慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠破骨樣細胞研究

傅繼凡　陳　健

(廈門大學醫(yī)學院，福建　廈門　361000)

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慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠破骨樣細胞研究

傅繼凡陳健1

(廈門大學醫(yī)學院，福建廈門361000)

〔摘要〕目的探討慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠破骨樣細胞的可行性。方法誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)培養(yǎng)成破骨樣細胞(OLC)后，將其用綠色熒光蛋白(GFP)標記的對照慢病毒進行轉(zhuǎn)染，熒光顯微鏡下觀察不同感染復數(shù)(MOI)時慢病毒轉(zhuǎn)染OLC的熒光率，并用TRAP染色鑒定OLC。選擇最適宜的MOI并加入不同干預進行對照，分為OLC對照組、NFAT2抑制劑(VIVIT)組、NFAT2iRNA慢病毒組、對照病毒組，用RT-PCR進行基因驗證。結(jié)果對照病毒轉(zhuǎn)染后，OLC隨著MOI值的升高，熒光轉(zhuǎn)染率增加；MOI=15時熒光數(shù)最多(41.00±9.19)個/視野。不同干預后，NFAT2抑制劑組和NFAT2iRNA慢病毒組的NFAT2的基因表達明顯低于OLC對照組和對照病毒組(P<0.05)。結(jié)論慢病毒可轉(zhuǎn)染大鼠破骨樣細胞，并在一定范圍內(nèi)隨MOI升高轉(zhuǎn)染率增高。

〔關(guān)鍵詞〕慢病毒；破骨樣細胞；活化T細胞核因子家族

1廈門大學附屬中山醫(yī)院康復醫(yī)學科

第一作者：傅繼凡(1990-)，女，在讀碩士，主要從事骨質(zhì)疏松研究。

骨代謝的平衡由骨形成和骨吸收維持,成骨細胞(OB)和破骨細胞(OC)起著重要作用。其中，OC是一種具有獨特骨吸收功能的多核巨細胞，來源于造血細胞系，屬于終末細胞，不能增殖和傳代〔1〕。而破骨樣細胞(OLC)是指具有OC性質(zhì)，通過原代培養(yǎng)或?qū)嶒炚T導生成的，用于實驗研究的細胞。到目前為止，還沒有成熟的OC株。自從Testa等〔2〕首次在體外培養(yǎng)骨髓造血細胞時發(fā)現(xiàn)能夠形成OC后，骨髓誘導培養(yǎng)法分化OLC的技術(shù)形成并逐漸開展應用。獲得OC的方法多種多樣，包括誘導培養(yǎng)、直接培養(yǎng)等技術(shù)都逐漸趨于穩(wěn)定成熟，有助于著手從基因水平深入研究骨吸收的機制，從而進一步開發(fā)代謝性骨病的治療藥物。本文擬證實慢病毒轉(zhuǎn)染OLC的可行性，為進一步利用OLC進行基因?qū)W研究奠定重要基礎。

1材料與方法

1.1實驗動物4周齡雌性SD大鼠，購自吳氏實驗動物中心。

1.2主要試劑、材料和儀器低糖DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，中美胎牛血清(Bioind)，紅細胞裂解液，雙抗、磷酸鹽緩沖液(PBS，美國Gibco公司)，鼠M-CSF、RANKL(美國Peprotech公司)，抗酯酸性蛋白酶染色試劑盒(TRAP，美國Sigma公司)，NFAT抑制劑(德國Calbiochem公司)，Trizol(美國Ambion公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)，SYBR Green試劑(Invitrogen)，NFAT2RNAi慢病毒、對照病毒由廈門欣基公司包裝合成，引物由上海生工公司合成；10 cm培養(yǎng)皿、六孔板(美國Corning公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，DM2500熒光顯微鏡(德國Leica公司)，PCR擴增儀(美國Bio-Rad公司)，熒光定量PCR儀7500型(美國ABI公司)。

1.3大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)的分離與誘導培養(yǎng)取SD大鼠麻醉后處死，無菌條件下取雙側(cè)股骨和脛骨，剔除多余軟組織，用5 ml注射器吸取適量低糖DMEM沖洗骨髓腔，直至骨髓腔變白，取沖洗液充分吹打制成細胞懸液后離心，800 r/min，3 min。棄上清加紅細胞裂解液，混勻靜置2 min，800 r/min離心3 min，棄上清去除紅細胞，得到白細胞沉淀。重懸于含25.0 ng/ml M-CSF +50.0 ng/ml RANKL的低糖DMEM完全培養(yǎng)液(含10%FBS、1%青霉素與鏈霉素)，接種于10 cm培養(yǎng)皿，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取未貼壁細胞，調(diào)整細胞密度為2.5×105重懸于含25.0 ng/ml M-CSF +50.0 ng/ml RANKL(大鼠)的低糖DMEM完全培養(yǎng)液，接種于六孔培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)，首次半定量換液，以后每隔3 d換液。

