雷公藤內(nèi)酯醇對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠脊髓和背根神經(jīng)節(jié)中白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α表達(dá)的影響及其與鎮(zhèn)痛的關(guān)系

陳　偉　張旭東　逯卓卉　韋登明　林　榮

(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，浙江　寧波　315211)

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雷公藤內(nèi)酯醇對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠脊髓和背根神經(jīng)節(jié)中白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α表達(dá)的影響及其與鎮(zhèn)痛的關(guān)系

陳偉張旭東逯卓卉韋登明林榮

(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，浙江寧波315211)

〔摘要〕目的觀察不同劑量雷公藤內(nèi)酯醇(TP)對佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠脊髓背角和背根神經(jīng)節(jié)(DRG)中白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α表達(dá)的影響，探討TP對AA鎮(zhèn)痛作用的脊髓神經(jīng)生物學(xué)機制。方法選用SD大鼠50只，隨機分成正常組(A組)、模型組(B組)、TP低(C組)、中(D組)、高(E組)劑量治療組。造模后14 d，C、D、E組大鼠采取不同劑量TP腹腔注射給藥，每天1次，連續(xù)給藥9 d。檢測大鼠熱痛閾，免疫組化技術(shù)檢測腰5(L5)脊髓背角和DRG節(jié)段中IL-1β、TNF-α的表達(dá)變化。結(jié)果治療9 d后，B組大鼠熱痛閾顯著低于A組(P<0.01)，C、D、E組熱痛閾顯著高于B組(P<0.05,P<0.01)，TP可顯著提高AA大鼠熱痛閾；B組大鼠L5節(jié)段脊髓背角和DRG中IL-1β、TNF-α陽性表達(dá)水平顯著高于A組(P<0.01)，C、D、E組大鼠L5節(jié)段脊髓背角和DRG中IL-1β、TNF-α陽性表達(dá)水平顯著低于B組(P<0.01)。結(jié)論TP對RA具有良好鎮(zhèn)痛作用；TP可能是通過下調(diào)AA大鼠脊髓背角和DRG中IL-1β、TNF-α的表達(dá)水平起到鎮(zhèn)痛作用。

〔關(guān)鍵詞〕雷公藤內(nèi)酯醇；佐劑性關(guān)節(jié)炎；鎮(zhèn)痛；白細(xì)胞介素-1β；腫瘤壞死因子-α

第一作者：陳偉(1989-)，男，碩士，主要從事關(guān)節(jié)炎鎮(zhèn)痛機制研究。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性全身性自體免疫性疾病，流行病學(xué)研究顯示成年人RA發(fā)病率為0.2%~0.8%〔1〕。疼痛是RA最主要的癥狀，嚴(yán)重影響身體的功能和健康，控制疼痛是治療RA的首要環(huán)節(jié)，也是判定該病療效的標(biāo)準(zhǔn)之一〔2〕。雷公藤內(nèi)酯醇(TP)是中藥雷公藤藥理活性最強的化學(xué)單體，對RA具有良好的鎮(zhèn)痛作用，現(xiàn)有鎮(zhèn)痛作用研究主要集中在TP對關(guān)節(jié)局部及血液中炎性細(xì)胞因子的影響。已有資料表明〔3,4〕，關(guān)節(jié)炎疼痛的發(fā)生與脊髓白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α的增加有關(guān)，抑制脊髓IL-1β、TNF-α的表達(dá)可以產(chǎn)生明顯鎮(zhèn)痛作用，而TP對RA的鎮(zhèn)痛作用與脊髓中樞神經(jīng)細(xì)胞IL-1β、TNF-α表達(dá)關(guān)系尚未見報道，TP阻斷RA痛覺傳導(dǎo)的脊髓中樞神經(jīng)機制仍不清楚。本實驗在建立佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠模型基礎(chǔ)上，以熱痛閾、腰5(L5)節(jié)段脊髓和背根神經(jīng)節(jié)(DRG)中IL-1β、TNF-α表達(dá)水平為觀察指標(biāo)，探討不同劑量TP對AA的鎮(zhèn)痛作用及其與脊髓和DRG中IL-1β、TNF-α表達(dá)水平變化的關(guān)系。

1材料與方法

1.1動物和藥品SD大鼠50只，體質(zhì)量180~220 g，由寧波大學(xué)實驗動物中心提供，合格證0102013。飼養(yǎng)環(huán)境安靜，室溫20℃左右，明暗各12 h，自由攝食，飲水。TP(純度為99.9%，批號20130111)購于上海科衛(wèi)醫(yī)療技術(shù)研究所產(chǎn)品，將20 mg TP于4 ml 1,2-丙二醇中99℃水浴6 h溶解，加96 ml生理鹽水使TP終濃度為200 μg/ml，同時制備4%丙二醇水溶液100 ml，過濾除菌分裝，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑與儀器①主要試劑；弗氏完全佐劑：美國Sigma公司產(chǎn)品；戊巴比妥鈉:德國Merck公司產(chǎn)品；兔抗IL-1β、TNF-α多克隆抗體原液：博士德公司產(chǎn)品；DAB顯色試劑盒：博士德公司產(chǎn)品；SP免疫組化染色試劑盒：博奧森公司產(chǎn)品。②主要儀器：ZH-LUO/B鼠尾測痛儀：正華生物儀器公司；HM-325石蠟切片機：德國LEICA公司；BM-Ⅶ包埋機：宏業(yè)醫(yī)用儀器公司；CX40生物顯微鏡：日本olympus公司。

