柔嫩艾美耳球蟲2個抗藥株的抗藥性評估

謝雨翔，韓紅玉，趙其平，王自文，董 輝，徐帥兵，朱順海，崔曉霞，唐 敏,2，楊志遠(yuǎn),2，黃 兵,3

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2. 上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234；3. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

·研究論文·

柔嫩艾美耳球蟲2個抗藥株的抗藥性評估

謝雨翔1，韓紅玉1，趙其平1，王自文1，董 輝1，徐帥兵1，朱順海1，崔曉霞1，唐 敏1,2，楊志遠(yuǎn)1,2，黃 兵1,3

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2. 上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234；3. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

為檢測實(shí)驗(yàn)室長期保存的柔嫩艾美耳球蟲馬杜拉霉素抗藥株和地克珠利抗藥株的遺傳穩(wěn)定性，采用雞體試驗(yàn)法，以抗球蟲指數(shù)、最適抗球蟲活性百分率、病變記分減少率和相對卵囊產(chǎn)量4項(xiàng)指標(biāo)，評價2個抗藥株對地克珠利、癸氧喹酯、馬杜拉霉素等3種抗球蟲藥物的抗藥性，并以柔嫩艾美耳球蟲敏感株為對照。結(jié)果顯示，柔嫩艾美耳球蟲敏感株對3種抗球蟲藥物均無抗藥性，4項(xiàng)指標(biāo)全部陰性。柔嫩艾美耳球蟲馬杜拉霉素抗藥株對馬杜拉霉素為完全耐藥，4項(xiàng)指標(biāo)全部陽性；對地克珠利、癸氧喹酯則表現(xiàn)為無抗藥性，4項(xiàng)指標(biāo)全部陰性。柔嫩艾美耳球蟲地克珠利抗藥株對地克珠利表現(xiàn)為完全耐藥，4項(xiàng)指標(biāo)全部陽性；對馬杜拉霉素表現(xiàn)為中度耐藥，2項(xiàng)指標(biāo)陽性；對癸氧喹酯則表現(xiàn)為無抗藥性，4項(xiàng)指標(biāo)全部陰性。結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)室已繁殖保存10余年的柔嫩艾美耳球蟲2個抗藥蟲株對其誘導(dǎo)藥物具有明顯抗藥性，實(shí)驗(yàn)室保種繁殖方法可行，蟲株遺傳穩(wěn)定性良好，為利用該蟲株進(jìn)行球蟲抗藥性機(jī)制等相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

柔嫩艾美耳球蟲；地克珠利；馬杜拉霉素；耐藥性

雞球蟲病是由艾美耳屬（Eimeria）球蟲寄生引起的一種細(xì)胞內(nèi)寄生性原蟲病，嚴(yán)重危害雞的生長發(fā)育，其發(fā)病率為20%～30%，死亡率為50%～70%，嚴(yán)重時可高達(dá)80%。Bhogal等[1]報道，全世界每年因雞球蟲病造成的損失達(dá)20億美元。雖然球蟲疫苗在球蟲病防治中的使用量逐漸增加，但抗球蟲藥依然是球蟲病防治的主要手段，全世界抗球蟲藥的年消費(fèi)約3.2億美元。在抗球蟲藥中，醚類離子載體抗生素類抗球蟲藥和化學(xué)合成類抗球蟲藥物的使用依然處于優(yōu)勢地位[2]。藥物的長期使用，導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生似乎不可避免[3]。早在1954年，Waletzky等[4]就從野外分離出了幾株對包括磺胺類在內(nèi)的數(shù)種藥物有抗藥性的蟲株，之后人們陸續(xù)從野外分離獲得了許多對抗球蟲藥物具有抗藥性的蟲株[5-10]。