1.4慢病毒轉(zhuǎn)染OLC并分組以hela細胞(2.5×104/孔)對比，待獲得的OLC生長融合達約60%時，對照病毒(無NFAT2沉默)轉(zhuǎn)染按感染復數(shù)(MOI)15、5、1各分為三組，18 h后首次換液，此后每2~3 d換液1次并于第5天觀察熒光表達情況，熒光顯微鏡(×200)下隨機選取5個視野拍攝OLC和hela細胞，并用Image-Pro Plus專業(yè)圖像分析軟件計數(shù)。

1.5TRAP染色及計數(shù)將OLC于轉(zhuǎn)染后第5天棄培養(yǎng)基，PBS沖洗2遍，檸檬酸鹽/丙酮固定液室溫下固定30 s，用蒸餾水沖洗、晾干，按試劑盒說明書行TRAP染色，倒置相差顯微鏡(×200)下隨機選取5個視野計數(shù)3個核以上破骨細胞，并在200倍光鏡下，用Image-Pro Plus專業(yè)圖像分析軟件計數(shù)。

1.6NFAT2抑制劑干預OLC將獲得的OLC融合率達到60%左右時，進行不同干預并分為OLC對照組、NFAT2抑制劑(VIVIT)組、NFAT2iRNA慢病毒組、對照病毒組。NFAT2iRNA慢病毒組和對照病毒組病毒劑量均以MOI=15為參數(shù)，VIVIT試劑以2 μmol/L每孔連續(xù)干預3 d，此后每2~3 d換液1次并于第5天進行RT-PCR檢測。

1.7RT-PCR檢測細胞總RNA用Trizol提取。取總RNA 2 μg,按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)步驟完成反轉(zhuǎn)錄。以GAPDH為內(nèi)參照,取2 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別以下述引物進行PCR擴增。引物序列及反應條件：①NFAT2：順向GGAGGGAAGAAGATGGTGTTGT,反向CTGGTTATTCTCTGGTTGCGG；②GAPDH：順向AGTGCCAGCCTCGTCTCATAG,反向CGTTGAACTTGCCGTGGGTAG；反應條件:95℃ 30 s后,95℃ 5 s,60℃ 34 s，反復循環(huán)40次,95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s后結(jié)束反應。采用2-ΔCt的方法計算基因相對表達量，公式：目的基因表達量=2-ΔCt,ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。

1.8統(tǒng)計學方法應用SPSS13.0軟件選用單因素方差分析(One-way ANOVA)、LSD方法統(tǒng)計。

2結(jié)果

2.1細胞生長特性倒置顯微鏡下觀察，大鼠BMSCs培養(yǎng)24 h后開始貼壁，呈梭形，誘導后細胞逐漸變大，集落融合成多核破骨細胞，第9天時細胞狀態(tài)最佳，數(shù)量最多，隨后細胞開始皺縮，出現(xiàn)大量空泡。MOI=15、5、1均未見明顯的細胞毒性。見圖1。

2.2轉(zhuǎn)染及計數(shù)帶有綠色熒光蛋白(GFP)標記的對照病毒轉(zhuǎn)染OLC后第5天在倒置熒光顯微鏡下觀察，可見轉(zhuǎn)染上的OLC發(fā)出較強的綠色熒光，胞體大、形態(tài)不一、核數(shù)≥3、細胞外圍有一明顯皺褶緣。隨著MOI值的升高，hela的轉(zhuǎn)染數(shù)增加，各組之間比較均有顯著差異(P<0.01)。OLC組在MOI=15時，轉(zhuǎn)染數(shù)最多，與MOI=5、1比較有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。MOI=15時，OLC褶皺緣明顯、熒光強；MOI=5、1時，轉(zhuǎn)染的OLC熒光較弱，皺褶緣少，其他細胞轉(zhuǎn)染較多。見圖2，表1。

圖1　不同時間點OLC的形態(tài)(×200)

圖2　熒光顯微鏡OLC及hela細胞(×200)

