甘草酸二銨對胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株的影響

張英博　費(fèi)洪新　仲麗麗　張曉杰

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江　齊齊哈爾　161006)

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甘草酸二銨對胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株的影響

張英博費(fèi)洪新仲麗麗1張曉杰

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006)

〔摘要〕目的探討甘草酸二銨(DG)對胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株的影響。方法胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株隨機(jī)分成對照組，5-氟尿嘧啶(5-FU)組(50 μg/ml)，DG高、低劑量組(48，24 μg/ml)。采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)檢測胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株的增殖抑制率；采用細(xì)胞劃痕法檢測胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株的運(yùn)動能力；電子顯微鏡觀察胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株鏡下形態(tài)結(jié)構(gòu)；采用免疫組化和RT-PCR檢測胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株中Raf-1水平。結(jié)果與對照組比較，5-FU組及DG高、低劑量組細(xì)胞OD值明顯降低(P<0.05)，運(yùn)動能力明顯降低(P<0.05)，胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯損傷，Raf-1水平明顯降低(P<0.05)。結(jié)論DG通過抑制Raf-1在胰腺癌治療中發(fā)揮重要作用。

〔關(guān)鍵詞〕甘草酸二銨；胰腺癌；細(xì)胞株

1黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)博士后科研流動站在站人員

第一作者：張英博(1973-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤、肝纖維化、癡呆研究。

胰腺癌發(fā)病與Raf-1-絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑的刺激有關(guān)。Raf-1為一種MAPK激酶激酶(MAPKKK)，其作用是磷酸化并激活下游底物MAPK激酶(MAPKK)，MAPKK可以磷酸化后激活下游底物(ERK1/2)，顯示Raf-1是胰腺癌的一種重要的靶點(diǎn)之一〔1〕。中藥甘草中最主要的活性成分之一是甘草酸。甘草酸可抑制人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的作用〔2〕，具有抗氧化、抗感染、抗病毒、抗腫瘤的廣泛作用〔3〕。甘草酸二銨(DG)是甘草酸相關(guān)的有效活性成分之一，可以通過核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB途徑改善神經(jīng)炎癥反應(yīng)而治療阿爾茨海默病〔3〕，具有神經(jīng)保護(hù)功能〔4〕，并對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型有抗感染作用〔5〕。雖然DG的治療作用非常廣泛，但是國內(nèi)外關(guān)于DG抗胰腺癌的研究尚屬于空白。本實(shí)驗(yàn)旨在研究DG對胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的抑制作用及其對胰腺癌發(fā)病關(guān)鍵位點(diǎn)蛋白的影響。

1材料與儀器

1.1藥物和細(xì)胞株DG由正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，批號141202102；5-氟尿嘧啶(5-FU)由Sigma公司提供；人原位胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心提供。

1.2試劑與儀器改良型RPMI-1640培養(yǎng)基和消化胰酶(HyClone公司)，Trizol試劑盒和DEPC(上海生工生物工程)，胎牛血清(HyClone公司)，兔抗人Raf-1單克隆抗體(美國Bioworlde公司)，其他試劑均為國產(chǎn)或者進(jìn)口分析純。HMIAS高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)(武漢千屏影像技術(shù)有限公司)，CO2培養(yǎng)箱(力康發(fā)展公司)，倒置顯微鏡(Philippines公司)，醫(yī)用型潔凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)，超級恒溫槽(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，H1650-W型高速離心機(jī)(湖南湘儀公司)，實(shí)時定量PCR檢測儀(美國伯樂公司)，液氮生物容器(成都金鳳液氮容器有限公司)等。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中恢復(fù)生長至對數(shù)生長期，凍存胰腺癌BxPC-3細(xì)胞，開始前期實(shí)驗(yàn)。正式復(fù)蘇胰腺癌BxPC-3細(xì)胞，用含10%胎牛血清、1%雙抗的改良型RPMI-1640培養(yǎng)液于培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)，觀察胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的狀態(tài)。胰腺癌BxPC-3細(xì)胞均處于對數(shù)生長期后，開始后面的實(shí)驗(yàn)。