隨著球蟲抗藥性的廣泛產(chǎn)生，對球蟲病的防治難度逐漸加大。為了有效控制雞球蟲病，各國學(xué)者對抗球蟲藥物和球蟲抗藥性進(jìn)行了廣泛的研究[11]。2004年，本實(shí)驗(yàn)室韓紅玉等[12]成功誘導(dǎo)獲得了柔嫩艾美耳球蟲馬杜拉霉素抗藥株和地克珠利抗藥株。至今該抗藥蟲株已在實(shí)驗(yàn)室繁殖保存10余年，為確定該蟲株的遺傳穩(wěn)定性，本研究對實(shí)驗(yàn)室保存的2個抗藥株進(jìn)行了檢測。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 艾拔益加肉雞購自上海奉賢區(qū)某種雞場，出殼當(dāng)日運(yùn)回上海獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物房隔離飼養(yǎng)至11日齡。試驗(yàn)前進(jìn)行糞檢，確定無球蟲感染后，方進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 飼料 根據(jù)AA肉雞營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)自配，主要成份為玉米、小麥、豆粕等。

1.3 藥物 0.5%地克珠利為廣東容大生物工程有限公司生產(chǎn)，使用有效劑量：1 mg/kg，生產(chǎn)批號：201506001；6%癸氧喹酯預(yù)混劑為廣東科潤生物制藥有限公司生產(chǎn)，使用有效劑量：30 mg/kg，生產(chǎn)批號：201505002；1%馬杜拉霉素為廣東容大生物工程有限公司生產(chǎn)，使用有效劑量：5 mg/kg，生產(chǎn)批號：201503002。3種藥物均按其有效劑量分級拌入，飼料充分拌勻，備用。

1.4 球蟲來源 柔嫩艾美耳球蟲敏感株（資源編號：CAAS21111601）、柔嫩艾美耳球蟲馬杜拉霉素抗藥株（資源編號：CAAS21111608）、柔嫩艾美耳球蟲地克珠利抗藥株（資源編號：CAAS21111609），均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所原蟲病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)分離/誘導(dǎo)保存。

1.5 試驗(yàn)分組 試驗(yàn)設(shè)13個組，即柔嫩艾美耳球蟲敏感株、柔嫩艾美耳球蟲馬杜拉霉素抗藥株、柔嫩艾美耳球蟲地克珠利抗藥株分別飼喂3種藥物（地克珠利、癸氧喹酯、馬杜拉霉素）共9個組，3個蟲株的感染不用藥組和1個不感染不用藥組，每組16只雞，分為2籠，共計(jì)26籠208只雞。

1.6 試驗(yàn)步驟 在肉雞11日齡時進(jìn)行單只稱重，選體重相近的雞隨機(jī)分組，其體重范圍為150～210 g，平均體重為（180.81±20.45）g。分組后9個用藥組即開始飼喂拌藥飼料，至試驗(yàn)結(jié)束。13日齡，除不感染不用藥組外，其余12組：4組口服感染地克珠利耐藥株，4組口服感染馬杜拉霉素耐藥株，4組感染敏感株，每只雞感染孢子化卵囊量均為8.0×104個。感染后5～6 d，每天查血便并記錄各組雞的死亡情況。感染后6～7 d，每天稱糞重，采糞便，計(jì)每克糞便卵囊數(shù)（oocycsts of pergram，OPG）。感染后7 d，全部稱重剖殺，進(jìn)行腸道病變計(jì)分，結(jié)束試驗(yàn)。

1.7 抗藥性判定方法及標(biāo)準(zhǔn) 參照黃兵等[13]介紹的方法，以抗球蟲指數(shù)（anticoccidial index, ACI）、病變計(jì)分減少率（reduction of lesion scores, RLS）、相對卵囊產(chǎn)量（relative oocysts production, ROP）、最適抗球蟲活性百分率（percent of optimum anticoccidialactivity, POAA） 4項(xiàng)指標(biāo)綜合判定不同蟲株對藥物的抗藥程度，每項(xiàng)指標(biāo)用陰性（－）表示無抗藥性，用陽性（＋）表示有抗藥性。ACI ≥ 160為陰性，ACI＜160為陽性；RLS ≥ 50%為陰性，RLS＜50%為陽性；ROP ≥15%為陽性，ROP＜15%為陰性；POAA＞50 %為陰性，POAA ≤ 50 %為陽性。4項(xiàng)指標(biāo)中，全部為陰性判定為無抗藥性，1項(xiàng)為陽性判定為輕度抗藥，2項(xiàng)為陽性判定為中度抗藥，3～4項(xiàng)為陽性判定為完全抗藥。各項(xiàng)指標(biāo)計(jì)算公式如下：