組別MOI=15MOI=5MOI=1hela308.40±26.091)2)187.80±23.891)52.00±12.25OLC41.00±9.194.60±1.143)1.80±1.103)

與MOI=1比較:1)P<0.01;與MOI=5比較:2)P<0.01；與MOI:15比較：3)P<0.01

2.3TRAP染色及數(shù)量誘導的OLC經(jīng)TRAP染色后胞質(zhì)深染呈紫紅色，而胞核陰性，核數(shù)目≥3，多位于周邊。經(jīng)Image-Pro Plus計數(shù)分析后，MOI=15組(53.60±3.65)、MOI=5組(47.20±3.83)、MOI=1組(48.80±7.12)細胞數(shù)量均無顯著差異(P>0.05)。見圖3。

圖3　誘導法OLC的TRAP鑒定

2.4NFAT2iRNA慢病毒轉(zhuǎn)染OLC后NFAT2的表達不同病毒轉(zhuǎn)染OLC后熒光顯微鏡下觀察，與對照病毒組比較，NFAT2iRNA慢病毒組OLC數(shù)目少，熒光強度弱，未見皺褶緣。經(jīng)過不同干預后，NFAT2抑制劑組(0.009 7±0.001 7)和NFAT2iRNA慢病毒組(0.009 6±0.002 0)的NFAT2基因表達明顯低于OLC對照組(0.015 8±0.002 6)和對照病毒組(0.015 9±0.002 5)(P<0.05)。而OLC對照組和對照病毒組、NFAT2抑制劑組和NFAT2iRNA慢病毒組之間的NFAT2基因表達無顯著差異(P>0.05)。見圖4。

圖4　慢病毒轉(zhuǎn)染后第5天熒光顯微鏡下破骨樣細胞(×200)

3討論

骨代謝疾病如骨質(zhì)疏松、Paget病、牙周炎等病理變化都存在骨吸收異常，其中OC起重要作用〔3〕。OC在體外很脆弱，培養(yǎng)難度高，純度不高。本實驗將大鼠BMSC在體外培養(yǎng)過程中加25.0 ng/ml M-CSF +50.0 ng/ml RANKL 進行誘導，獲得一定量的成熟OLC，觀察培養(yǎng)至第9天時數(shù)量最多，與其他培養(yǎng)方法比較，與體內(nèi)OC生物學功能最接近〔4〕，最適合用于體外深入研究。

慢病毒載體是以人類免疫缺陷I型病毒(HIV-1)為基礎發(fā)展起來的基因治療載體，可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久穩(wěn)定的表達。在感染能力方面不同于腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，可有效地感染一些較難轉(zhuǎn)染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化細胞等，適用于OC的體外研究〔5〕。GFP是一種新型報告基因，與目的基因構(gòu)成融合基因后，通過載體(如質(zhì)粒、慢病毒、腺病毒)轉(zhuǎn)染，細胞可表達GFP蛋白，產(chǎn)生綠色熒光。本實驗發(fā)現(xiàn)慢病毒轉(zhuǎn)染效果與MOI值有密切關(guān)系，隨MOI值的增加而升高，TRAP染色進一步驗證MOI=15、5、1對細胞均無較明顯毒性作用。

Ca2+/NFATc1信號通路是OC內(nèi)重要的信號系統(tǒng)，參與調(diào)節(jié)OC的分化和成熟〔6〕?；罨疶細胞核因子家族中的NFATc1已被證實是其中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與許多OC特異性基因的表達調(diào)控，對OC分化和骨吸收功能至關(guān)重要〔7〕。有研究表明，NFATc1基因敲除的小鼠表現(xiàn)為骨硬化癥〔8〕；其基因缺陷的胚胎干細胞不能分化成OC，但表達外源性NFATc1的前體細胞在沒有RANKL的情況下也能向OC分化〔9〕。因此，可選擇最適宜的MOI值用NFAT2iRNA慢病毒對OC進行基因驗證。NFAT2iRNA慢病毒進入OC轉(zhuǎn)染成功后使NFAT2基因沉默，表達下降，而對照病毒沒有使NFAT2沉默的作用，同時加入VIVIT作為對照，VIVIT組和NFAT2iRNA慢病毒組的NFAT2基因表達明顯低于OLC對照和對照病毒組，說明轉(zhuǎn)染成功。此外，熒光顯微鏡也進一步證明NFAT2對OC的分化和成熟的重要性。

