桃腐爛病病原菌的分離鑒定

屈興武 周東有 徐清月

摘 要：目的：尋找引起屈家?guī)X地區(qū)桃樹(shù)果實(shí)腐爛病的致病微生物種類(lèi)。方法：分別采用細(xì)菌培養(yǎng)通用培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基，對(duì)采集自果林的腐爛的桃果實(shí)等樣本進(jìn)行微生物純化，對(duì)各種微生物分離物進(jìn)行形態(tài)觀測(cè)，結(jié)合16rDNA序列分析和致病性測(cè)定，對(duì)致病微生物進(jìn)行鑒定。結(jié)果：從病區(qū)采集到的各種樣本經(jīng)過(guò)多步分離純化均發(fā)現(xiàn)了成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans），經(jīng)室內(nèi)致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證實(shí)該細(xì)菌能夠使得桃果實(shí)腐爛。結(jié)論：造成桃果實(shí)腐爛的致病菌為成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）。

關(guān)鍵詞：桃果實(shí);果實(shí)腐爛病;致病菌鑒定;形態(tài)學(xué)觀察;16rDNA序列分析;致病性測(cè)定

中圖分類(lèi)號(hào) S435文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2020）（02-03）-0098-03

Isolation and Identification of Pathogen of Peach Rot

Qu Xingwu et al.

（Jingchu University of Technology， Jingmen 448000， China）

Abstract： Objective： to find out the pathogenic microorganism species causing peach tree fruit rot disease in qujialing area. [methods] bacterial culture medium and PDA medium were used to purify microorganisms from rotting peach fruits collected from fruit forests， and morphological observation was made on various microbial isolates. Pathogenic microorganisms were identified by combining 16rDNA sequence analysis and pathogenicity determination.? Results ： all kinds of samples were collected from the ward， Clumps are found through multi-step purification generic bacteria （Pantoea agglomerans）， through indoor pathogenic experiment results， confirmed that the bacteria can make TaoGuo real decay.? conclusion：TaoGuo real decay caused by bacterial pathogens are clouds generic bacteria （Pantoea agglomerans）.

Key words： Peach fruit; Fruit rot; Identification of pathogenic bacteria; Morphological observation; 16rDNA sequence analysis; Pathogenicity test

桃（Amygdaluspersica L.）為薔薇科、桃屬落葉小喬木，其果實(shí)味甜多汁，性甘味平，大多數(shù)人均可食用，且營(yíng)養(yǎng)豐富，含蛋白質(zhì)、糖、纖維素、脂肪、鐵、磷、鈣、胡蘿卜素、維生素B1、有機(jī)酸等多種營(yíng)養(yǎng)成分。湖北屈家?guī)X地勢(shì)較高，夏旱嚴(yán)重，近年來(lái)因地制宜大力發(fā)展桃樹(shù)種植，有效地規(guī)避了當(dāng)?shù)貒?yán)重的夏旱，取得了不錯(cuò)的經(jīng)濟(jì)效益，為當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶(hù)增收脫貧、帶動(dòng)地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展做出了突出貢獻(xiàn)。

在生產(chǎn)中，桃果實(shí)可能會(huì)受到多種致病菌的侵染，引發(fā)多種病害，導(dǎo)致減產(chǎn)和降低商品性。2017—2018年，屈家?guī)X管理區(qū)月寶山桃園種植基地有大規(guī)模軟腐病的發(fā)生，導(dǎo)致葉片變黃、脫落，桃果實(shí)輕則品相變差，重則完全腐壞，導(dǎo)致桃農(nóng)嚴(yán)重減產(chǎn)歉收。為此，筆者通過(guò)林間采樣，對(duì)引起荊門(mén)屈家?guī)X管理區(qū)桃果實(shí)腐爛病的病原菌進(jìn)行了分離、鑒定，明確其種屬，為病害生態(tài)防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 帶病材料的采集 2019年5月12日，于荊門(mén)市屈家?guī)X管理區(qū)月寶山桃園基地的桃林中，摘取有腐爛現(xiàn)象，或者有疤痕的桃果實(shí)新鮮桃果實(shí)病樣，以及具有較多疤痕的病葉和病桃樹(shù)根病桃樹(shù)下土壤等放入采樣袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行致病菌分離。