ACI =（相對增重率＋存活率）－（病變值＋卵囊值）

RLS =（感染不用藥組平均病變計(jì)分－感染用藥組平均病變計(jì)分）／（感染不用藥組平均病變計(jì)分）×100%

ROP = 感染用藥組平均卵囊百萬數(shù) / 感染不用藥組平均卵囊百萬數(shù) × 100%

POAA =（感染用藥組GSR－感染不用藥組GSR）/（不感染不用藥組GSR－感染不用藥組GSR）×100 %，其中：GSR = 籠末重 / 籠初重。

2 結(jié)果

2.1 馬杜拉霉素抗藥株的測定結(jié)果 馬杜拉霉素抗藥株抗藥性測定結(jié)果見表1。綜合測定結(jié)果為該球蟲株對地克珠利和癸氧喹酯4項(xiàng)判定指標(biāo)均表現(xiàn)為陰性，即說明未產(chǎn)生抗藥性，而對馬杜拉霉素的指標(biāo)達(dá)到完全抗藥。

表1 馬杜拉霉素抗藥株抗藥性測定結(jié)果Table 1 Drug resistance test results of maduramicin resistant strain of E. tenella

2.2 地克珠利抗藥株的測定結(jié)果 地克珠利抗藥株抗藥性測定結(jié)果見表2。地克珠利4項(xiàng)指標(biāo)全部達(dá)到抗藥程度，表現(xiàn)為完全抗藥；癸氧喹酯的4項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到無抗藥性標(biāo)準(zhǔn)；馬杜拉霉素ROP和POAA兩項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到抗藥程度，表現(xiàn)為中度抗藥。

表2 地克珠利抗藥株抗藥性測定結(jié)果Table 2 Drug resistance test results of diclazuril resistant strain of E. tenella

2.3 敏感株球蟲的測定結(jié)果 敏感株的抗藥性測定結(jié)果見表3。地克珠利、癸氧喹酯、馬杜拉霉素3種藥物對該球蟲均完全有效，4項(xiàng)指標(biāo)均呈陰性，評定為無抗藥性。

3 討論

隨著抗球蟲藥的頻繁使用，導(dǎo)致球蟲抗藥性的問題日益嚴(yán)重，相關(guān)報道也屢見不鮮[7-10,14-16]。為在分子水平對球蟲抗藥性進(jìn)行更加深入的研究，本研究對實(shí)驗(yàn)室長期保存的2個球蟲抗藥蟲株進(jìn)行了檢測，以確定蟲株在保存繁殖過程中抗藥特性的遺傳穩(wěn)定性。

本研究選擇了目前使用較為普遍的3種藥物，即地克珠利、癸氧喹酯和馬杜拉霉素。其中地克珠利屬于三嗪類藥物，曾因高效低毒而被廣泛使用，然而由于藥物長期的使用導(dǎo)致了球蟲對其產(chǎn)生了廣泛的耐藥性[15,16]。癸氧喹酯屬于喹諾酮類藥物，在國內(nèi)應(yīng)用時間較地克珠利與馬杜拉霉素來說時間并不長，但球蟲對癸氧喹酯易產(chǎn)生耐藥性，其耐藥性問題在國外已有報道[17]，國內(nèi)也已誘導(dǎo)出對該藥的耐藥蟲株[18]，因此球蟲對癸氧喹酯耐藥性的問題也應(yīng)引起重視。馬杜拉霉素是一種聚醚類離子載體抗球蟲藥，在國內(nèi)外已經(jīng)使用超過20年，曾為雞球蟲病的防治發(fā)揮了非常重要的作用，但由于使用頻率高，使球蟲對其抗藥性日漸嚴(yán)重，這些年已陸續(xù)有對馬杜拉霉素產(chǎn)生耐藥性的相關(guān)報道[19-24]。

