野木瓜多糖對(duì)肝損傷大鼠的保護(hù)作用

陳雪梅

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，貴州　遵義　563003)

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野木瓜多糖對(duì)肝損傷大鼠的保護(hù)作用

陳雪梅

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，貴州遵義563003)

〔摘要〕目的研究木瓜多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損傷大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制。方法采用四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝損傷,全自動(dòng)生化分析儀分別檢測(cè)血清總蛋白(TP)、清蛋白(ALB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)；采用硫代巴比妥酸和黃嘌呤氧化法檢測(cè)血清中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性，應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)各組肝臟組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1的表達(dá)。結(jié)果木瓜多糖組血清TP、ALB較模型組顯著增高，GPT、GOT活性顯著降低；血清中SOD的活性均明顯增高、MDA含量也顯著降低(P<0.05)，且呈劑量依賴(lài)性；與模型組相比，木瓜多糖組能夠使大鼠肝臟內(nèi)的TGF-β1 mRNA表達(dá)下降(P<0.05)。結(jié)論木瓜多糖的抗氧化作用及降低TGF-β1的表達(dá)可能是其對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損傷的保護(hù)機(jī)制之一。

〔關(guān)鍵詞〕野木瓜多糖；肝損傷；超氧化物歧化酶；丙二醛；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1

第一作者：陳雪梅(1974-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事小兒內(nèi)科臨床研究。

野木瓜為薔薇科木瓜屬植物，具有抗炎、抗病菌、抗衰老、抗腫瘤等作用，野木瓜富含有機(jī)酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)等多種元素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還含有多糖、皂苷、黃酮、果膠等化合物，是一種食藥兩用的珍貴天然植物〔1~3〕。目前木瓜多糖對(duì)肝臟的保護(hù)作用研究較少，本實(shí)驗(yàn)觀察木瓜多糖對(duì)大鼠肝損傷中血清酶、蛋白合成能力的影響,探討木瓜多糖對(duì)肝損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1材料和方法

1.1材料 野木瓜購(gòu)于貴州省遵義市正安縣；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，四氯化碳(CCl4)(國(guó)藥集團(tuán)分析純，批號(hào)20120125)；聯(lián)苯雙酯(浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，批號(hào)120116)；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。721紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光電研究所)；BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士)。

1.2野木瓜多糖的制備野木瓜構(gòu)于遵義市藥材公司，采用水提醇沉法提?。喝?00 g野木瓜粉碎成粗粉，加入5 000 ml蒸餾水后加熱提取3 h，紗布過(guò)濾后合并濾液，10 000 r/min離心20 min，然后采用BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至250 ml濃縮液。加入終濃度為80%的乙醇沉淀，靜置24 h后，離心取沉淀。再將沉淀用蒸餾水溶解，用Seveage試劑(氯仿∶正丁醇=5∶1)脫蛋白數(shù)次后，進(jìn)行24 h透析，其中流水透析12 h，蒸餾水靜置12 h，取透析液濃縮后，冷凍干燥得到野木瓜多糖〔4~7〕。

1.3大鼠肝損傷模型的制備選用清潔級(jí)SD雄性大鼠〔購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物編號(hào)：SCXK(渝)2011-0005〕，10~12周齡，體重為150~180 g，模型組按3 ml/kg(CCl4與橄欖油按2∶3比例混合，3 ml/kg)皮下注射40%CCl4，對(duì)照組按3 ml/kg皮下注射橄欖油，每周2次，首劑加倍，連續(xù)注射4 w〔8~11〕。

1.4實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分六組，每組10只雄性大鼠：①正常組；②模型組：SD大鼠以3 ml/kg皮下注射40%CCl4，連續(xù)注射4 w；③陽(yáng)性對(duì)照組：以聯(lián)苯雙酯100 mg·kg-1·d-1灌胃，連續(xù)4 w；④木瓜多糖組：大鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷模型+不同劑量野木瓜多糖灌胃(低、中、高劑量組分別以濃度為40、80、160 mg/kg野木瓜)，每天一次共4 w〔7〕。

1.5血清總蛋白(TP)、清蛋白(ALB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)的測(cè)定于腹腔動(dòng)脈取血，離心分離血清，利用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.6SOD和MDA表達(dá)的測(cè)定按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定各組血清SOD和MDA的水平。

