肥大細胞及IL-33/ST2在復發(fā)性自然流產(chǎn)小鼠模型中的作用初探

羅金，劉雪麗，王雅琴，楊菁，徐望明

(武漢大學人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，武漢　430060)

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肥大細胞及IL-33/ST2在復發(fā)性自然流產(chǎn)小鼠模型中的作用初探

羅金，劉雪麗，王雅琴，楊菁*，徐望明

(武漢大學人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，武漢430060)

【摘要】目的探討復發(fā)性流產(chǎn)小鼠子宮和胎盤組織中肥大細胞的數(shù)量及白細胞介素-33(IL-33)/ST2的表達變化。方法20只雌性CBA/J小鼠隨機分為兩組，每組10只，分別與雄性DBA/2和Balb/c小鼠按雌雄比例2：1合籠交配，建立正常妊娠組(CBA/J♀×Balb/c/2♂)和自然流產(chǎn)組(CBA/J♀×DBA/2♂)模型。妊娠第13.5天處死各組雌性小鼠，計數(shù)存活胚胎數(shù)和丟失胚胎數(shù)，計算胚胎丟失率。甲苯胺藍染色法檢測小鼠子宮組織中肥大細胞的數(shù)量。ELISA檢測血清中干擾素-γ(IFN-γ)、IL-4的濃度，qRT-PCR和Western-blotting分別檢測胎盤組織中IL-4、IFN-γ、IL-33、ST2的mRNA和蛋白表達水平。結果成功構建了復發(fā)性自然流產(chǎn)(RSA)的小鼠模型，RSA模型組胚胎丟失率顯著高于正常妊娠組(16.2% vs. 4.92%，P<0.05)；RSA組子宮組織中肥大細胞數(shù)顯著低于正常妊娠組[(1.50±0.83)vs.(3.35±1.63)個](P<0.05)；ELISA結果顯示，與正常妊娠組相比，RSA組小鼠血清中IFN-γ水平顯著升高[(346.79±4.34)vs.(168.84±2.35)ng/L]，IL-4水平顯著降低[(98.46±5.81)vs.(157.56±9.35)ng/L](P均<0.05)；qRT-PCR和Western-blotting結果顯示RSA組小鼠胎盤組織中IFN-γ表達水平顯著升高，IL-4、IL-33、ST2表達水平顯著降低(P<0.05)。結論肥大細胞和IL-33/ST2可能參與了RSA小鼠體內(nèi)Th1/Th2的調(diào)節(jié)，有助于妊娠的維持。

【關鍵詞】肥大細胞；IL-33；ST2；復發(fā)性自然流產(chǎn)；Th1/Th2

(JReprodMed2016，25(2)：154-159)

復發(fā)性自然流產(chǎn)(RSA)是指連續(xù)發(fā)生2次或者2次以上由自然因素導致的妊娠不足20周、胎兒體重不足400 g而終止妊娠者[1]。正常婦女RSA的發(fā)生率大約為1%～3%[2]。RSA病因復雜，包括解剖異常、夫妻或胚胎染色體異常、內(nèi)分泌異常、感染和免疫等，但具體的發(fā)病機制尚不明確。多項研究證實，Th1/Th2型細胞因子的平衡對正常妊娠的維持有著非常重要的作用[3-7]，近年來有研究顯示白細胞介素-33(IL-33)/ST2信號通路在炎癥與自身免疫性疾病尤其是Th1/Th2失調(diào)免疫性疾病過程中起著關鍵性的作用[8-10]。另有研究表明肥大細胞(MCs)與子宮局部的免疫功能調(diào)節(jié)有關，并參與胎盤的發(fā)育和妊娠分娩等過程[11-12]，且在小鼠妊娠中晚期，MCs是胎鼠血液中唯一高表達T1/ST2受體的細胞系[13]。提示MCs和IL-33/ST2可能在妊娠過程中起著重要作用。本研究采用小鼠RSA模型，觀察MCs數(shù)量和IL-33/ST2表達在自然流產(chǎn)小鼠子宮和胎盤組織中的變化，探討其在RSA發(fā)生過程中的作用及其對妊娠結局的影響。

材料和方法

一、材料

1. 實驗動物：健康雌性CBA/J小鼠(20只)、雄性DBA/2小鼠(5只)購自北京華阜康生物科技股份有限公司，雄性Balb/c小鼠(5只)購自湖北省疾病預防控制中心。所有動物均是SPF級，8周齡，雌性小鼠體重18～21 g，雄性小鼠體重19～23 g。

2. 主要試劑：甲苯胺藍MCs染色試劑盒購自南京建成生物工程研究所，ELISA試劑盒購自美國R&D公司，實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒購自日本TaKaRa公司，多克隆IFN-γ、IL-4、IL-33和ST2抗體購自美國Santa Cruz公司。