目前，對于球蟲抗藥性評定，仍然沒有一個統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，不同研究者采用的標(biāo)準(zhǔn)可能有所不同。McDougald等[5,6]利用Johnson等[25]所述方法進(jìn)行病變計(jì)分，以感染用藥組和感染不用藥組的病變計(jì)分來計(jì)算RLS，從而對球蟲的抗藥性進(jìn)行判定。Jeffers等[26]利用POAA判定了火雞和緩艾美耳球蟲（E. meleagrimitis）對莫能菌素具有抗藥性。在國內(nèi)，孔繁瑤等[7]利用POAA、RLS、ROP等3項(xiàng)參數(shù)指標(biāo)判定了15株柔嫩艾美耳球蟲對5種抗球蟲藥的抗藥性。黃兵等[13]則在POAA、RLS、ROP的基礎(chǔ)上，增加了ACI，用4項(xiàng)指標(biāo)對上海市9個區(qū)縣10個雞場的球蟲，進(jìn)行了6種常用抗球蟲藥物（地克珠利、氯苯胍、氯羥吡啶、氨丙啉、馬杜拉霉素、莫能霉素）的抗藥性檢測。陳兆國等[21]對該4項(xiàng)指標(biāo)判定球蟲抗藥性的準(zhǔn)確性進(jìn)行了評價，認(rèn)為用ACI、RLS、POAA、ROP等4項(xiàng)指標(biāo)來評定球蟲抗藥性是有效可靠的。隨后，國內(nèi)對球蟲抗藥性的檢測都主要以這4項(xiàng)指標(biāo)作為判定依據(jù)[28-32]。張香齋等[29]利用RLS、ROP、POAA、ACI判定了柔嫩艾美耳球蟲秦皇島分離株對克球粉、氨丙啉、馬杜霉素、磺胺氯吡嗪鈉、磺胺喹噁啉鈉、地克珠利和尼卡巴嗪7種抗球蟲藥的耐藥性。蔣祿峰等[33]利用RLS、ROP、POAA、ACI評定了河北省石家莊、滄州、保定、唐山等地的柔嫩艾美耳球蟲分離株對氯羥吡啶、莫能菌素、地克珠利、妥曲珠利、磺胺喹噁啉 5 種常用抗球蟲藥的抗藥性。本研究采用了RLS、POAA、ROP、ACI作為對3個蟲株進(jìn)行抗藥性的評價指標(biāo)。檢測結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)室繁殖保存了10余年的2個抗藥性蟲株，仍保持了良好的遺傳穩(wěn)定性，對其誘導(dǎo)藥物具有完成抗藥性，而敏感株對所測藥物完全敏感，為利用該蟲株進(jìn)行球蟲抗藥性機(jī)理等相關(guān)研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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RESISTANT ASSESSMENT OF MADURAMICIN RESISTANT STRAIN AND DICLAZURIL RESISTANT STRAIN OF EIMERIA TENELLA

XIE Yu-xiang1, HAN Hong-yu1, ZHAO Qi-ping1, WANG Zi-wen1, DONG Hui1, XU Shuai-bing1, ZHU Shun-hai1, CUI Xiao-xia1, TANG Min1,2, YANG Zhi-yuan1,2, HUANG Bing1,3

(1. Key Laboratory of Animal Parasitology of Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China; 3. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

In order to detect the drug resistance of Eimeria tenella (E. tenella) maduramicin resistant strain, diclazuril resistant strain and drug sensitive strain to three drugs which include diclazuril, decoquinate and maduramicin, the body-testing method was used for evaluating the effect, including anticoccidial index (ACI), reduction of lesion scores (RLS), relative oocyst production (ROP) and percent of optimum anticoccidial activity (POAA). The results revealed that drug sensitive strain was sensitive to the three drugs and all indicators was negative. Maduramicin resistant strain was serious resistance to maduramicin and all indicators was positive, but it was sensitive to diclazuril and decoquinate and all indicators was negative. Diclazuril resistant strain was serious resistance to diclazuril and all indicators was positive, it was also middle resistance to maduramicin and two indicators was positive, but it was sensitive to decoquinate and allindicators was negative. These results show that the two drug-resistant strains of E. tenella that be propagated and kept for more than 10 years in the laboratory have obvious resistance to maduramicin and diclazuril, respectively, which will indicate that the method that E. tenella propagated and saved in the lab is feasible and the drug-resistance of durg-induced strain can be inherited stably, and it will provide an experimental foundation for drug-resistant mechanism research．

Eimeria tenella；diclazuril；maduramicin；drug resistance

S852.723

A

1674-6422（2016）06-0050-06

2016-09-08

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2016JB10）

謝雨翔，女，碩士研究生，獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

黃兵，E-mail：hb@shvri.ac.cn