SIRT1/UCP2通路在脂肪變性HepG2細(xì)胞線粒體能量代謝中的調(diào)控機(jī)制

張玉佩　孔怡琳　楊欽河　鄧遠(yuǎn)軍　梁蔭基　金　玲　何毅芳　李媛媛　王觀龍　程少冰

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東　廣州　510632)

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SIRT1/UCP2通路在脂肪變性HepG2細(xì)胞線粒體能量代謝中的調(diào)控機(jī)制

張玉佩孔怡琳1楊欽河鄧遠(yuǎn)軍梁蔭基金玲2何毅芳李媛媛王觀龍程少冰

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510632)

〔摘要〕目的采用油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生脂變，建立脂肪變性細(xì)胞模型，觀察SIRT1/UCP2通路在脂肪變性HepG2細(xì)胞能量代謝中的調(diào)控機(jī)制。方法采用含有2 mmol/L油酸的DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞24 h后，建立脂肪變性HepG2細(xì)胞模型，并設(shè)置對(duì)照組比較。以油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴形成狀況，并用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)細(xì)胞上清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)含量和細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)含量；采用流式細(xì)胞儀測(cè)定線粒體膜電位的改變，采用磷鉬酸比色試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)含量，運(yùn)用Western印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞SIRT1和UCP2蛋白的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)橘紅色脂滴大量形成，且TG含量明顯升高(P<0.01)，線粒體膜電位及細(xì)胞內(nèi)ATP含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)，SIRT1蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，UCP2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)。結(jié)論油酸誘導(dǎo)的脂肪變性HepG2細(xì)胞模型可以出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂和線粒體能量代謝失衡，其機(jī)制可能與細(xì)胞內(nèi)SIRT1/UCP2通路的激活有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕HepG2細(xì)胞；脂肪變性；SIRT1/UCP2通路；能量代謝

1廣東省中醫(yī)院大學(xué)城醫(yī)院2暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院

第一作者：張玉佩(1982-)，男，碩士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治慢性肝病研究。

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)均無(wú)過(guò)量飲酒史，以肝細(xì)胞彌漫性脂肪病變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征。沉默信息調(diào)節(jié)因子(SIRT)1是一種依賴(lài)于NAD+的去乙?；?，屬于表觀遺傳學(xué)中組蛋白修飾部分，可使多種蛋白質(zhì)的賴(lài)氨酸殘基發(fā)生去乙?；?〕。SIRT1可以促進(jìn)脂類(lèi)物質(zhì)大量被動(dòng)員，并參與肝臟糖異生，同時(shí)影響著胰島素的分泌功能，在NAFLD的防治研究中逐漸引起重視〔2〕。解耦聯(lián)蛋白(UCP)2是一種哺乳動(dòng)物所特有的線粒體內(nèi)膜蛋白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的作用，在NAFLD大鼠肝組織及脂肪變性肝細(xì)胞中UCP2基因和蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，與脂肪酸代謝關(guān)系密切〔3~5〕。本研究旨在觀察脂肪變性HepG2細(xì)胞的脂質(zhì)蓄積程度及SIRT1/UCP2通路與線粒體能量代謝之間的調(diào)控關(guān)系，以期在細(xì)胞水平探討NAFLD的發(fā)病機(jī)制。

1材料和方法

1.1材料HepG2肝癌細(xì)胞株由暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化教研室饋贈(zèng)；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)hyclone公司；油酸購(gòu)自美國(guó)sigma公司；油紅O染色試劑盒、細(xì)胞凋亡線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒和三磷酸腺苷(ATP)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。日本日立公司全自動(dòng)生化分析儀，OLMPUS熒光倒置顯微鏡。寧波新芝生物科技股份有限公司JY96-Ⅱ超聲細(xì)胞粉碎機(jī)，奧地利TECAN公司Tecan-safire2全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)BD FACSAriaTM Cell Sorter 流式細(xì)胞儀。

1.2方法

1.2.1HepG2細(xì)胞培養(yǎng)HepG2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃，CO2濃度為5%。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞長(zhǎng)至瓶壁80%~90%(約每2~3 d)，用0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞并傳代，實(shí)驗(yàn)中設(shè)置對(duì)照組和模型組，分別于6孔板中培養(yǎng)，每組各設(shè)6孔觀察。