1.3.2細(xì)胞分組及處理消化傳代狀態(tài)良好的胰腺癌BxPC-3細(xì)胞隨機(jī)分成對照組(予無菌生理鹽水)、5-FU組(予5-FU 50 μg/ml)、DG高劑量組(予DG 48 μg/ml)、DG低劑量組(予DG 24 μg/ml)。

1.3.3四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)檢測胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的增殖抑制率取各組對數(shù)生長期胰腺癌BxPC-3細(xì)胞，常規(guī)消化制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整BxPC-3細(xì)胞濃度為每ml含有2×105個細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板，保持每孔1×104個細(xì)胞，1 d后進(jìn)行DG干預(yù)，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱孵育3 d，倒置顯微鏡下觀察胰腺癌BxPC-3細(xì)胞。加入MTT及二甲基亞砜(DMSO)，用6100型RT-雷杜酶標(biāo)儀在波長為490 nm處檢測各孔的吸光度(OD)，計(jì)算DG對BxPC-3細(xì)胞的增殖抑制率。增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%。

1.3.4細(xì)胞劃痕法檢測胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的運(yùn)動能力黑色筆在6孔培養(yǎng)板背后，每隔0.5~1 cm劃橫線，每孔至少穿過3條線。在每孔中加入約5×105個胰腺癌BxPC-3細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，垂直于背后橫線畫劃痕。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗細(xì)胞每孔3次，以去除劃下的細(xì)胞。對照組加入正常完全培養(yǎng)基、5-FU組加入含有5-FU 50 μg/ml完全培養(yǎng)基、DG高劑量組加入含有DG 48 μg/ml完全培養(yǎng)基、DG低劑量組加入含有DG 24 μg/ml完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。按0、24、48 h取樣拍攝劃痕處，測量劃痕的距離，細(xì)胞運(yùn)動能力可使用愈合百分比進(jìn)行評價。愈合百分比(%)=(1-48 h劃痕距離/0 h劃痕距離)×100%。

1.3.5透射電鏡檢測胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集各組細(xì)胞，以每瓶培養(yǎng)的細(xì)胞為觀察對象，離心獲得細(xì)胞團(tuán)塊，戊二醛固定、四氧化鋨固定、脫水、包埋、切片等過程，電子顯微鏡觀察DG處理胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

1.3.6免疫組化檢測BxPC-3細(xì)胞Raf-1蛋白的表達(dá)選擇各組BxPC-3細(xì)胞，離心后接種到載玻片中，待細(xì)胞貼壁后選擇各載玻片。按照免疫組織化學(xué)試劑盒說明書，采用SP法開始實(shí)驗(yàn)。在400倍顯微鏡下計(jì)數(shù)棕色細(xì)胞的光密度值，每組選出6個不同視野，采用HMIAS高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)每組光密度值進(jìn)行比較。

1.3.7實(shí)時定量PCR法檢測BxPC-3細(xì)胞Raf-1 mRNA的表達(dá)按Trizol抽提試劑說明書進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取并計(jì)算濃度。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。Raf-1引物：上游：5′-GTG GAT GAT GCC TTT GCT CG-3′，下游：5′-CCA TCG GCG TTC CCA TAC TT-3′；GAPDH引物：上游：5′-AAC GGA TTT GGT CGT ATT GG-3′，下游：5′-TGG AAG ATG GTG ATG GGA TT-3′。將目的RNA和引物充分混勻后短暫離心，反應(yīng)條件：95℃ 15 s、60℃ 30 s、95℃ 15 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。收集熒光，反應(yīng)結(jié)束后，使用iQTM5軟件分析PCR過程各檢測樣本的Ct值，結(jié)果是目的基因(Raf-1)相對于內(nèi)參基因(GAPDH)的表達(dá)量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0軟件行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1DG對胰腺癌BxPC-3細(xì)胞增殖抑制率的影響與對照組(0.822 7±0.107 2)比較，5-FU組(0.652 7±0.078 4)、DG高劑量組(0.393 8±0.074 6)、DG低劑量組(0.626 9±0.077 4)BxPC-3細(xì)胞OD值明顯降低(P<0.05)。5-FU組、DG高、低劑量組胰腺癌BxPC-3細(xì)胞增殖抑制率分別為(20.67±9.53)%、(52.14±9.07)%、(23.80±9.40)%。

