究方法尋找口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)患者唾液中潛在的生物標(biāo)志物。方法采用高分離度快速液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(RRLC/Q-TOF/MS)技術(shù)對(duì)OSCC患者和健康人的唾液樣品進(jìn)行分析，分別獲得兩組樣品的代謝輪廓，同時(shí)運(yùn)用主成分分析法(PCA)技術(shù)對(duì)兩組代謝物進(jìn)行分類，并尋找潛在的生物標(biāo)志物。 結(jié)果RRLC/Q-TOF/MS檢測(cè)結(jié)果顯示，OSCC組和健康組人群唾液代謝輪廓存在明顯的差異，發(fā)現(xiàn)并鑒定得到了7個(gè)OSCC相關(guān)的生物標(biāo)志物，分別為膽堿、葡萄糖、色氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、肉毒堿，與正常健康人相比，膽堿的代謝趨勢(shì)上調(diào)，其余代謝物的趨勢(shì)均下調(diào)。 結(jié)論與健康人相比，OSCC患者主要存在著氨基酸代謝和能量代謝失衡的現(xiàn)象，同時(shí)三羧酸循環(huán)代謝異常，為將來(lái)的臨床診斷和治療提供了重要的信息。

〔關(guān)鍵詞〕口腔鱗狀細(xì)胞癌;唾液;高分離度快速液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜;代謝組學(xué)

第一作者：及昕(1968-)，女，主管護(hù)師，主要從事口腔護(hù)理臨床研究。

WHO報(bào)道，從確定上皮源性的鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)診斷開(kāi)始，口腔癌患者的五年存活率為55%左右〔1〕。有報(bào)道指出,早期診斷OSCC可以使其五年成活率達(dá)到80%~90%〔2〕。近年來(lái)，通過(guò)代謝組學(xué)的方法尋找患者的特異性生物標(biāo)志物來(lái)診斷疾病已經(jīng)受到越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注?？梢杂靡詸z測(cè)的生物體液通常包括血液、尿液、唾液等。其中唾液具有收集簡(jiǎn)單方便，無(wú)痛等優(yōu)點(diǎn)〔3〕，本研究通過(guò)高分離度快速液相色譜與四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(RRLC-Q-TOF-MS)聯(lián)用的技術(shù)對(duì)健康人及臨床已經(jīng)診斷為OSCC患者的唾液進(jìn)行了代謝輪廓研究，旨在尋找潛在的生物標(biāo)志物。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料Agilent 1200 型RRLC系統(tǒng)，Agilent 6520 Q-TOF 質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司)，配有ESI 離子源及Mass Hunter 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和Mass Profile Professional(MPP)統(tǒng)計(jì)軟件(安捷倫公司)。甲醇、甲酸、乙腈(色譜純，美國(guó) Tedia 公司)，實(shí)驗(yàn)用水由 Milli-Q 超純水系統(tǒng)制備。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品采集臨床樣品采自吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科，包括16例OSCC患者(男12例，女8例)，年齡45～63歲〔平均(54.9 ±5.5)〕歲，所有患者均征得患者本人同意，并由入院前行病理切片檢查確定病情后，分別在手術(shù)前(未行化療藥物治療)行唾液樣品采集。 以16例正常人(男12例和女8例)，年齡42～60歲，平均(51.0±7.2)歲，設(shè)為空白對(duì)照組。采集前確保受試者的口腔黏膜、牙齦無(wú)出血、潰瘍等病變，術(shù)前不少于1 h患者無(wú)進(jìn)食、飲水、吸煙。以吐口水的方式收集唾液3 ml于離心管中，其中離心管處于充滿碎冰的杯子中，同時(shí)提醒患者不要咳出痰液。

1.2.2樣品處理方法取200 μl唾液中加入200 μl甲醇/乙腈(1∶1，v/v)溶液，渦旋15 s充分混勻溶液，4℃條件下10 000 r/min離心10 min，取上清液-80℃保存。