1.2.2HepG2細(xì)胞脂肪變性模型的建立將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育貼壁48 h后，更換新鮮培養(yǎng)液，參考Hwang等〔6〕的造模方法改進(jìn)，予含2 mmol/L油酸的DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基孵育HepG2細(xì)胞24 h，對(duì)照組為DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基，油紅O染色鑒定。

1.2.3全自動(dòng)生化儀檢測(cè)細(xì)胞上清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)含量變化細(xì)胞誘導(dǎo)成功后，將各培養(yǎng)孔中的細(xì)胞上清分別加入對(duì)應(yīng)1.5 ml EP管中，用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)培養(yǎng)上清中ALT、AST含量變化。

1.2.4全自動(dòng)生化儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)含量變化取完各孔細(xì)胞上清后，將細(xì)胞用PBS洗滌2遍，加入0.25%胰酶消化細(xì)胞，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基終止消化，并吹打細(xì)胞(確保將各孔內(nèi)的所有細(xì)胞吹下)，將各孔中的細(xì)胞懸液分別移入1.5 ml EP管中，離心(4℃，1 000 r/min，5 min)，棄上清；PBS洗滌細(xì)胞2遍，離心(4℃，1 000 r/min，5 min)，棄上清；將EP管置于冰上，每管各加入異丙醇300 μl；用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)裂解細(xì)胞3 min；裂解后，離心(4℃，3 000 r/min，5 min)，取上清，全自動(dòng)生化儀檢測(cè)上清中的TG含量。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位變化采用JC-1熒光探針檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位變化，細(xì)胞誘導(dǎo)成功后，經(jīng)洗滌、消化，收集對(duì)照組和模型組的細(xì)胞，PBS重懸細(xì)胞，4℃離心5 min，棄上清，每管加入200 μl JC-1染液，混勻，37℃避光孵育15 min，離心(4℃，1 000 r/min，5 min)，棄上清，收集細(xì)胞，用500 μl 1×染色結(jié)合液洗2次，吸取500 μl 1×染色結(jié)合液重新懸浮細(xì)胞，混勻，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)，分析平均熒光強(qiáng)度值(MIF)。

1.2.6磷鉬酸比色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP含量變化細(xì)胞誘導(dǎo)成功后，經(jīng)洗滌、消化，收集對(duì)照組和模型組的細(xì)胞，PBS重懸細(xì)胞，離心(4℃，1 000 r/min，5 min)，棄上清，每管加入300 μl熱雙蒸水，置于熱水浴(95℃)中勻漿破碎15 min，后將細(xì)胞懸液置于沸水浴中加熱10 min，取出渦旋混勻1 min，采用ATP含量測(cè)試盒(磷鉬酸比色法)檢測(cè)，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值，計(jì)算每管ATP濃度。

1.2.7Western印跡法檢測(cè)細(xì)胞SIRT1和UCP2蛋白表達(dá)水平 取適量裂解液，使用前先加入苯甲基磺酰氟(PMSF)，使PMSF終濃度為1 mmol/L。計(jì)數(shù)細(xì)胞，按照每6×106個(gè)細(xì)胞加入1 ml RIPA裂解液，4℃離心5 min，根據(jù)碧云天BCA蛋白濃度試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)蛋白含量進(jìn)行測(cè)定。HepG2細(xì)胞樣本進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、4℃過(guò)夜。洗滌后加入二抗，孵育，充分洗滌，然后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光、曝光、 顯影、 定影，最后對(duì)結(jié)果進(jìn)行光密度掃描分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0軟件行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴變化對(duì)照組：細(xì)胞體積較小，細(xì)胞邊緣清晰，大部分細(xì)胞無(wú)明顯橘紅色脂滴蓄積，僅有少數(shù)細(xì)胞內(nèi)有少量橘紅色脂滴，顏色較淡；模型組：細(xì)胞明顯腫大，胞膜輪廓模糊，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)較多橘紅色脂滴，并出現(xiàn)脂滴融合現(xiàn)象，部分脂滴甚至融合呈鏈狀或環(huán)狀。見(jiàn)圖1。

圖1　油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴(×400)

