A549細(xì)胞三維立體培養(yǎng)模型的建立及耐藥機制

車　萍　季旭明　吳智春　王海瑞　歐陽兵

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東　濟南　250355)

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A549細(xì)胞三維立體培養(yǎng)模型的建立及耐藥機制

車萍季旭明吳智春王海瑞歐陽兵1

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟南250355)

〔摘要〕目的探討肺腺癌A549細(xì)胞三維立體(3D)培養(yǎng)模型對順鉑(DDP)的耐藥性及其黏附耐藥機制。方法膠原培養(yǎng)條件下建立A549三維立體培養(yǎng)模型，MTT法檢測平面(2D)培養(yǎng)和3D培養(yǎng)A549細(xì)胞敏感性。采用整合素β1激動劑(TSF)和抑制劑(MAB)干預(yù)，對其相關(guān)機制進行研究。結(jié)果A549細(xì)胞3D培養(yǎng)模型中可見細(xì)胞生長良好，細(xì)胞之間黏附形成典型的多細(xì)胞球。2D培養(yǎng)模型中A549細(xì)胞對DDP的IC50值為12.84 μg/ml；3D培養(yǎng)A549細(xì)胞對DDP的IC50是31.74 μg /ml，為2D培養(yǎng)的2.47倍。與空白對照組比較，DDP干預(yù)組及MAB+DDP組的抑制率明顯升高(P<0.01)，TSF+DDP組有較顯著差別(P<0.05)；與DDP干預(yù)組相比較，TSF+DDP組細(xì)胞抑制率明顯降低(P<0.05)，MAB+DDP組明顯升高(P<0.05)。結(jié)論膠原法成功建立A549細(xì)胞的3D培養(yǎng)模型。與2D培養(yǎng)相比，該細(xì)胞模型具有耐藥的特性，其機制可能與促進整合素β1對細(xì)胞的黏附作用有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕三維立體培養(yǎng)；A549；DDP；整合素β1；黏附耐藥

1山東省食品藥品監(jiān)督管理局

第一作者：車萍(1980-)，女，講師，博士，主要從事方劑作用機制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

化療是晚期肺癌常用的姑息治療方法之一，但腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白在黏附分子作用下產(chǎn)生的黏附耐藥，可使腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性下降、療效降低〔1，2〕。逆轉(zhuǎn)黏附耐藥是提高化療療效的關(guān)鍵，而在體外模擬腫瘤的體內(nèi)微環(huán)境，構(gòu)建具有實體瘤黏附耐藥特性的細(xì)胞模型可為逆轉(zhuǎn)黏附耐藥研究提供實驗平臺。本研究擬建立肺腺癌A549細(xì)胞的三維立體(3D)培養(yǎng)模型，觀察其對順鉑(DDP)的藥物敏感性，并采用細(xì)胞黏附分子整合素β1的激動劑及抑制劑干預(yù)，以初步探討其耐藥機制。

1材料與方法

1.1實驗材料細(xì)胞株：人肺腺癌A549細(xì)胞株，購于中國科學(xué)院生物物理所(北京)。試劑與藥品：DDP，齊魯制藥有限公司；I型鼠尾型膠原，Sigma公司； RPMI1640，Hyclone公司；胰蛋白酶，北京Solarbio科技公司；新生牛血清，杭州四季青生物有限公司；噻唑藍(MTT)，Sigma公司；TSF，Thermo公司；MAB，BD公司。實驗儀器：倒置相差顯微鏡，德國Leica公司；超凈工作臺，中國蘇凈安泰公司；酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司。

1.2實驗方法

1.2.1膠原培養(yǎng)液的配制〔3〕4℃條件下，將10倍常規(guī)濃度磷酸鹽緩沖液(PBS)、新生牛血清、雙蒸水、鼠尾膠原和2倍常規(guī)濃度的RPMI1640以1∶1∶1∶2∶5的比例迅速混勻，滴加NaOH溶液將混合液的pH值調(diào)至7.0，所得溶液即為膠原培養(yǎng)液。