1.3方法

1.3.1動物分組及AA大鼠模型制備適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，采用簡單隨機的方法將SD大鼠分成正常組(A組)、模型組(B組)、低劑量治療組(C組)，中劑量治療組(D組)，高劑量治療組(E組)，大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后，A組于右后趾皮內(nèi)注入0.1 ml生理鹽水，其余各組大鼠在相同部位注入0.1 ml弗氏完全佐劑制備AA大鼠模型，待繼發(fā)關(guān)節(jié)炎出現(xiàn)，標(biāo)志造模成功，大約需要10~14 d。造模后第14天，A組和B組大鼠腹腔注射等體積4%丙二醇溶液，C、D、E組大鼠分別按0.1、0.2、0.4 mg/kg腹腔注射TP溶液，每日1次，連續(xù)9 d。

1.3.2熱痛閾測定分別于造模前1 d，造模后14 d、23 d(TP治療9 d)，用鼠尾測痛儀測定各組大鼠熱痛閾。測定時將鼠尾測痛儀溫度調(diào)為55℃，將距大鼠尾尖0.5 cm處對準(zhǔn)測痛光源，由輻射開始到大鼠尾擺動以逃避輻射熱的時間為甩尾的潛伏期，連續(xù)測3次，每次間隔>5 min，將3次甩尾潛伏期的平均值作為熱痛閾。

1.3.3各組大鼠L5節(jié)段脊髓和DRG中IL-1β、TNF-α的表達(dá)造模后23 d，大鼠熱痛閾測定結(jié)束后，經(jīng)左心室灌流固定，先以37℃生理鹽水快速沖洗，直至由右心耳流出的液體清亮無色，然后用4℃預(yù)冷的4%多聚甲醛先快后慢灌流固定，灌注完畢后取L5節(jié)段脊髓和DRG，入4%多聚甲醛固定液固定24 h后，L5節(jié)段脊髓和DRG經(jīng)脫水，石蠟包埋、切片、按照試劑盒說明書進(jìn)行IL-1β、TNF-α免疫組織化學(xué)染色。每只動物隨機選取脊髓和DRG切片各3張，分別在×200、×400倍鏡下取6個視野進(jìn)行圖像分析(JD801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng))，測量陽性產(chǎn)物的積分光密度(IOD)。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1不同劑量TP對AA大鼠熱痛閾的影響造模前各組大鼠熱痛閾無顯著差異(P>0.05)。造模后14 d，A組大鼠熱痛閾顯著高于B組(P<0.01)；造模后23 d(TP治療9 d)，C、D、E組熱痛閾顯著高于B組(P<0.05,P<0.01,P<0.01)，D組熱痛閾顯著高于C組(P<0.05)，E組熱痛閾顯著高于C、D組(P<0.01,P<0.01)。見表1。

表1　各組大鼠熱痛閾變化

與B組比較:1)P<0.05,2)P<0.01;與C組比較:3)P<0.05,4)P<0.01;與D組比較:5)P<0.01；下表同

2.2不同劑量TP對各組大鼠L5脊髓背角和DRG中TNF-α含量變化影響造模后23 d，處死動物后提取相應(yīng)節(jié)段脊髓和DRG，制備石蠟切片，免疫組化染色觀察。B組大鼠L5 DRG和脊髓背角中TNF-α表達(dá)明顯增加，與A組比較差異有顯著性(P<0.01)，經(jīng)TP治療后C、D、E組IOD均顯著低于B組(P<0.01)；D組顯著低于C組(P<0.01)；E組顯著低于C、D組(P<0.01)，見表2。

表2　各組大鼠L5脊髓背角和DRG中TNF-α

2.3不同劑量TP對各組大鼠L5脊髓背角和DRG中IL-1β含量變化影響L5DRG和脊髓背角中B組IL-1β的IOD均顯著高于A組(P<0.01)；經(jīng)TP治療后，C、D、E組IL-1β的IOD均顯著低于B組(P<0.01)；并且D組均顯著低于C組(P<0.01)；L5DRG中，E組顯著低于C、D組(P<0.01)；L5脊髓背角中，E組顯著低于C組(P<0.01)，與D組之間無顯著差異(P>0.05)。見表3。