1.2.3色譜-質(zhì)譜條件

1.2.3.1色譜條件Agilent Eclipse Plus C18(2.1×100 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相A為超純水溶液(0.1%甲酸)，流動(dòng)相B為乙腈；流動(dòng)相洗脫程序?yàn)?～5 min，10%～20% B;5～7 min，20%～30% B;7～12 min，30%～80% B;12～14 min，80%～85%B;14～17 min，85%～95%B;17～22 min，95%～100%B。柱溫30℃，流速：0.3 ml/min，進(jìn)樣量10 μl。

1.2.3.2MS條件采用電噴霧正離子模式(ESI+)；干燥氣溫度：300℃；質(zhì)量掃描范圍50~1 000 m/z；干燥氣流速9 L/min，噴霧氣壓 40 psig；毛細(xì)管電壓 3.5 kV。

1.4數(shù)據(jù)處理經(jīng)預(yù)處理后的唾液樣品運(yùn)用RRLC-MS進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Masshunter Qualitative Analysis(B.03.01)數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行分子特征識(shí)別，之后將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入MPP統(tǒng)計(jì)軟件中進(jìn)行濾噪和歸一化處理，并進(jìn)行主成分分析。

2結(jié)果

2.1OSCC患者與健康人唾液質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析圖1為正常人和OSCC患者唾液典型的總離子流色譜圖，可以觀察到兩者的總離子流圖存在著明顯的差異。經(jīng)MPP軟件進(jìn)行峰的提取和匹配后，在唾液中共識(shí)別出了116個(gè)代謝物的離子信息。為了將健康人和OSCC患者進(jìn)行區(qū)分，對(duì)所收集的唾液樣品的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了主成分分析(PCA)，見(jiàn)圖2和圖3，兩者在得分圖中實(shí)現(xiàn)了明顯的區(qū)分，這說(shuō)明OSCC患者與健康人相比唾液中的代謝物譜發(fā)生著明顯的變化。

圖1　唾液樣品的典型總離子流圖

2.2差異代謝物鑒定結(jié)果進(jìn)一步比較OSCC組和健康對(duì)照組兩者之間唾液中的代謝差異，依據(jù)精確質(zhì)量數(shù)、二級(jí)質(zhì)譜(MS2)信息及NIST 、HMDB、METLIN、KEGG 等數(shù)據(jù)庫(kù)信息進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，最后用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)其中幾個(gè)鑒定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。鑒定出了7種生物標(biāo)志物，分別是色氨酸、苯丙氨酸 、葡萄糖、谷氨酸、肉毒堿、谷氨酰胺、膽堿,鑒定結(jié)果及變化趨勢(shì)見(jiàn)表1，除膽堿OSCC組與健康組倍數(shù)變化趨勢(shì)為升高外，其余6種標(biāo)志物趨勢(shì)均下調(diào)。

(■：OSCC組，▲：健康對(duì)照組)圖2　OSCC患者和健康組唾液的PCA二維得分圖

(■：OSCC組，▲：健康對(duì)照組)圖3　OSCC患者和健康組唾液的PCA-3D得分圖

代謝物質(zhì)量(m/z)P值OSCC組vs健康組(倍數(shù))代謝途徑色氨酸204.08994.52×10-21.47氨基酸代謝肉毒堿161.10524.83×10-21.53脂肪酸β-氧化谷氨酰胺146.06912.13×10-31.31氨基酸代謝苯丙氨酸165.07901.02×10-32.17氨基酸代謝膽堿121.11033.13×10-41.61脂類代謝葡萄糖180.06343.82×10-30.97糖代謝谷氨酸147.05321.37×10-41.74氨基酸代謝

