福建省龍巖市禽致病性大腸桿菌的血清型、毒力因子及耐藥研究

楊立軍，韓先干，尹會(huì)方，羅燕秋，左佳坤，徐 達(dá)，呂小龍，吳小卡，周 鍵，王少輝，李金貴，于圣青

（1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3.龍巖學(xué)院，龍巖 364012）

·研究論文·

福建省龍巖市禽致病性大腸桿菌的血清型、毒力因子及耐藥研究

楊立軍1,2，韓先干2，尹會(huì)方3，羅燕秋2，左佳坤2，徐 達(dá)2，呂小龍2，吳小卡2，周 鍵2，王少輝2，李金貴1，于圣青2

（1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3.龍巖學(xué)院，龍巖 364012）

本研究對(duì)2015年分離自福建省龍巖市的139株禽致病性大腸桿菌（Avian pathogenic Escherichia coli, APEC）的血清型、毒力因子分布及耐藥性等進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)血清型與耐藥性、毒力因子分布和耐藥性之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，以期為APEC的防控提供參考。對(duì)139株分離菌株的血清型檢測(cè)結(jié)果表明，O1血清型（11株）、O2血清型（14株）和O78血清型（14株）占全部菌株的28%；對(duì)分離菌株毒力基因檢測(cè)結(jié)果表明，4%和7.1%的菌株檢測(cè)到papC基因和vat基因，14.3%和19.3%的菌株檢測(cè)到aatA基因和cva/ cvi基因。而iucD（82%）、tsh（59%）、iss（55%）和irp2（44.6%）基因在分離菌株中具有較高的檢出率；藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分離株存在多重耐藥性，99 %以上分離菌株對(duì)紅霉素、克林霉素和利福平耐受，86%的分離菌株對(duì)10種以上抗生素耐受，57.3%的菌株對(duì)13種藥物都耐受；對(duì)血清型、耐藥性與致病性之間的分析結(jié)果表明，分離的O1、O2和O78血清型的菌株，其中50%的菌株是含有5種以上毒力基因的強(qiáng)毒株，且在分離的含有5種以上毒力基因的強(qiáng)毒株中，50%的菌株對(duì)13種抗生素耐受，90%的菌株對(duì)10種以上藥物耐受。

禽致病性大腸桿菌；毒力；耐藥性；血清型

禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌（Avian pathogenic Escherichia coli，APEC）感染所引起的禽類(lèi)不同類(lèi)型疾病的總稱(chēng)，可引起禽類(lèi)的敗血癥、氣囊炎、卵黃性腹膜炎等，是2～12 周齡的雞和火雞的一種常見(jiàn)傳染病[1]。近年來(lái)，隨著集約化養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，該病不但嚴(yán)重制約養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展，同時(shí)也對(duì)食品安全構(gòu)成威脅，因此開(kāi)展對(duì) APEC 的防控研究，具有重要的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)意義。

研究表明，APEC的血清型日益復(fù)雜，在種類(lèi)增加的基礎(chǔ)上，與地區(qū)、宿主等亦有很大相關(guān)性，我國(guó)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有50余種對(duì)禽致病的大腸桿菌血清型。研究表明，不同地區(qū)來(lái)源的分離菌株，其優(yōu)勢(shì)血清型亦有差異。例如，南通市分離株優(yōu)勢(shì)血清型為O78、O24、O11，鹽城市分離株為O78、O87，揚(yáng)州市分離株為O93、O24、O88，常州市分離株優(yōu)勢(shì)血清型為O78、O109，徐州市分離株為O78、O1、O86，泰州市分離株為O86、O9。國(guó)外研究表明，APEC的主要流行血清型是O1、O2和O78[12]。

細(xì)菌的毒力因子在致病菌的致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，APEC的主要毒力因子包括：粘附素（adhesins）、鐵螯合蛋白系統(tǒng)（aerobactin iron-sequestering system）、耶爾森桿菌素（yersiniabactin）、血清增強(qiáng)存活因子（increase serum survival）、外膜蛋白（outer membrane proteins）、大腸桿菌素（colicin production）、溫度敏感血凝素（t e m p e r a t u r e-s e n s i t i v e hemagglutinin）、溶血素（hemolysin E）、空泡自動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)毒素（vat）和志賀毒素（shigatoxin）等[2]。在APEC分離株中，其毒力因子的分布差異導(dǎo)致其對(duì)宿主的致病性存在差異。