1.7Real-time PCR測(cè)定肝臟中TGF-β1 mRNA表達(dá)大鼠肝臟總RNA采用Trizol法提取，然后采用實(shí)時(shí)定量-逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行基因片段擴(kuò)增并定量。大鼠TGF-β1及內(nèi)參基因(β-actin)引物如下：TGF-β1上游引物為5'-atacgcctgagtggctgtct-3'，下游引物為5'- ttgggactgatcccattgat-3'；β-actin上游引物為5'-gtagccatccaggctgtgtt-3'，下游引物為5'-accctcatagatgggcacag-3'。反應(yīng)條件：①Real-time PCR：95℃，5 s，59℃，20 s，72℃，20 s，40個(gè)循環(huán)。②溶解曲線(xiàn)：95℃，5 s，65℃，5 s，60個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)各管所加模板RNA的量約為1 μg。最終通過(guò)Real-time PCR儀記錄的Ct值而對(duì)起始模板相對(duì)定量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1TP、ALB、GPT、GOT的測(cè)定木瓜多糖組大鼠血清TP和ALB明顯高于模型組，GPT和GOT水平明顯低于模型組(P<0.05)，并且呈劑量依賴(lài)性；野木瓜多糖高劑量組大鼠血清中TP，ALB，GPT和GOT水平與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1　野木瓜對(duì)大鼠血清TP、ALB、GPT、

與模型組比較：1)P<0.05，下表同

2.2SOD和MDA表達(dá)的測(cè)定木瓜多糖組大鼠血清中SOD明顯高于模型組，MDA水平明顯低于模型組(P<0.05)，并且呈劑量依賴(lài)性；木瓜多糖高劑量組大鼠血清中SOD和 MDA水平與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2　野木瓜對(duì)大鼠血清中SOD和MDA

2.3Real-time PCR測(cè)定肝臟中TGF-β1 mRNA表達(dá)模型組TGF-β1 mRNA的表達(dá)高于正常組(206.47±9.14 vs 38.25±2.09，P<0.05)，木瓜多糖低、中、高劑量組中TGF-β1 mRNA明顯低于模型組(136.85±8.31、97.96±4.61、58.42±4.87，P<0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組(54.31±3.28)與木瓜多糖高劑量組無(wú)顯著差異(P>0.05)。

3討論

肝臟是人體內(nèi)最大的實(shí)質(zhì)性腺體，是體內(nèi)新陳代謝的中心站。肝損傷是肝臟最常見(jiàn)的病理過(guò)程，由此引起的肝臟疾病如肝纖維化、肝硬化及肝腫瘤等嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康，因此對(duì)肝臟損傷的藥物研究具有重要意義。

木瓜為薔薇科木瓜屬，是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的藥食兩用的“果之珍品”，中醫(yī)認(rèn)為木瓜有舒筋活絡(luò)、健脾開(kāi)胃，舒肝止痛，祛風(fēng)除濕之效；能治療腰膝疼痛、腳氣水腫、痢疾霍亂、心痛腹痛等疾病。另外，木瓜還有抗菌消炎、護(hù)肝降酶、清暑利尿、解酒祛痰等作用。對(duì)于木瓜化學(xué)成分的研究表明，其中含有蘋(píng)果酸、枸櫞酸、酒石酸、抗壞血酸等多種有機(jī)酸以及苷類(lèi)、黃酮、氨基酸、鞣質(zhì)等成分，但對(duì)木瓜多糖的研究則鮮見(jiàn)報(bào)道。

CCl4可使大鼠體內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基，而肝臟極易受到自由基的侵害而發(fā)病，造成肝損傷。CCl4肝損傷模型是經(jīng)典的化學(xué)性肝損傷動(dòng)物模型，CCl4模型中CCl4在肝微粒體細(xì)胞色素P-450激活下生成CCl3·自由基，這些自由基可與肝細(xì)胞內(nèi)大分了發(fā)生其價(jià)結(jié)合，也可攻擊膜不飽和脂質(zhì)，引起脂質(zhì)過(guò)氧化，使肝細(xì)胞損傷，轉(zhuǎn)氨酶從受損的肝細(xì)胞內(nèi)溢出，使血清中轉(zhuǎn)氨酶升高。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的主要降解產(chǎn)物，可進(jìn)一步損傷肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，其含量的大小可以間接反映自由基對(duì)組織的破壞程度。MDA通常和SOD聯(lián)合使用，一起反映氧自由基對(duì)細(xì)胞的損傷程度。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明木瓜多糖能夠改善CCl4引起的肝功能損傷。

TGF-β1是被公認(rèn)為與肝纖維化發(fā)生關(guān)系最為密切的細(xì)胞因子，不僅促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖及分化，促進(jìn)膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白合成 通過(guò)抑制蛋白酶的合成來(lái)阻止基質(zhì)蛋白的降解．而且可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞參與炎性反應(yīng)〔12，13〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示木瓜多糖能過(guò)明顯降低模型組中TGF-β1 mRNA的表達(dá)。

綜上，木瓜多糖能夠改善CCl4所致的肝臟損傷，其機(jī)制可能與其增加自由基清除酶活力，清除輻射過(guò)程中脂質(zhì)過(guò)氧化物的形成及降低TGF-β1 mRNA 的表達(dá)有關(guān)，為野木瓜的食用藥用研究提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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〔2014-08-30修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕Q813.1

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)04-0775-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.04.003