1.2 致病菌的分離及純化 取具有明顯腐爛癥狀的桃果實(shí)，用自來(lái)水沖洗干凈表面的塵土，置于2%漂白粉溶液中消毒3min，用滅菌水沖洗3次后，放在滅菌后的濾紙上晾干。隨后用無(wú)菌的解剖刀切取患病和健康交界處組織，擺放于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，分別置于37℃和26℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況并記錄。同時(shí)，在無(wú)菌環(huán)境下將取回的土樣用無(wú)菌水進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)⑷?.0001及以后2個(gè)梯度用滅菌過(guò)的移液槍槍頭彎折后涂布在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，分別置于37℃和26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況并記錄，48h后觀察真菌生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)在病健交界處組織的PDA平板中未見(jiàn)明顯的真菌生長(zhǎng)情況，無(wú)法分離得到真菌。將分離得到的疑似致病菌分別用滅菌過(guò)的移液槍槍頭彎折后涂布轉(zhuǎn)代接種至牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行純化，待菌落生長(zhǎng)至直徑1～2cm，挑取細(xì)菌，轉(zhuǎn)接至錐形瓶，37℃搖瓶培養(yǎng)24h后，用無(wú)菌槍頭吸取適量菌液，進(jìn)行革蘭氏染色后，置于光學(xué)顯微鏡下用油鏡觀察細(xì)菌態(tài)并拍照記錄。

1.3 疑似病原菌的致病性測(cè)定 選取疑似病原菌的培養(yǎng)液進(jìn)行桃果實(shí)的離體接種試驗(yàn)，觀察并記錄接種后的發(fā)病癥狀，并從發(fā)病部再次分離純化病原菌，完成柯赫氏法則的驗(yàn)證。室內(nèi)離體接種：取新鮮健康的桃果實(shí)，洗凈后，用2%漂白粉溶液消毒3min，再用滅菌水沖洗2次，后置于鋪放了滅過(guò)菌的濾紙的燒杯內(nèi)，用無(wú)菌移液槍吸取50μL菌液打入桃果實(shí)內(nèi)，以等量的滅過(guò)菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為對(duì)照，每個(gè)疑似致病菌接種4個(gè)桃果實(shí)，2次重復(fù);置于恒溫培養(yǎng)箱中以37℃培養(yǎng)并觀察桃果實(shí)是否腐爛。