2015年，本實(shí)驗(yàn)室在福建省龍巖市部分養(yǎng)殖場(chǎng)分離鑒定APEC 139株，并對(duì)分離菌株的血清型、毒力基因的組成和耐藥性等進(jìn)行了研究，為APEC致病機(jī)制的研究以及對(duì)該地區(qū)禽大腸桿菌病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和菌種 APEC菌株為本實(shí)驗(yàn)室在2015年在福建省龍巖市的家禽養(yǎng)殖企業(yè)分離獲得；DNA Marker、2×ES Taq Master Mix購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司；引物合成由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司完成；藥敏紙片購(gòu)自杭州天和公司；麥康凱培養(yǎng)基購(gòu)自青島高科園海博公司；大腸桿菌O1、O2和O78單因子血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 APEC的分離鑒定 將分離自病禽的菌株，接種于麥康凱鑒別培養(yǎng)基中，挑取疑似菌株，參照文獻(xiàn)[3]設(shè)計(jì)大腸桿菌鑒定引物（表1），對(duì)分離菌株進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系：PCR Master Mix 10 μL、上下游引物各1 μL、模板1μL、超純水7μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性4 min; 94℃變性40 s，52℃退火40 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min。

1.3 APEC的O血清型鑒定 參照文獻(xiàn)[3、12]中大腸桿菌血清型鑒定引物（表1），用PCR對(duì)分離菌株的O1、O2和O78血清型進(jìn)行初步鑒定。對(duì)PCR鑒定為陽(yáng)性結(jié)果的菌株，再進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)驗(yàn)證。將分離的菌株接種于LB固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜，用0.5%石炭酸生理鹽水洗下培養(yǎng)物，制成菌懸液，121℃高壓2 h，制備菌體抗原。分別取10 μL菌體抗原和大腸桿菌O抗原血清置于玻板上混勻。明顯凝集者為陽(yáng)性，同時(shí)以菌體抗原與0.5%石炭酸生理鹽水混合物作對(duì)照[4]。

1.4 APEC毒力相關(guān)基因的檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[3]，設(shè)計(jì)8種毒力基因的檢測(cè)引物（表1）。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同上。

表1 APEC的血清型以及毒力基因鑒定引物Table 1 Primers used for the identif cation of virulence-associated genes of Avian pathogenic Escherichia coli

1.5 APEC的藥物敏感性檢測(cè) 參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI）制定的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，選取14種抗菌藥，分別為克林霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、壯觀霉素、頭孢曲松、紅霉素、利福平、新霉素、阿奇霉素、復(fù)方新諾明、頭孢拉定、氯霉素、氨芐西林和頭孢噻吩進(jìn)行試驗(yàn)。新鮮的被檢細(xì)菌培養(yǎng)于LB瓊脂平板上，將藥敏紙片均勻貼于固體培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)過(guò)夜后，測(cè)量藥敏片的抑菌圈直徑。參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)，判定被檢細(xì)菌對(duì)每種藥物的敏感性，分別為敏感（susceptible，S）、中敏（intermediate，I）或耐藥（resistance，R）菌株[5]。

2 結(jié)果

2.1 APEC的分離、鑒定及血清型鑒定 根據(jù)臨床癥狀和病理變化，結(jié)合麥康凱培養(yǎng)基的培養(yǎng)和PCR鑒定結(jié)果（圖1），共分離禽大腸桿菌139株。

圖1 APEC及其血清型的PCR鑒定Fig. 1 Identif cation of APEC and serotypes using PCR amplif cation