二、研究方法

1. 自然流產(chǎn)動物模型的建立[14]：將雌性CBA/J小鼠隨機分為兩組，每組10只，分別與雄性Balb/c和DBA/2小鼠按雌雄比例2：1合籠交配，建立正常妊娠組(CBA/J♀×Balb/c♂)和自然流產(chǎn)模型組(CBA/J♀×DBA/2♂)。合籠后第2天早上8∶00檢測雌鼠陰栓，檢出陰栓者計為妊娠第0.5天，其中檢出陰栓雌鼠數(shù)正常組為9只，模型組為10只。

2. 標本的收集：于妊娠第13.5天進行小鼠眼眶取血，室溫靜置2 h后，3 000 r/min離心30 min，取上清，0.2 ml EP管分裝后-70℃凍存。眼眶取血后，頸椎脫臼法處死各組雌性小鼠，計數(shù)存活胚胎數(shù)和丟失胚胎數(shù)，并計算胚胎丟失率(R)。胚胎丟失的判斷：丟失胚胎的體積明顯縮小，胎兒-胎盤單位有明顯的出血或壞死，胚胎組織變性或壞死。將單個胎鼠-胎盤單位連同蛻膜組織用生理鹽水漂洗去掉血液后，分成兩部分：一部分迅速放入液氮中，約0.5 h后轉移至超低溫冰箱-70℃保存；另一部分置于4%多聚甲醛中固定24 h后行MCs染色。

3. MCs計數(shù)：采用甲苯胺藍染色法對組織進行染色，操作步驟按試劑盒說明書進行。在高倍顯微鏡下每張標本隨機選取5個視野進行MCs計數(shù)。MCs特點：細胞體積較大，呈圓形或橢圓形，胞核較小、圓形，胞質(zhì)內(nèi)有粗大異染性顆粒。

4. ELISA檢測：按照ELISA說明書操作步驟檢測小鼠血清中IFN-γ、IL-4的濃度。每孔加入100 μl樣本或標準液，以只加入稀釋緩沖液的作為空白對照。

5. qRT-PCR檢測胎盤組織IFN-γ、IL-4、IL-33、ST2 mRNA的表達：提取胎盤組織總RNA，逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板，擴增IFN-γ、IL-4、IL-33及ST2序列。引物序列見表1。PCR反應體系總體積20 μl，其中2×SYBR Premix Ex TapTM 10 μl，2.5 μmol/L引物2 μl(上下游各1 μl)，50×ROX Reference DyeⅡ 0.4 μl，cDNA temples 1 μl，dH2O 6.6 μl。設置反應條件為：95℃ 30 s預變性，95℃ 5 s，60℃ 34 s，60℃ 60 s，共40個循環(huán)；60℃ 34 s收集熒光信號?；虮磉_的相對變化采用2-△△Ct法處理。

表1　qRT-PCR引物序列

6. Western-blotting檢測胎盤組織中IFN-γ、IL-4、IL-33、ST2蛋白的表達：將胎盤組織用適量RIPA裂解液裂解后，測蛋白濃度，各樣品取50 μg總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，室溫下60V恒壓電泳至溴酚藍跑出濃縮膠時，將電壓提高至110V后恒壓電泳至溴酚藍剛好跑出分離膠底部。電泳結束后，將凝膠上的蛋白轉到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶的TBST液37℃封閉2 h，加入封閉液稀釋的一抗(稀釋倍數(shù)分別為：IFN-γ 1∶500，IL-4 1∶400，IL-33 1∶200，ST2 1∶200，GAPDH 1∶800)，4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次10 min，再加人HRP標記的相應二抗室溫反應1 h，TBST洗膜3次，化學發(fā)光(ECL)試劑盒常規(guī)發(fā)光顯影洗片。采用BandScan軟件分析膠片條帶灰度值。

三、統(tǒng)計學方法

結果

一、兩組胚胎丟失情況比較

RSA模型組和正常妊娠組孕鼠胚胎丟失情況見表2，模型組胚胎丟失率顯著高于正常組(P<0.05)，說明RSA模型構建成功。

表2　兩組孕鼠胚胎丟失情況比較 (n，%)

注：與正常組比較，*P<0.05

二、兩組MCs計數(shù)情況比較

孕鼠子宮中的MCs主要分布在肌層，RSA模型組MCs數(shù)量較正常妊娠組顯著減少(P<0.05)(表3)，且RSA模型組MCs脫顆粒現(xiàn)象較嚴重，體積變小，部分MCs中央呈空泡狀(圖1)。

表3　兩組孕鼠子宮中MCs計數(shù)情況 (x-±s)

