高效液相色譜法同時測定趕黃草中槲皮素和山柰酚含量

羅興平　楊玲霞

摘要：目的 建立高效液相色譜法同時測定趕黃草中槲皮素和山柰酚含量的方法。方法 采用高效液相色譜法，色譜柱為Kromasil C18柱（4.0 mm×250 mm，5.0 ?m），流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液（50∶50），流速1.0 mL/min，檢測波長360 nm，檢測溫度為室溫。結果 槲皮素、山柰酚分別在0.105 6～2.112 0 μg和0.023 6～0.472 μg范圍內具有良好線性關系，平均回收率分別為98.46%（RSD=2.29%）和98.17%（RSD=1.99%）。結論 該法準確、靈敏，可用于趕黃草中槲皮素和山柰酚的含量測定。

關鍵詞：趕黃草；槲皮素；山柰酚；高效液相色譜法；含量測定

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.021

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）03-0077-03

Abstract： Objective To establish an HPLC method for the simultaneous content determination of quercetin and kaempferol in Penthorum Chinense Pursh. Methods The HPLC analysis was carried out on Kromasil C18 （250 mm× 4.0 mm， 5.0 μm） with a mixture of methanol-0.1% phosphate （50：50） as the mobile phase. The determination wavelength was set at 360 nm with the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was set at room temperature. Results The quercetin and kaempferol showed good linearity in the range of 0.105 6–2.112 0 μg and 0.023 6–0.472 μg respectively. The average recovery rates of quercetin and kaempferol were 98.46% （RSD=2.29%） and 98.17% （RSD=1.99%） respectively. Conclusion The method is accurate and sensitive， which can be used for the content determination of quercetin and kaempferol in Penthorum Chinense Pursh.

Key words： Penthorum Chinense Pursh； quercetin； kaempferol； HPLC； content determination

趕黃草為虎耳草科Saxifragaceae扯根菜屬Penthorum植物扯根菜Penthorum chinense Pursh.的干燥地上部分，始載于明代《救荒本草》，苗族民間歷來作為藥食兩用植物，被譽為“神仙草”。其性溫、味甘、無毒，具有清熱解毒、活血散瘀、利水消腫、退黃、平肝的功效，主要分布于華北、華東、中南及陜西、甘肅、四川和貴州等地[1-2]，近年來逐漸馴化為家種，于四川省瀘州市古藺縣境內大量種植。

目前關于趕黃草的化學、藥理、臨床研究已取得一定進展[3-9]，以其為原料開發(fā)的肝蘇片、肝蘇顆粒、肝蘇膠囊已在臨床得到廣泛應用[10-11]，有關趕黃草及其制劑的質量標準評價多為單一的槲皮素、沒食子酸或總黃酮測定[12-15]。本研究采用高效液相色譜法

（HPLC）同時測定趕黃草中槲皮素和山柰酚的含量，為有效控制趕黃草及其制劑的質量，促進其進一步開發(fā)應用提供技術支持。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；梅特勒XS205DU電子天平，瑞士Mettler toledo公司；B3200S-T型超聲波清洗器，上海必能信超聲有限公司；MILLI Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司。

槲皮素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號100081-200406）；山柰酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110861-2004050）。趕黃草分別采自四川省古藺縣、四川省成都市新都區(qū)、甘肅省康縣、甘肅省天水市，由甘肅省食品藥品檢驗所楊玲霞副主任藥師鑒定為虎耳草科扯根菜屬植物扯根菜Penthorum chinense Pursh.的干燥全草。甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取槲皮素10.56 mg、山柰酚2.36 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得對照品儲備溶液（槲皮素濃度為211.2 μg/mL，山柰酚濃度為47.2 μg/mL）。精密吸取對照品儲備溶液5 mL，加甲醇定容至10 mL，即得對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取趕黃草細粉約0.25 g，精密稱定，精密加入甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1）25 mL，稱定質量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質量，用甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1）補足減失的質量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，用0.46 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱為Kromasil C18柱（4.0 mm×250 mm，5.0 ?m），流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液（50∶50），檢測波長為360 nm，流速1.0 mL/min，溫度為室溫，進樣量10 μL。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗

分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，按“2.3”項下色譜條件進樣測定，色譜圖見圖1。結果表明，在此色譜條件下，槲皮素和山柰酚均與樣品中其他組分色譜峰基線分離，理論塔板數按槲皮素峰計算為8491，按山柰酚峰計算為5862。

2.5 線性關系考察

精密量取對照品貯備液0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，用0.46 μm微孔濾膜過濾，依次進樣10 μL。以槲皮素、山柰酚峰面積為縱坐標，進樣量為橫坐標，進行回歸計算，得回歸方程。槲皮素：A=4 200 023C+34 097，r=1.000 0，槲皮素線性范圍為0.105 6～2.112 0 μg；山柰酚：A=4 044 914C+113 159，r=0.999 9，山柰酚的線性范圍為0.023 6～0.472 μg。結果表明，在給定的范圍內槲皮素和山柰酚線性關系良好。

2.6 精密度試驗

精密吸取對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件重復進樣5次，每次10 ?L，分別計算得槲皮素峰面積RSD=1.02%，山柰酚峰面積RSD=1.43%，表明精密度良好。

2.7 重復性試驗

精密稱取同一批趕黃草藥材（四川省古藺縣1號）5份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件依次進樣測定，結果槲皮素平均含量RSD=1.82%，山柰酚平均含量RSD=2.31%，表明本法重復性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液（四川省古藺縣1號），分別在0、2、4、8、12、16、24 h進樣10 ?L，測定槲皮素和山柰酚的峰面積，結果槲皮素峰面積的RSD=2.12%，山柰酚峰面積的RSD=1.69%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量的趕黃草樣品（四川省古藺縣1號，槲皮素和山柰酚含量分別為5.14、0.92 mg/g）6份，精密稱定，分別精密加入對照品溶液適量，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.3”項下色譜條件測定，計算回收率，結果表明，槲皮素和山柰酚的平均回收率分別為98.46%（RSD=2.29%）和98.17%（RSD=1.99%），見表1、表2。本方法具有良好的準確性。

2.10 樣品測定結果

采用本試驗所建立的方法對5批趕黃草樣品中槲皮素和山柰酚含量進行測定，計算含量，結果見表3。

3 討論

趕黃草作為藥食兩用的藥材資源，自明代《救荒本草》至《全國中草藥匯編》均有收載，以其為原料研究開發(fā)的保健食品也因其解酒醒酒、保肝護肝作用日益受到重視。趕黃草野生資源遍及全國24個省市，但目前僅有四川省瀘州市古藺縣境內有大量種植，這一寶貴的自然資源尚未被《中華人民共和國藥典》收載。因此，應用現代科技手段，進一步闡明趕黃草的藥效物質基礎，提高趕黃草的質量標準，促進該藥材的進一步推廣應用具有重要的意義。

趕黃草主要含有槲皮素、山柰酚及其苷等黃酮類化合物。本試驗中曾以甲醇超聲提取后直接進樣測定，結果槲皮素及山柰酚含量低，雜質峰多，分離度差。采用本文方法，以甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1）為溶劑加熱回流水解提取，槲皮素和山柰酚含量明顯提高，雜質峰顯著減少，各成分分離度良好。

水解條件的選擇系參考2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）垂盆草項下的含量測定方法，以甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1）為溶劑加熱回流水解1 h。曾對提取時間進行考察，采用四川省古藺縣1號樣品分別水解提取30、60、90、120 min，測定槲皮素含量分別為5.09、5.14、5.13、5.15 mg/g，山柰酚含量分別為0.87、0.92、0.93、0.90 mg/g，結果表明水解提取1 h即可提取完全。

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（收稿日期：2015-04-09）

（修回日期：2015-05-06；編輯：陳靜）