1.2.23D細(xì)胞模型的建立取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，0.2%胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104/ml，制得細(xì)胞懸液。配制好的膠原培養(yǎng)液加入96孔板，每孔50 μl，室溫放置15 min，使之成為半固定的錨定層；將膠原培養(yǎng)液與細(xì)胞懸液以1∶1比例迅速混勻，加入有錨定層的孔中，室溫15 min，于培養(yǎng)箱內(nèi)37℃孵育30 min，完全凝固成為細(xì)胞培養(yǎng)層，之后加入100 μl含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，作為覆蓋層。隔天換液一次。

1.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察用倒置相差顯微鏡觀察普通平面(2D)培養(yǎng)及3D培養(yǎng)條件下的不同時間點(0,2,4，6，8 d)的A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，拍照記錄。

1.4不同培養(yǎng)條件下A549細(xì)胞對DDP的敏感性2D培養(yǎng)細(xì)胞，取其對數(shù)生長期，配成5×104/ml的細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔200 μl(即每孔1×104個細(xì)胞)，置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后加入梯度濃度DDP 0、5、10、20、40、80 μg/ml,繼續(xù)培養(yǎng)72 h。加入5 mg/ml的MTT 20 μl，繼續(xù)孵育4 h。后除去每孔培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩5 min，使結(jié)晶完全溶解。酶標(biāo)儀下檢測吸光值，計算細(xì)胞增殖抑制率，并繪制曲線。3D培養(yǎng)細(xì)胞以每孔100 μl膠原培養(yǎng)液鋪板，取1×104個細(xì)胞接種于96孔板。24 h后加入梯度濃度DDP，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。細(xì)胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.5不同培養(yǎng)條件下整合素β1激動劑及抑制劑對A549細(xì)胞的作用另取對數(shù)生長期細(xì)胞，配成5×104/ml的細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔200 μl進行三維培養(yǎng)。24 h后分為空白對照組(完全培養(yǎng)基組)，DDP干預(yù)組(取3D細(xì)胞模型的DDP的IC50濃度30 μg/ml)，TSF(整合素β1激動劑)+DDP組、MAB(整合素β1抑制劑)+DDP組，加入相應(yīng)藥物，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。后加入5 mg/ml的MTT 20 μl，繼續(xù)孵育4 h。后除去每孔培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩5 min，使結(jié)晶完全溶解。酶標(biāo)儀下檢測吸光值，計算各組細(xì)胞增殖抑制率。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0軟件，以GraphPad Prism5軟件計算IC50值。多個樣本間的比較采用單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察在倒置相差顯微鏡下觀察，2D培養(yǎng)細(xì)胞呈現(xiàn)梭形及多角形貼壁生長；而3D培養(yǎng)條件下，A549細(xì)胞呈圓形于膠原培養(yǎng)基中懸浮生長，細(xì)胞出現(xiàn)黏附的趨勢，于培養(yǎng)第2天即可見由多個細(xì)胞黏附在一起呈團塊狀生長的現(xiàn)象，細(xì)胞團大小不一、形狀不規(guī)則。隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞團有增大的趨勢。見圖1。

圖1　2D培養(yǎng)及3D培養(yǎng)A549細(xì)胞不同時間點的形態(tài)觀察(×200)

2.2MTT法檢測細(xì)胞對DDP耐藥性2D培養(yǎng)模型中A549細(xì)胞對DDP 5、10、20、40、80 μg/ml的細(xì)胞增殖抑制率分別是(33.48±1.98)%，(48.16±1.78)%，(58.06±2.21)%，(63.93±2.07)%，(79.67±1.75)%，IC50為12.84 μg/ml；3D培養(yǎng)模型中A549細(xì)胞對DDP的細(xì)胞增殖抑制率分別是(23.43±2.49)%，(34.93±3.14)%，(45.49±2.93)%，(53.72±4.09)%，(61.32±2.34)%，IC50為31.74 μg/ml；3D培養(yǎng)的A549細(xì)胞對DDP的IC50與2D平面培養(yǎng)的IC50的比值為2.47。

2.3MTT法檢測整合素β1激動劑、抑制劑對3D培養(yǎng)的A549細(xì)胞的作用與空白對照組(0)比較，DDP干預(yù)組〔(49.30±3.50)%〕及MAB+DDP組〔(68.40±3.96)%〕的抑制率明顯升高(P<0.01)，TSF+DDP組〔(30.00±4.76)%〕有較顯著差別(P<0.05)；與DDP干預(yù)組比較，TSF+DDP組細(xì)胞抑制率明顯降低(P<0.05)，MAB+DDP組明顯升高(P<0.05)。