2.2DG對胰腺癌BxPC-3細(xì)胞運(yùn)動能力的影響與對照組比較，5-FU組、DG高劑量組、DG低劑量組BxPC-3細(xì)胞48 h劃痕距離明顯增加(P<0.05)，愈合百分比明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1　DG對胰腺癌BxPC-3細(xì)胞運(yùn)動能力的影響

與對照組比較：1)P<0.05

A：對照組；B：5-FU組；C：DG高劑量組；D：DG低劑量組；下圖同圖1　DG對人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的影響(透射電鏡，×6 500)

圖2　DG對人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的影響(透射電鏡，×16 500)

2.3DG對胰腺癌BxPC-3細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響見圖1，圖2。對照組：電鏡下可見胰腺癌BxPC-3細(xì)胞呈橢圓形，排列十分緊密，均勻分布，間隙正常，細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核橢圓形，核膜較清晰，核仁明顯，細(xì)胞核染色質(zhì)均勻分布，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)清晰，游離核糖體豐富。5-FU組：胰腺癌BxPC-3細(xì)胞形態(tài)較小，體積明顯變小，細(xì)胞核較小，細(xì)胞膜凹陷不完整，細(xì)胞間隙增大，核染色質(zhì)高度凝集、固縮于核膜下，部分細(xì)胞核碎裂、崩解，細(xì)胞質(zhì)密度增高，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器較少，線粒體輕度腫脹。DG高劑量組：胰腺癌BxPC-3細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核較小，細(xì)胞核碎裂、崩解，核染色質(zhì)高度濃縮邊集，細(xì)胞膜融合，細(xì)胞邊界不清，線粒體空泡狀改變，部分細(xì)胞器結(jié)構(gòu)消失，微絨毛脫落，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器較少。DG低劑量組：胰腺癌BxPC-3細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核較小，細(xì)胞核內(nèi)異染色質(zhì)輕度凝集，細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞器不豐富，線粒體有不同程度的腫脹，部分線粒體嵴斷裂、消失，微絨毛脫落，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)略有擴(kuò)張且數(shù)量明顯減少，溶酶體增多，游離核糖體較少。

2.4DG對胰腺癌BxPC-3細(xì)胞Raf-1光密度值的影響與對照組(0.502 2±0.052 6)比較，5-FU組(0.248 7±0.030 1)、DG高劑量組(0.287 8±0.028 8)、DG低劑量組(0.352 9±0.036 9)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞Raf-1光密度值明顯降低(P<0.05)。

2.5DG對胰腺癌BxPC-3細(xì)胞Raf-1 mRNA的影響與對照組(0.988 0±0.186 6)比較，5-FU組(0.359 5±0.262 2)、DG高劑量組(0.415 9±0.180 2)、DG低劑量組(0.641 1±0.134 2)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞Raf-1 mRNA表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。

3討論

腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞內(nèi)眾多信號傳導(dǎo)通路密切相關(guān)。Ras/Raf/MEK/ERK信號級聯(lián)通路是與腫瘤相關(guān)的信號通路之一，例如Raf-1與細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)在胃腺癌中高表達(dá)〔6〕，核心蛋白聚糖通過Ras/Raf信號通路對HepG2 細(xì)胞有抑制作用〔7〕，MAPK 信號通路參與遺傳性多囊腎的發(fā)病機(jī)制〔8〕。Ras/Raf/MEK/ERK通路參與了細(xì)胞增殖、生長、發(fā)育、分化以及細(xì)胞間的功能同步和細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化等多種生理、病理過程，該信號通路一旦被異常激活，即會導(dǎo)致細(xì)胞增殖，尤其是腫瘤的發(fā)生，因此該通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重大意義。