表3　各組大鼠L5脊髓背角和DRG中IL-1β陽性

3討論

雷公藤屬衛(wèi)茅科植物，是一種具有清熱解毒，祛風(fēng)通絡(luò)，舒筋活血，除濕消腫止痛的中草藥，TP是雷公藤藥理活性最強的化學(xué)單體，具有良好的鎮(zhèn)痛作用。疼痛是RA最主要的癥狀，對RA患者進(jìn)行鎮(zhèn)痛治療及了解RA疼痛的發(fā)生機制是目前的研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)〔5〕，關(guān)節(jié)炎持續(xù)性疼痛產(chǎn)生的原因可能與中樞敏化現(xiàn)象相關(guān)，患者處于免疫功能異常等病理狀態(tài)時，脊髓的膠質(zhì)細(xì)胞就會被激活，釋放出多種致痛物質(zhì)，例如IL-1β、TNF-α，一方面作用于痛覺神經(jīng)元，使其興奮性增強，向高級中樞傳遞疼痛信號，另一方面降低神經(jīng)元的興奮閾值，造成中樞敏化，使很多正常時不能引起疼痛的低強度刺激也能激活傷害性感受器。同時，這些細(xì)胞因子還可以作用于膠質(zhì)細(xì)胞，產(chǎn)生正反饋作用，進(jìn)一步增加細(xì)胞因子的數(shù)量，造成持續(xù)性疼痛。

痛閾是目前被廣泛采用以判斷鎮(zhèn)痛效果的指標(biāo)。本實驗說明AA大鼠發(fā)生痛覺超敏，低、中、高劑量TP均起到了鎮(zhèn)痛作用，尤其以高劑量組起效快，效果好。 在AA大鼠熱痛閾顯著降低的同時，一些促炎癥因子作為啟動因子，通過影響神經(jīng)系統(tǒng)中的某些關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在傷害性刺激信息傳遞過程中發(fā)揮重要作用。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，脊髓中IL-1β可以通過增加NR1亞基的磷酸化來易化疼〔6〕。IL-1β是一種重要的炎性細(xì)胞因子，可作用于機體的各個系統(tǒng)，具有廣泛的生物學(xué)活性。Sung等〔7〕研究顯示W(wǎng)istar大鼠鞘內(nèi)注射IL-1β會造成痛覺過敏，并上調(diào)脊髓內(nèi)iNOS的表達(dá)。Shi等〔8〕的研究顯示IL-1β可在環(huán)氧化酶的作用下，上調(diào)脊髓中致痛物質(zhì)PGE2的表達(dá)，表明IL-1β在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中參與痛覺調(diào)制，與痛敏的發(fā)展密切相關(guān)。TNF-α是一種前炎性細(xì)胞因子，有多種生物學(xué)效應(yīng)，與疼痛的產(chǎn)生和持續(xù)存在密切關(guān)系。激活的神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增加了脊髓中的TNF-α的表達(dá)，并進(jìn)一步與其受體TNFR1結(jié)合上調(diào)了背角NR1亞基的磷酸化，從而易化了脊髓痛信號的傳遞，引起機體痛覺過敏和異常性疼痛的發(fā)生〔9〕。Homma等〔10〕將外源性TNF-α導(dǎo)入正常SD大鼠L5DRG中，發(fā)現(xiàn)TNF-α?xí)l(fā)疼痛及痛覺超敏，提示內(nèi)源性TNF-α參與了大鼠早期痛覺超敏的發(fā)生。可見IL-1β及TNF-α在脊髓痛覺調(diào)制中起重要作用。

目前的鎮(zhèn)痛研究主要針對TP對關(guān)節(jié)局部及血中炎性因子IL-1β、TNF-α的影響。Zhang等〔11〕的研究顯示雷公藤可顯著降低CIA模型大鼠血清TNF-α水平。Jiao等〔12〕的研究也表明TP可顯著抑制體外培養(yǎng)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β及TNF-α。但是TP對脊髓炎性因子IL-1β、TNF-α表達(dá)的影響及其鎮(zhèn)痛的神經(jīng)生物學(xué)機制，國內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見報道。本實驗表明AA的疼痛與脊髓背角和L5DRG中IL-1β及TNF-α的表達(dá)增加有關(guān)，在RA形成后，來自外周傷害性信息傳入增加，導(dǎo)致DRG神經(jīng)元和脊髓內(nèi)IL-1β及TNF-α進(jìn)一步增多，加重疼痛的發(fā)生。TP可明顯抑制AA大鼠脊髓背角和L5DRG中IL-1β及TNF-α的表達(dá)。分析這一結(jié)果產(chǎn)生的可能原因為：在關(guān)節(jié)炎形成后，TP使傷害性刺激信息傳入減少，因而脊髓背角和L5DRG中IL-1β及TNF-α的合成也相應(yīng)減少。綜上所述，本研究結(jié)果提示TP對RA的鎮(zhèn)痛作用可能與其下調(diào)脊髓背角和L5DRG中TNF-α和IL-1β陽性產(chǎn)物表達(dá)有關(guān)，其具體的生物學(xué)機制有待進(jìn)一步研究加以明確。

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〔2014-08-31修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

通訊作者：林榮(1978-)，男，實驗師，主要從事類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎防治機制研究。

基金項目：寧波市藥物依賴及共患精神疾病防治創(chuàng)新團隊項目(2009B21002)；寧波市自然科學(xué)基金項目(2014A610247)；寧波大學(xué)學(xué)科項目(XKL14D2102)

〔中圖分類號〕R285.5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)04-0808-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.04.017