3討論

OSCC的發(fā)病率正在逐年升高，據(jù)文獻(xiàn)調(diào)查，我國(guó)OSCC的發(fā)病率約為3.6/10萬(wàn)~8.0/10萬(wàn)人〔4〕，如今已成為我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。為了診斷OSCC,CT、MRI以及多普勒彩色超聲介導(dǎo)下的細(xì)針穿刺細(xì)胞活檢技術(shù)，只能夠大概定性腫物的良惡性質(zhì)。目前只有腫物的病理組織活檢術(shù)才是診斷的唯一標(biāo)準(zhǔn)，但由于地域，醫(yī)院級(jí)別，醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)等原因，往往許多患者錯(cuò)過(guò)了治療的最佳時(shí)機(jī)。

代謝組學(xué)技術(shù)通過(guò)對(duì)機(jī)體內(nèi)代謝產(chǎn)物的分析，已成為探索人體疾病、診斷疾病的重要手段。文獻(xiàn)報(bào)道，通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)，已有多種疾病通過(guò)生物體液檢測(cè)到了相關(guān)的代謝標(biāo)志物,而癌癥標(biāo)志物的檢測(cè)更是受到了眾多的關(guān)注，如乳腺癌〔5〕、膽道癌〔6〕等。Chen等〔7〕采用HILIC和RPLC對(duì)肝癌和健康人的尿液進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了21種作為生物標(biāo)志物的代謝物離子，同時(shí)指出兩組受試人群在某些氨基酸代謝和脂肪酸氧化方面存在著明顯的差異。唾液作為人體的體液之一，由于唾液樣品采集具有非侵襲性，受試者無(wú)傷害、無(wú)痛苦，取樣不受時(shí)間、地點(diǎn)的限制，因而樣品容易獲得。唾液作為檢測(cè)人類機(jī)體健康和疾病的新興遞質(zhì)，近些年受到越來(lái)越多的關(guān)注，使用唾液進(jìn)行疾病的診斷和健康的檢測(cè)將是一種很有前途的檢測(cè)方法。

根據(jù)Warburg Effect效應(yīng)，不同于正常細(xì)胞的分化，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞主要是通過(guò)糖酵解作用而產(chǎn)生能量〔8〕。在有氧的條件下，葡萄糖經(jīng)過(guò)糖酵解作用逐步分解生成乙酰CoA進(jìn)入三羧酸循環(huán)，而三羧酸循環(huán)不僅是三大類物質(zhì)(糖類、脂類、氨基酸)的最終代謝通路，也是糖類、脂類、氨基酸代謝聯(lián)系的樞紐。三羧酸循環(huán)的起始物為乙酰CoA，它既是糖氧化分解的產(chǎn)物，也是體內(nèi)脂類代謝和某些氨基酸代謝的產(chǎn)物，而色氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺則是氨基酸代謝的重要產(chǎn)物。苯丙氨酸是人體必需氨基酸之一，在體內(nèi)大部分經(jīng)酶催化作用氧化成為酪氨酸，并與酪氨酸一起合成重要的神經(jīng)遞質(zhì)和激素，參與機(jī)體糖代謝和脂類代謝。