Ras是鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白，Ras基因家族包括H-ras、K-ras和N-ras。酪氨酸激酶受體和G蛋白耦聯(lián)受體可激活

Ras，Ras是Raf-1 上游信號蛋白，Ras進(jìn)一步激活Raf/MEK/MAPK信號傳導(dǎo)通路。研究表明，Raf激酶家族是Ras的下游信號，Raf激活后與機(jī)體的多種腫瘤密切相關(guān)〔9〕。若在誘發(fā)因素的激活下，則由失活態(tài)的Ras-GDP結(jié)合構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨瘧B(tài)的Ras-GTP結(jié)合構(gòu)象，引入Raf激酶家族到胞膜并激活Raf啟動Ras通路，進(jìn)而通過關(guān)鍵位點(diǎn)Raf、Mek等激酶依次被磷酸化實(shí)現(xiàn)此通路的激活活化。由此推測這可能是胰腺癌細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。

本研究表明5-FU及DG高、低劑量對胰腺癌BxPC-3細(xì)胞治療有效，可以明顯減少胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的存活數(shù)目，顯示DG對胰腺癌BxPC-3細(xì)胞有明顯的抑制作用，并且隨著DG劑量的增加，治療效果愈加明顯。5-FU及DG高、低劑量對胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的運(yùn)動能力有明顯的影響，減少了腫瘤細(xì)胞的遷移率，減少腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移程度，顯示DG可以抑制胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的運(yùn)動能力。同時，DG高、低劑量對胰腺癌BxPC-3細(xì)胞治療效果明顯，伴有劑量效應(yīng)。透射電鏡觀察結(jié)果也說明DG對胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的治療效果較好。而這些效果主要是通過降低Raf-1蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，DG可以通過降低Raf-1的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對胰腺癌BxPC-3的抑制作用，同時降低運(yùn)動能力、損傷BxPC-3的形態(tài)結(jié)構(gòu)，提示Raf-1蛋白是治療胰腺癌的靶點(diǎn)蛋白質(zhì)之一。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015-05-16修回〕

(編輯袁左鳴)

The effects of diammonium glycyrrhizinate on BxPC-3 cell line of pancreatic cancer

ZHANG Ying-Bo，F(xiàn)EI Hong-Xin，ZHONG Li-Li，etal.

Qiqihar Medical University，Qiqihaer 161006，Heilongjiang，China

【Abstract】ObjectiveTo study the effects of diammonium glycyrrhizinate(DG) on BxPC-3 cell line of pancreatic cancer.MethodsBxPC-3 cell lines of pancreatic cancer were randomly divided into control，5-Fluorouracil(5-FU, 50 μg/ml)，DG high-dose(48 μg/ml)，DG low-dose (24 μg/ml) groups.The MTT was used to determine OD values of BxPC-3 cell line of pancreatic cancer. The cell scratch was used to determine the exercise capacity of BxPC-3 cell line of pancreatic cancer. Morphology of BxPC-3 cell line of pancreatic cancer was observed by optical electron microscopy. The immunohistochemistry and real-time-PCR were applied for detecting rapidly accelerated fibrosarcoma(Raf)-1 levels in BxPC-3 cell line of pancreatic cancer.ResultsCompared with that of control group， OD values of BxPC-3 cell line of pancreatic cancer in 5-FU，DG high-dose and DG low-dose groups were significantly decreased(P<0.05)，exercise capacity were decreased (P<0.05).Compared with those of control group， BxPC-3 cell line of DG high-dose and medial-dose groups were damaged normal morphological structure，Raf-1 level was significantly decreased(P<0.05).ConclusionsDG plays a certain role in the treatment of BxPC-3 cell line of pancreatic cancer through inhibiting Raf-1.

【Key words】Diammonium glycyrrhizinate；Pancreatic cancer；Cell line

通訊作者：張曉杰(1965-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤、抑郁癥、癡呆研究。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81173576)；黑龍江省教育廳項(xiàng)目(No.12531788，12521624)；黑龍江省博士后資助課題項(xiàng)目(No.LBH-Z14196)

〔中圖分類號〕R285

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)03-0523-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.005