注：與正常組比較，*P<0.05

A：正常妊娠組　B：RSA模型組。箭頭所指為肥大細胞圖1　孕鼠子宮中MCs分布 HE染色，×400

三、兩組小鼠血清中IFN-γ、IL-4水平比較

ELISA法檢測各組小鼠血清中IFN-γ、IL-4水平，結果顯示，與正常組相比，RSA模型組IL-4水平顯著下降(P<0.01)，IFN-γ水平和IFN-γ/IL-4比值顯著上升(P<0.01)(表4)。

表4　兩組小鼠血清IFN-γ、IL-4水平及IFN-γ/IL-4比較 (x-±s)

注：與正常組比較，*P<0.05

四、兩組小鼠胎盤組織中IFN-γ、IL-4、IL-33、ST2的mRNA及蛋白表達水平

qRT-PCR法檢測胎盤組織中IFN-γ、IL-4、IL-33和ST2的 mRNA表達，結果顯示，與正常組相比，經(jīng)β-actin內(nèi)參校正后，RSA模型組IFN-γ mRNA水平顯著增高(P<0.01)，而IL-4、IL-33和ST2 mRNA水平顯著降低(P<0.01)(圖2)。Western-blotting法檢測胎盤組織中IFN-γ、IL-4、IL-33和ST2蛋白表達水平，其結果與mRNA表達變化一致，經(jīng)GAPDH內(nèi)參校正后，與正常組相比，RSA模型組IFN-γ蛋白表達顯著增高(P<0.01)，而IL-4和IL-33、ST2蛋白表達顯著降低(P<0.01)(圖3A、B)。

注：與正常組比較，#P<0.01圖2　兩組小鼠胎盤組織中IFN-γ、IL-4、IL-33和ST2 mRNA的相對表達情況

A：Western-blotting圖　　　　　　　　　　　　　　B：條帶灰度值分析結果　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　注：與正常組比較，#P<0.01圖3　兩組小鼠胎盤組織中IFN-γ、IL-4、IL33和ST2蛋白表達情況

討論

MCs是機體內(nèi)重要的免疫細胞，來源于骨髓CD34+造血干細胞，能通過血液運輸?shù)竭_機體的各個部位并分化成熟。它與子宮局部的免疫功能調(diào)節(jié)有關，研究顯示MCs及其產(chǎn)物可通過調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細胞的入侵和生長，參與胎盤的發(fā)育[11]，它還可釋放組織胺、HT、5-HT、PGF-2α等介質(zhì)，通過直接或間接的作用引發(fā)子宮收縮，參與分娩過程[12]。IL-33是IL-1家族成員之一，ST2為其特異性受體。體外實驗發(fā)現(xiàn)，IL-33與MCs表面受體結合后可促進人CD34+MCs前體的成熟，誘導小鼠骨髓衍生肥大細胞(BMCMC)以不依賴IgE的方式釋放IL-13、IL-16，在沒有IgE存在時，高濃度的IL-33能延長BMCMC的存活時間[13]。此外，Moritz等[15]對小鼠的研究表明，MCs是妊娠中晚期胎鼠血液中唯一高表達T1/ST2受體的細胞系，提示IL-33在MCs的發(fā)育過程中起著重要作用。IL-33與ST2結合后，可以通過下游信號分子髓樣分化因子88(MYD88)、IL-1相關蛋白激酶(IRAK)和腫瘤壞死因子受體相關因子6(TRAF6)，使NF-kB和MAPK激活，其中包括位點特異的NF-kB抑制蛋白a(IkBa)、細胞外信號調(diào)節(jié)的蛋白激酶1/2(Erk1/2)、c-Jun N端激酶(JNK)、p38 MAPK等激酶的磷酸化，從而調(diào)節(jié)基因的轉錄，誘導Th2型細胞因子和趨化因子的分泌，增強Th2型炎癥細胞的募集[16]。由于妊娠是以Th2型細胞因子為主的免疫應答，而RSA表現(xiàn)為以Th1型細胞因子為主的Th1/Th2失衡[3-7，17]，因此，我們推測子宮環(huán)境中的IL-33和MCs T1/ST2在妊娠相關性疾病尤其是RSA的發(fā)病過程中起著非常重要的作用。