2.2細(xì)胞上清ALT、AST含量變化與對(duì)照組〔(3.17±0.41)、(8.83±0.75)U/L〕比較，模型組在誘導(dǎo)24 h后，細(xì)胞上清中的ALT〔(3.33±0.52)U/L〕、AST〔(10.5±5.17)U/L〕含量呈上升趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3細(xì)胞內(nèi)TG含量的變化與對(duì)照組〔(0.19±0.01)mmol/L〕比較，模型組的HepG2細(xì)胞內(nèi)TG含量〔(0.29±0.04)mmol/L〕明顯增高(P<0.01)。

2.4細(xì)胞線粒體膜電位的變化采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞熒光激發(fā)的強(qiáng)度，綠色熒光強(qiáng)度越高、線粒體膜電位越低。結(jié)果表明：對(duì)照組MIF為9 636±558，模型組MIF為7 214.7±1 335.1，與對(duì)照組比較，模型組線粒體膜電位顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2　細(xì)胞線粒體膜電位變化

2.5細(xì)胞內(nèi)ATP含量的變化與對(duì)照組〔(1 520.54±372.79)μmol/gprot〕比較，模型組ATP含量〔(949.8±193.76)μmol/gprot〕顯著降低(P<0.01)。

2.6細(xì)胞SIRT1、UCP2蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組(0.475 2±0.173 9、0.135±0.067)比較，模型組SIRT1蛋白表達(dá)(0.141 1±0.393 8)顯著降低(P<0.05)，UCP2蛋白表達(dá)(0.653 4±0.123 8)顯著升高(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3　各組HepG2細(xì)胞SIRT1 和 UCP2蛋白的表達(dá)

3討論

無(wú)論在歐美還是亞洲，NAFLD已成為該地區(qū)發(fā)病率穩(wěn)居前列的慢性肝病，且呈低齡化發(fā)病趨勢(shì)〔7~9〕。研究表明NAFLD是糖脂代謝紊亂性疾病和心腦血管疾病發(fā)生的關(guān)鍵危險(xiǎn)因素〔10，11〕，其發(fā)病危險(xiǎn)指數(shù)呈快速上升的趨勢(shì)。HepG2肝癌細(xì)胞株是體外脂肪變性細(xì)胞模型重要載體，與肝細(xì)胞相比，其具有生物學(xué)功能相似和對(duì)脂毒性的耐受能力更強(qiáng)的特點(diǎn)，是國(guó)內(nèi)外誘導(dǎo)脂變模型使用最多的細(xì)胞〔12，13〕。