3討論

腫瘤的微環(huán)境包括細(xì)胞因子、生長因子和各種細(xì)胞外基質(zhì)等，是腫瘤發(fā)生、生長的局部環(huán)境〔4〕。腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境相互作用的動態(tài)過程對惡性腫瘤的分化、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、療效和預(yù)后有直接影響。如腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白在黏附分子的作用下產(chǎn)生的黏附耐藥，直接導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性下降〔2〕，療效降低。而2D培養(yǎng)細(xì)胞很難模擬體內(nèi)的3D環(huán)境，這樣就亟需一種細(xì)胞的3D培養(yǎng)模型來模擬人體內(nèi)的微環(huán)境。

目前，耐藥問題已經(jīng)成為困擾臨床化療療效的一大難題。研究證明〔5〕，小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系通過整合素β1黏附于細(xì)胞外基質(zhì)中的纖連蛋白、層黏連蛋白后，成瘤性明顯增強，可抵抗順鉑等化療藥物的殺傷。

整合素β1是一種細(xì)胞表面黏附分子，可以和細(xì)胞外基質(zhì)中多種成分結(jié)合，通過影響細(xì)胞增殖、抗凋亡等途徑影響腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，增強腫瘤細(xì)胞的耐藥表型〔6〕。阻斷整合素β1介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可在一定程度上逆轉(zhuǎn)耐藥現(xiàn)象，如Zhu等〔7〕在體外三維細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用抗整合素β1單克隆抗體阻斷整合素β1，可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞生長抑制、分化程度增高、極性恢復(fù)等表型逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象；提示整合素β1介導(dǎo)黏附耐藥，并通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與凋亡抑制。

本實驗結(jié)果提示，3D培養(yǎng)細(xì)胞對DDP的耐受可能與黏附耐藥的產(chǎn)生有關(guān)，整合素β1參與了3D立體培養(yǎng)的A549細(xì)胞對DDP的黏附耐藥。

綜上所述，本文運用新型錨定法成功建立了A549細(xì)胞的三維立體培養(yǎng)模型，并且該模型顯現(xiàn)出對DDP的耐藥性，其機制可能與整合素β1介導(dǎo)的細(xì)胞間的黏附耐藥相關(guān)。

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〔2015-05-07修回〕

(編輯袁左鳴)

The establishment of three-dimensional cell culture model of A549 and the drug tolerance mechanism

CHE Ping,JI Xu-Ming,WU Zhi-Chun,etal.

Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,Shandong,China

【Abstract】ObjectiveTo establish a three-dimensional culture model (3D)of human lung cancer A549 cells,evaluate the tolerance of DDP to the 3D cells and study the cell adhesion mediated drug resistance(CAM-DR) mechanism.MethodsThe rat tail collagen solution was used to establish the 3D cell culture system,MTT method was used to detect the tolerance of 2D and 3D culture A549 cells to DDP,and discuss the CAM-DR mechanism.ResultsThe improved method 3D culture system of A549 cells was successfully established.The cells grew well and form some typical multicellular spheres.The IC50 value of DDP on 2D cells culture model was 12.84 μg/ml;the IC50 value of DDP on 3D cells culture model was 31.74 μg/ml,2.47 times of the 2D cells culture model.Comparing with that of blank control group,the cell inhibition ratio of the DDP treatment group and the MAB+DDP group were significantly higher(P<0.01),and the TSF+DDP group showed significant difference(P<0.05).Comparing with that of DDP treatment group,the cell inhibition ratio of the TSF+DDP group was obviously lower(P<0.05)and the MAB+DDP group significantly higher(P<0.05).ConclusionsThe 3D A549 cells culture model is established successfully using rat tail collagen solution.This model is more close to the tumor growing environment in vivo,and could reverse the adhesion-mediated drug resistance.The mechanism might be related with reducing the cells' adhesion mediated by the integrin β1.

【Key words】Three-dimensional cell culture;A549;DDP;Integrin β1;Adhesion-mediated drug resistance

通訊作者：歐陽兵(1963-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)文獻的臨床和基礎(chǔ)研究。

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81273634)

〔中圖分類號〕R733.6+2

〔文獻標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)03-0530-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.007