參照文獻(xiàn)[3、12]的大腸桿菌血清型鑒定引物（表1），對(duì)分離菌株的O1、O2和O78血清型進(jìn)行PCR初步鑒定。對(duì)PCR鑒定陽(yáng)性結(jié)果的菌株，再分別用O1、O2和O78血清進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明（表2），139株APEC中共有O1血清型11株，O2血清型14株，O78血清型14株，占全部菌株的28%，其他血清型100株，占全部菌株的72%。

表2 139株禽致病性大腸桿菌的血清型分布Table 2 Serotype distributions of 139 strains of Avian pathogenic Escherichia coli

2.2 APEC毒力相關(guān)基因的檢測(cè) 在不同的分離菌株中，分別擴(kuò)增到了8種毒力基因（圖2），對(duì)不同菌株中8種毒力基因的檢測(cè)結(jié)果表明，iucD（14株，82%）、tsh（82株，58.6%）、iss（77株，55%）和irp2（62株，44.6%）有較高的分布率，其余毒力基因分布率均低于20%：cva/cvi（27株，19.3%）、aatA（20株，14.3%）、papc（6株，4.3%）和vat（6.7%）（圖3）。iucD、tsh、iss和 irp2檢出率大于50%，為重要的APEC毒力基因。對(duì)各菌株毒力基因分布統(tǒng)計(jì)顯示，含有4個(gè)以上毒力基因的菌株有45株（32.4%），含有5個(gè)以上毒力基因的強(qiáng)毒菌株共有20株（14.4%），其中iss、iucD和tsh這3個(gè)毒力基因幾乎在每個(gè)強(qiáng)毒菌株中都可以檢測(cè)到，而irp2在強(qiáng)毒菌株的檢出率高達(dá)95%。表明這4個(gè)基因是APEC的保守毒力基因，可能在APEC對(duì)宿主的致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用（表3）。

2.4 APEC耐藥性檢測(cè) 分離菌株的耐藥性檢測(cè)結(jié)果表明，對(duì)紅霉素、克林霉素耐受的有138株（99.3%），耐10種以上藥物的菌株有125株（90.6%），其中對(duì)13種藥物都耐受的菌株有65株（47.1%），表明分離菌株存在多重耐藥性（表4）。分離菌株僅有37株對(duì)壯觀霉素和頭孢曲松敏感，對(duì)其他抗生素的耐藥性都在90%以上。

圖2 8種毒力基因的PCR鑒定結(jié)果Fig. 2 PCR amplif cation of 8 virulence genes

圖3 8種毒力相關(guān)基因在139株禽致病性大腸桿菌的分布Fig. 3 Distribution of 8 virulence-associated genes in 139 strains of Avian pathogenic Escherichia coli

表3 8種毒力基因在強(qiáng)毒菌株（含5個(gè)以上毒力基因）中的分布Table 3 Distribution of 8 virulence-associated genes in virulent isolates

表4 139株禽致病性大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)Table 4 Drug sensitivity assay for 139 strains of Avian pathogenic Escherichia coli

2.5 APEC血清型、毒力和耐藥性之間的關(guān)系 在20株含有5種以上毒力基因的強(qiáng)毒菌株中，有5株O1、3株O2和2株O78菌株，合計(jì)占強(qiáng)毒菌株的50%。在20株含有5種以上毒力基因的強(qiáng)毒菌株中，對(duì)13種藥物都耐受的有10株（50%），耐10種以上藥物的有19株（90%），表明強(qiáng)毒株存在廣泛的耐藥性。

3 討論

本研究對(duì)福建省龍巖市分離大腸桿菌的血清型鑒定結(jié)果顯示，O1、O2和O78只占分離菌株的28%，不是當(dāng)?shù)亓餍械膬?yōu)勢(shì)血清型。本實(shí)驗(yàn)室在上海市、江蘇省等地分離的大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型則為O1、O2和O78，表明APEC的血清型分布具有地域差異[6,7]。但本次分離到的O1、O2和O78菌株中50%為強(qiáng)毒株，表明可能在O1、O2和O78血清型中，強(qiáng)毒株分布比例高。