體外成功轉(zhuǎn)染OC的主要措施：保證轉(zhuǎn)染前細胞活性處于最佳狀態(tài)；病毒轉(zhuǎn)染前更換新培養(yǎng)基效果最好；加病毒后一般需在8~12 h更換培養(yǎng)基。經(jīng)過反復大量實驗，發(fā)現(xiàn)對于OC 18個小時為最佳換液時間；采用1~2個月大鼠，所誘導的OC最多；動物從處死到分離細胞速度要快，OC不易受損；嚴格無菌操作，誘導因子足量；采用差速貼壁法純化OC，因所分離成纖維細胞等貼壁速度快，在培養(yǎng)24 h后收集未貼壁細胞接種至另一培養(yǎng)板中可提高純度；純化后OC為更好貼壁，2~3 d內(nèi)需要靜置培養(yǎng)，不宜挪動。

綜上所述，此次OC轉(zhuǎn)染成功為今后骨代謝疾病的基因治療開拓了廣闊的道路，利用攜帶目的基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染OLC，研究骨吸收的具體分子機制及有關(guān)OC內(nèi)分化的信號通路是今后進一步實驗的方向。

4參考文獻

1Duong LT,Rodan GA.Regulation of osteoclast formation and function〔J〕.Rev Endocr Metab Disorders,2001;2(1):95-104.

2Testa NG，Allen TD，Lajtha LG,etal.Generation of osteaclasts in vitro〔J〕.J Cell Sci，1981;47(1):127-37.

3Rodan GA,Martin TJ.Therapeutic approaches to bone diseases〔J〕.Science,2000;289(5484):1508-14.

4付應霄，顧建紅，王世濤，等.2種方法誘導形成的破骨細胞特性比較〔J〕.中國獸醫(yī)學報,2013;33(1)：94-7.

5Kubo S,Kataoka M,Tateno C,etal.In vivo stable transduction of humanized liver tissue in chimeric mice via high-capacity adenovirus-lentivirus hybrid vector 〔J〕.Hum Gene Ther,2010;21(1):40-50.

6Hwang SY,Putney J.Calcium signaling in osteoclasts 〔J〕.Biochim Biophys Acta,2011;1813(5):979-83.

7Negishi KT,Takayanagi H.Ca2+-NF ATc1 signaling is an essential axis of osteoclast differentiation 〔J〕.Immunol Rev,2009;231(1):241-56.

8Winslow MM,Pan MG,Starbuck M,etal.Calcineurin/NFAT signaling in osteoblasts regulates bone mass 〔J〕.Dev Cell,2006;10( 6):771-82.

9Takayanagi H,Kim S,Koga T,etal.Induction and activation of the transcription factor NFATc1(NFAT2)integrate RANKL signaling in terminal differentiation of osteoclasts〔J〕.Dev Cell,2002;3(6):889-901.

〔2015-05-11修回〕

(編輯袁左鳴)

Research of lentivirus transfect osteoclast-like cells

FU Ji-Fan,CHEN Jian.

College of Medicine,Xiamen University,Xiamen 361000,Fujian,China

【Abstract】ObjectiveTo explore the feasibility of lentivirus transfect osteoclast-like cells.MethodsAfter the bone mesenchymal stem cells(BMSC)of rat were induced osteoclast-like cells(OLC),the contrast lentivirus that marked Green fluorescent protein(GFP)was used to transfect the OLC.The fluorescent ratio of different multiplicity of infection(MOI)was observed under fluorescent microscope,and then Tartrate resistant acid phosphatase(TRAP)staining was used to identify the osteoclast-like cells.The most appropriate MOI value was selected and then divided into OLC,NFAT inhibitor(VIVIT),NFAT2iRNA lentivirus,control lentivirus groups,respectively.ResultsThe number of fluorescent cells was increased with elevating of MOI value after contrast lentivirus transfect osteoclast-like cells.The maximum fluorescent number was(41.00±9.19)/view when MOI=15.After different intervention,the mRNA expression of NFAT2 in NFAT inhibitor group and NFAT2iRNA lentivirus group were more decreased than those of OLC and control lentivirus groups(P<0.05).ConclusionsLentivirus could transfect osteoclast-like cells of rat.Furthermore,fluorescent transfect rate is increased with the rise of MOI value in a certain range.

【Key words】Lentivirus;Osteoclast-like cells;Nuclear factor of activated T cells

通訊作者：陳健(1963-)，男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導師，主要從事骨質(zhì)疏松研究。

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No.81272168)；福建省醫(yī)學創(chuàng)新課題資助項目(No.2012-CXB-32)

〔中圖分類號〕R3

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)03-0516-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.002