膽堿是卵磷脂和鞘磷脂的重要組成部分，也是乙酰膽堿的前體。而膽堿代謝異常是腫瘤形成與發(fā)展的特征之一，作為乙酰膽堿的前體物質(zhì)，膽堿在體內(nèi)多種代謝過(guò)程中都起著至關(guān)重要的作用，尤其是磷脂的生物合成。腫瘤細(xì)胞在不斷增殖過(guò)程中時(shí)，由于膜的不斷合成，需要高水平的膽堿轉(zhuǎn)化為磷脂酰膽堿，因此相比于健康人群，在OSCC患者的唾液中膽堿的含量要高些。當(dāng)然膽堿代謝異常也有可能是膽堿磷?；^(guò)程中關(guān)鍵酶的高表達(dá)效果。谷氨酰胺和谷氨酸通過(guò)體內(nèi)酶的作用，二者可以相互轉(zhuǎn)化。其中谷氨酰胺在免疫細(xì)胞的分裂和增殖過(guò)程中起到了正調(diào)控的作用，同時(shí)谷氨酰胺在淋巴細(xì)胞的分泌和增殖過(guò)程中也起到了關(guān)鍵性的作用，并且參與了淋巴細(xì)胞功能的維持。而口腔鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移主要途徑是淋巴道轉(zhuǎn)移，谷氨酰胺含量的降低與OSCC的淋巴道轉(zhuǎn)移是否有關(guān)，還有待于進(jìn)一步研究。肉堿由賴氨酸和蛋氨酸合成，在長(zhǎng)鏈脂肪酸的β-氧化過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，當(dāng)然其最重要的已知的代謝功能就是可以促進(jìn)脂肪的運(yùn)輸，幫助脂肪酸運(yùn)輸?shù)骄€粒體中，在能量代謝中起著關(guān)鍵性的作用。乙酰輔酶A經(jīng)β-氧化生成并進(jìn)入三羧酸循環(huán)，最終氧化成為CO2，這也導(dǎo)致了能量運(yùn)載體的減少。與健康人相比，OSCC患者肉堿含量的降低可能由于OSCC患者脂肪酸代謝下調(diào)所致。

本研究運(yùn)用了基于RRLC-Q-TOF-MS的代謝組學(xué)技術(shù)研究了OSCC患者與健康人群的唾液樣品，得到了OSCC患者唾液的代謝輪廓，并發(fā)現(xiàn)OSCC患者與健康人群的唾液代謝譜存在著明顯的差異，找出并鑒定了7種生物標(biāo)記物。同時(shí)，根據(jù)相關(guān)代謝通路的分析，與健康人相比，這些生物標(biāo)記物的變化反映了OSCC患者主要存在著氨基酸代謝水平提高和能量代謝失衡的現(xiàn)象，同時(shí)三羧酸循環(huán)代謝異常。而由于樣品量有限，也導(dǎo)致了實(shí)驗(yàn)的局限性，因此還需要大批量的樣品和細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。

4參考文獻(xiàn)

1鄭家偉,李金忠,鐘來(lái)平,等.口腔鱗狀細(xì)胞癌臨床流行病學(xué)研究現(xiàn)狀〔J〕.中國(guó)口腔頜面外科雜志,2007;5(2):83-90.

2Liu SA,Tsai WC,Wong YK,etal.Nutritional factors and survival of patients with oral cancer〔J〕.Head Neck,2006;28(11):998-1007.

3Hanne CB,Nina E,Nanna E,etal.Potential of human saliva for nuclear magnetic resonance-based metabolomics and for health-related biomarker identification〔J〕.Anal Chem,2009;81:9188-93.

4Liu Q,Sun B,Zhang Q,etal.Metabonomics and its applications in early diagnosis of diseases〔J〕.J Int Pharm Res,2013;40(3):265-70.

5 Zhang L,Xiao H,Karlan S,etal.Discovery and preclinical validation of salivary transcriptomic and proteomic biomarkers for the non-invasive detection of breast cancer〔J〕.PLoS One,2014;DOI:10.1371.

6Wen H,Yoo SS,Kang J,etal.A new NMR-based metabolomics approach for the diagnosis of biliary tract cancer〔J〕.J Hepatol,2010;52(2):228-33.

7Chen J,Wang W,Lv S,etal.Metabonomics study of liver cancer based on ultra performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry with HILIC and RPLC separations〔J〕.Anal Chim Acta,2009;650(1):3-9.

8Matthew G,Vander H,Lewis C,etal.Understanding the warburg effect:the metabolic requirements of cell proliferation〔J〕.Science,2009;324(5930):1029-33.

〔2015-03-15修回〕

(編輯李相軍)

通訊作者：韓成敏(1958-)，男，教授，主要從事口腔頜面部腫瘤研究。

基金項(xiàng)目：吉林省科技發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(2009-11-13)

〔中圖分類號(hào)〕R739.8

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)03-0560-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.019