研究表明線粒體是脂肪酸進(jìn)行β氧化、三羧酸循環(huán)、ATP合成和活性氧(ROS)形成的主要場(chǎng)所〔14〕，也是細(xì)胞代謝所需能量的主要來(lái)源，也是細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的源頭，肝臟脂質(zhì)蓄積越嚴(yán)重，肝細(xì)胞線粒體功能損傷越明顯〔15〕，線粒體呼吸鏈?zhǔn)荝OS的主要來(lái)源，線粒體功能障礙會(huì)損害肝臟的脂肪穩(wěn)態(tài)，引起ROS的過(guò)量釋放，導(dǎo)致線粒體膜電位和呼吸鏈功能下降，ATP合成障礙〔16〕。線粒體膜流動(dòng)性下降，脂肪在線粒體內(nèi)產(chǎn)生堆積，脂肪酸產(chǎn)生直接脂毒性，可造成線粒體腫脹，降低線粒體內(nèi)酶的活性，引起肝細(xì)胞線粒體功能障礙，從而誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡〔17〕。線粒體功能障礙還與脂質(zhì)過(guò)氧化關(guān)系密切，線粒體生物膜的磷脂、酶和膜受體相關(guān)多聚不飽和脂肪酸的側(cè)鏈及核酸等大分子物質(zhì)反應(yīng)形成脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物如丙二醛和壬烯，其能夠與線粒體蛋白結(jié)合和進(jìn)一步損害線粒體呼吸鏈復(fù)合物，直接或間接的損害線粒體DNA，誘導(dǎo)線粒體產(chǎn)生更多ROS，形成惡性循環(huán)〔18〕。本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)觀察到脂肪變性HepG2細(xì)胞線粒體膜電位明顯降低，同時(shí)該組細(xì)胞較對(duì)照組ATP含量下降、TG含量增加。由此推測(cè)，油酸誘導(dǎo)的脂肪變性細(xì)胞模型可以引起細(xì)胞內(nèi)脂肪酸代謝發(fā)生障礙，進(jìn)而加重TG在細(xì)胞內(nèi)的蓄積，引起細(xì)胞線粒體膜電位降低，能量代謝發(fā)生障礙。線粒體能量代謝障礙與NAFLD發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切〔19〕，SIRT1/UCP2通路是細(xì)胞脂質(zhì)代謝和線粒體能量代謝調(diào)控的關(guān)鍵通路。SIRT1是一種核蛋白，能夠作為轉(zhuǎn)錄因子抑制UCP2轉(zhuǎn)錄活性，SIRT1通過(guò)與UCP2啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合，抑制UCP2基因的表達(dá)，減少其編碼的線粒體內(nèi)膜蛋白的生成，從而抑制線粒體中解偶聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生〔20〕。在解偶聯(lián)狀態(tài)下，H+途徑ATP合成旁路從線粒體膜外重新進(jìn)入膜內(nèi)，從而抵消跨膜質(zhì)子的電化學(xué)梯度，使線粒體產(chǎn)生氧化磷酸化解偶聯(lián)作用，阻止細(xì)胞內(nèi)線粒體通過(guò)呼吸方式將能量合成為ATP〔21〕。Della-Morte等〔22〕發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以通過(guò)活化SIRT1，抑制UCP2的表達(dá)，改善線粒體能量代謝，從而在腦缺血損傷大鼠中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用。本研究結(jié)果提示油酸成功誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪變性后，SIRT1蛋白對(duì)UCP2蛋白的調(diào)控作用受到抑制，線粒體解耦連效率降低，線粒體膜電位下降，從而使能量代謝發(fā)生障礙，由此可見(jiàn)，在NAFLD發(fā)病過(guò)程中，SIRT1/UCP2通路可能在線粒體能量代謝過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且未來(lái)可能成為防治NAFLD的潛在靶點(diǎn)。

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〔2015-09-14修回〕

(編輯袁左鳴)

Regulatory mechanism of SIRT1/UCP2 pathway in mitochondrial energy metabolism of steatotic HepG2 cells

ZHANG Yu-Pei, KONG Yi-Lin, YANG Qin-He,etal.

Medical College, Jinan University, Guangzhou 510632，Guangdong, China

【Abstract】ObjectiveTo establish a steatotic HepG2 cell model induced by oleic acid, and observe the regulatory mechanism of SIRT1/UCP2 pathway in energy metabolism of steatotic HepG2 cells.MethodsInduced by DMEM medium of 2 mmol/L oleic acid for 24 hours, the steatotic HepG2 cell model was successfully established.Then, lipid droplets in cytoplasm were observed by oil red O staining, while alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) in serum, and triglyceride (TG) accumulation in HepG2 cells were measured by automatic biochemical analyzer. The changes of mitochondrial membrane potential were determined by flow cytometry, and intracellular adenosine triphosphate(ATP) level was detected by biological reagent kit. The protein expressions of SIRT1 and UCP2 were analyzed by Western blot.ResultsCompared with those of control group, the level of TG accumulation was significantly higher(P<0.01), and lots of red lipid droplets inside cytoplasm were visible, while mitochondrial membrane potential and intracellular ATP levels were significantly reduced(P<0.05，P<0.01) in model group. The expression of SIRT1 protein was significantly lower(P<0.05), whereas the expression of UCP2 protein was significantly higher(P<0.01) in model group.ConclusionsThe oleic acid-induced steatosis in HepG2 cells might result in lipid metabolism disorder and mitochondrial dysfunction, possibly by activating the SIRT1/UCP2 pathway in HepG2 cells.

【Key words】HepG2 cells; Steatosis; SIRT1/UCP2 pathway; Energy metabolism

通訊作者：楊欽河(1961-)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治慢性肝病及脂代謝疾病研究。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81302878，81273617)；中國(guó)肝炎防治基金會(huì)天晴肝病研究基金(No.cfhpc20132184)；暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院科研培育專(zhuān)項(xiàng)基金(No.2014205)；廣東省中醫(yī)藥局項(xiàng)目(No.20151224);廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項(xiàng)目(No.A2015521)

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕Q493.5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)03-0513-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.001

·基礎(chǔ)研究·