本研究中，我們首先采用雌性CBA/J小鼠×雄性DBA/2小鼠建立RSA模型。該模型與人類RSA具有很多的共同點，是用于研究RSA的理想模型之一[14]。研究結果顯示RSA模型組雌性孕鼠的胚胎丟失率(16.20%)顯著高于正常妊娠組(4.94%)，且與正常妊娠組相比，RSA模型組Th1型細胞因子IFN-γ水平顯著增高，Th2型細胞因子IL-4顯著降低，說明本研究中RSA小鼠模型構建成功，進一步證實了CBA/J×DBA/2小鼠模型胚胎的丟失可能與Th1、Th2細胞因子水平失衡有關。本研究發(fā)現(xiàn)RSA組小鼠子宮中MCs數(shù)量顯著低于正常妊娠組，提示妊娠期子宮組織中的MCs有利于妊娠的維持。有研究顯示MCs能合成并分泌一氧化氮(NO)，而NO能抑制妊娠子宮平滑肌的收縮，從而使胎兒獲得一個安全的生存發(fā)育環(huán)境[18]。還有研究發(fā)現(xiàn)MCs產(chǎn)生的組織胺可增強滋養(yǎng)層細胞整合素αvβ3的表達[19]，與H1受體結合后抑制滋養(yǎng)細胞的凋亡[20]，并誘導Th2細胞因子的釋放[21]。然而楊林松等[22]對不同時期自然流產(chǎn)(孕7、8、16、17 d)小鼠子宮中MCs數(shù)量進行研究發(fā)現(xiàn)，不同孕期自然流產(chǎn)小鼠子宮中MCs數(shù)量無顯著差異，但是自然流產(chǎn)組MCs數(shù)量明顯多于同期正常妊娠小鼠子宮中的MCs數(shù)量。張文學等[23]研究發(fā)現(xiàn)整個妊娠期間小鼠子宮中MCs數(shù)量呈現(xiàn)由多到少再由少到多的動態(tài)變化，子宮中MCs在胚泡植入時(孕5 d左右)數(shù)量最少。出現(xiàn)這種結果不一致的原因可能與染色方法和采用的自然流產(chǎn)動物模型不同有關。MCs在人類自然流產(chǎn)過程中的表達變化及其作用機制還需要進一步的研究。此外，本研究結果發(fā)現(xiàn)，IL-33/ST2表達水平與MCs數(shù)量變化一致，進一步說明了IL-33可能在MCs的發(fā)育成熟過程中起著重要作用。RSA模型組小鼠胎盤組織中IL-33/ST2表達水平也均低于正常妊娠組，提示RSA中Th1/Th2的失衡可能與MCs和IL-33/ST2的調(diào)節(jié)有關。

本研究初步探討了RSA模型小鼠子宮和胎盤組織中MCs數(shù)量和IL33/ST2表達的變化，研究結果提示MCs和IL33/ST2可能參與RSA中Th1/Th2的調(diào)節(jié)，有助于妊娠的維持，但是其具體的作用機制及影響的信號通路還有待進一步研究。

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[編輯：辛玲]

本刊對于一稿兩投等問題處理的聲明

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本刊編輯部

Preliminary study on role of mast cells and IL-33/ST2 in mouse with recurrent spontaneous abortion

LUOJin，LIUXue-li，WANGYa-qin，YANGJing*，XUWang-ming

ReproductiveMedicalCenter，RenminHospitalofWuhanUniversity，WuHan430060

【Abstract】

Objective： To investigate amount of mast cells and expressions of IL-33 & ST2 in uterine and placental tissue of mice with recurrent spontaneous abortion (RSA).

Methods： Twenty female CBA/J mice were randomly divided into 2 groups，10 for each group. Then the female mice of each group mated respectively with male CBA/J×BALB/c or CBA/J×DBA/2 to establish normal pregnancy group (CBA/J♀×Balb/c/2♂) or RSA model (CBA/J♀×DBA/2♂). The numbers of viable and reabsorbed embryos in each group were counted at 13.5 days of gestation. The number of mast cells in mouse uterus tissue was counted using toluidine blue staining. Expressions of IFN-γ，IL-4，IL-33 and ST2 in serum or deciduas were assessed by ELISA，qRT-PCR and Western blot respectively.

Results： A RSA mouse model was successfully established. The embryo absorption rate in RSA group was significantly higher than that in normal pregnancy group (16.2% vs. 4.92%，P<0.05). The number of mast cells in RSA group was significantly lower than that in normal pregnancy group [(1.50±0.83) vs. (3.35±1.63)，P<0.05]. Compared with the mice in normal pregnancy group，RSA model mice revealed elevated serum IFN-γ [(346.79±4.34) vs. (168.84±2.35)，P<0.05] and depressed serum IL-4 [(98.46±5.81) vs. (157.56±9.35)，P<0.05]. The qRT-PCR and Western blot results showed that IFN-γ levels in RSA group was significantly higher，but IL-4，IL-33 and ST2 levels were significantly lower than those in normal pregnancy group(P<0.05).

Conclusions： Mast cells and IL-33/ST2 may be involved in the regulation of Th1/Th2，which may be helpful to maintain pregnancy.

Key words：Mast cell；IL-33；ST2；Recurrent spontaneous abortion；Th1/Th2

【作者簡介】羅金，女，湖北天門人，博士，生殖醫(yī)學專業(yè).(*通訊作者，Email：dryangqing@hotmail.com)

【基金項目】中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項(No. 2042015kf0137)

【收稿日期】2015-06-27；【修回日期】2015-08-26

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.2.010