1.4 致病菌的DNA提取 用試劑盒法進(jìn)行致病菌DNA的提?。簩⒓兓蟮牟≡臃N至細(xì)菌培養(yǎng)通用培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，37℃搖瓶培養(yǎng)24h，待培養(yǎng)基明顯變渾濁時(shí)，取細(xì)菌培養(yǎng)液2mL于干凈的離心管中，10000r離心1min，吸凈上清液。向菌體沉淀中添加200μL緩沖液GA，振蕩至菌體全部懸浮。再向管中加入20μLProteinaseK溶液，混勻。用移液槍吸取240μL緩沖液GB加入管中，振蕩15s，70℃水浴加熱10min，待液體變澄清后，離心15s后向管中添加200μL無(wú)水乙醇，充分振蕩混勻15s等到出現(xiàn)沉淀后離心15s。將上步所得液體和沉淀都到入1個(gè)干凈的吸附柱CB3中，將吸附柱插入1個(gè)干凈的收集管中，12000r離心30s，棄去收集管中的廢液不要，再重新把吸附柱CB3插入收集管中。向CB3中加入適量的（600μL）緩沖液GD，12000r離心45s，倒掉收集管中的廢液不用，再重新將吸附柱CB3插入收集管中。向吸附柱CB3中加入適量（600μL）的漂洗液PW，12000r離心30s，倒掉收集管中的廢液，再將吸附柱CB3插入收集管中。再將上一步重新再做1遍后將吸附柱CB3重新插回收集管中，12000r離心2min，棄去收集管中的液體不要。再將吸附柱CB3放在一邊10min，讓吸附柱中殘留的漂洗液充分的揮發(fā)出去后再將吸附柱CB3插入全新的離心管中，用移液槍在吸附膜的正中間懸停加入200μL的洗脫液TE，再放在一邊5min后，12000r離心2min，將所有的液體集中到離心管中。再對(duì)所提DNA進(jìn)行純度測(cè)定，并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR擴(kuò)增、16rDNA序列測(cè)序和分析 利用細(xì)菌鑒定通用DNA引物27F/1492R，對(duì)分離鑒定提取得到的病原菌的DNA進(jìn)行擴(kuò)增（序列分別為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性97℃，20S;退火51℃，60S;延伸70℃，110S，循環(huán)35次;最后70℃，保溫15min。擴(kuò)增得到的DNA產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，利用EB進(jìn)行染色后利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察并拍照后選取擴(kuò)增條帶清晰，大小在1500bp左右的PCR產(chǎn)物（圖1），切下進(jìn)行膠回收后，送到武漢擎科生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病菌的形態(tài)學(xué) 調(diào)查中選取發(fā)生腐爛的桃果實(shí)，小心摘下，發(fā)現(xiàn)病桃果實(shí)與健康桃果實(shí)相比，病桃果實(shí)明顯多處出現(xiàn)褐色病斑，且有明顯的軟化流水現(xiàn)象（圖2）。選取具有代表性的病桃，病葉和樹(shù)下土壤，以及健康桃果實(shí)，將病桃，健康桃和病葉經(jīng)表面消毒擺放于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，樹(shù)下土壤經(jīng)震蕩搖勻梯度稀釋涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)12～24h后挑取分離較好的病原菌菌落轉(zhuǎn)到新的牛肉膏蛋白胨平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)，從上述培養(yǎng)基中都純化得到細(xì)菌分離物2個(gè)。根據(jù)病原菌菌落形態(tài)，可將2株疑似病原菌分為A、B2類(lèi)，A類(lèi)疑似病原菌1株，菌落呈圓形點(diǎn)狀，偏乳白色，表面濕潤(rùn)易挑取;B類(lèi)疑似病原菌1株，菌落橢圓形，偏黑色或褐色，顏色較A類(lèi)更深，表面濕潤(rùn)易挑?。▓D3）。

2.2 疑似致病菌的致病性 室內(nèi)致病性測(cè)定顯示，接種疑似致病菌B的桃果實(shí)未出現(xiàn)明顯發(fā)病癥狀，接種后5d，僅在接種點(diǎn)傷口周?chē)杂凶兩?，無(wú)明顯的褐化、流水、軟化現(xiàn)象，與無(wú)菌水和僅培養(yǎng)基處理的相同（圖4）;接種疑似致病菌A的桃果實(shí)出現(xiàn)了明顯的腐爛癥狀，病斑呈褐色，而且有明顯的流水現(xiàn)象（圖5）。依據(jù)室內(nèi)致病性測(cè)試結(jié)果可知，B類(lèi)疑似致病菌分離物不是造成桃果實(shí)腐爛病的致病菌，A類(lèi)致病菌分離物才是桃果實(shí)腐爛病病的致病菌。對(duì)A菌經(jīng)革蘭氏染色，并于油鏡下觀察得知該菌為革蘭氏陰性菌，菌體呈短桿狀（圖6）。

2.3 分離物16rDNA序列的測(cè)序結(jié)果 使用細(xì)菌16rDNA通用引物27F和1492R對(duì)分離得到的致病菌的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為1500bp左右的條帶，測(cè)序后上傳至NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，該細(xì)菌的16sDNA與成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）具有高度的同源性，相似性達(dá)99.4%。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察可以確定該菌為成團(tuán)泛菌。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)采集自果園的腐爛桃果實(shí)等樣品進(jìn)行病原物分離、純化和鑒定，利用16sDNA法結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，并通過(guò)室內(nèi)的致病性試驗(yàn)，確定引起屈家?guī)X管理區(qū)桃果實(shí)腐爛的病原物為成團(tuán)泛菌。由于該菌為革蘭氏陰性菌，故在日常防治中可以在發(fā)病初期采用對(duì)革蘭氏陰性菌殺滅效果較好的生物農(nóng)藥進(jìn)行防治。

（責(zé)編：張宏民）