對(duì)分離菌株的毒力基因檢測(cè)結(jié)果表明：iucD（14株，82%）、tsh（82株，59%）、iss（77株，55.4%）和irp2（62株，44.6%）在分離菌株中具有較高的檢出率，與本實(shí)驗(yàn)室在江蘇省、安徽省等地分離的菌株的毒力基因檢測(cè)結(jié)果相符[8]。

分離菌株耐藥性檢測(cè)結(jié)果表明，臨床分離的APEC中57.3%的菌株能耐受13種抗生素，90.6%的菌株耐受10種以上抗生素。其中對(duì)利福平、紅霉素、克林霉素、新霉素、頭孢噻吩、四環(huán)素、頭孢拉定、阿奇霉素、氯霉素的均耐藥菌株占95%以上，表明目前APEC多重耐藥性仍很?chē)?yán)重，這與抗菌藥的不合理使用以及大腸桿菌的血清型眾多有關(guān)[9]。造成APEC存在廣泛耐藥性的原因可能是在外界高濃度的抗生素選擇壓力下，一些具有耐藥特性的菌株或一些耐藥能力更強(qiáng)的菌株能夠生存下來(lái)，而這種耐藥性可以在細(xì)菌間傳播，因而導(dǎo)致細(xì)菌耐藥及多重耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)，從而導(dǎo)致以抗生素預(yù)防及治療當(dāng)?shù)仉u場(chǎng)的大腸桿菌病效果不佳。

對(duì)血清型、耐藥性與致病性之間的分析結(jié)果表明，強(qiáng)毒株存在多重耐藥性，APEC的毒力與耐藥性之間具有一定的相關(guān)性。對(duì)優(yōu)勢(shì)血清型菌株耐藥情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，血清型與耐藥性之間沒(méi)有明顯相關(guān)性，相同耐藥性可出現(xiàn)于不同血清型的菌株中，同一血清型的菌株也會(huì)表現(xiàn)出不同的耐藥性[10]。本研究通過(guò)對(duì)分離的APEC菌株的血清型、耐藥性及毒力基因的研究，為針對(duì)分離地區(qū)APEC的流行態(tài)勢(shì)，探究APEC可能的致病機(jī)理及防控工作提供參考。

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SEROTYPES, PATHOGENICITY AND ANTIBIOTIC RESISTANCE OF AVIAN PATHOGENIC ESCHERICHIA COLI STRAINS FROM LONGYAN CITY, FUJIAN PROVINCE

YANG Li-jun1, HAN Xian-gan2, YIN Hui-fan3, LUO Yan-qiu2, ZUO Jia-kun2, XU Da2, LV Xiao-long2, WU Xiao-ka2, ZHOU Jian2, WANG Shao-hui2, LI Jin-gui1, YU Sheng-qing2

(1. College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 2. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 3. College of Life Science, Longyan University, Longyan 364012, China)

The aim of the study was to investigate the serotypes, virulence factors and drug resistance of avian pathogenic Escherichia coli (APEC) strains isolated from Longyan city, Fujian province. The serotypes of the APEC isolates were identif ed by agglutination withspecif c antisera. Virulence-associated genes were investigated by PCR amplif cation. Drug susceptibility was tested according to National Committee for Clinical Laboratory Stands (NCCLS). Agglutination with specif c antisera showed that serotypes O1, O2 and O78 were dominant, which accounted for 28% of these isolates. PCR amplif cation of the virulence-associated genes showed that iucD, tsh, iss and irp2 were amplif ed from more than 50% of these strains. Drug susceptibility test showed that 86% of the strains were resistant to more than 10 antibiotics. A half of the isolates containing f ve or more virulent genes belonged to O1, O2 and O78 serotypes. There was a good correlation between APEC virulence and drug resistance but no signif cant correlation between serotypes and drug resistance.

Avian pathogenic Escherichia coli; virulence; drug resistance; serotype

S852.612

A

1674-6422（2016）06-0024-06

2016-02-19

上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目[滬農(nóng)科攻字(2015)第1-9號(hào)]；國(guó)家自然科學(xué)基金（31370045、31372402、31572523）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（201303044）

楊立軍，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)

于圣青，E-mail：yus@shvri.ac.cn；李金貴，E-mail：jgli@yzu.edu.cn