KaiB調(diào)控藍(lán)藻生物鐘振蕩的分子機(jī)制

楊麗婷 綜述，劉　森 審校

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·綜述·

KaiB調(diào)控藍(lán)藻生物鐘振蕩的分子機(jī)制

楊麗婷 綜述，劉森 審校

[摘要]藍(lán)藻PCC7942的基因簇KaiABC編碼的KaiA、KaiB及KaiC蛋白對(duì)單細(xì)胞藍(lán)藻的生物節(jié)律非常重要。藍(lán)藻翻譯后生物鐘是受一系列生物化學(xué)反應(yīng)控制的，其中包括磷酸化反應(yīng)、ATP水解、單體的交換以及各種分子構(gòu)象的變化，從而維持了生物振蕩的準(zhǔn)確與精密。本文對(duì)近些年來KaiB在翻譯后振蕩體系中參與Kai蛋白的相互作用而共同調(diào)節(jié)生物振蕩，對(duì)ATP酶的影響及誘導(dǎo)KaiC單體的交換等一系列過程進(jìn)行了綜述，并介紹了KaiB與信號(hào)輸出蛋白SasA的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，這對(duì)揭示體外生物鐘的工作機(jī)制有著非常重要的意義。

[關(guān)鍵詞]KaiB蛋白；磷酸化循環(huán)反應(yīng)；單體的交換；ATP酶活性；SasA

作者單位：443002湖北宜昌，腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院

引用格式：楊麗婷,劉森.KaiB調(diào)控藍(lán)藻生物鐘振蕩的分子機(jī)制[J].東南國防醫(yī)藥，2016,18(1):68-72.

生物節(jié)律現(xiàn)象廣泛存在于生物界，而且越來越多的研究報(bào)道顯示：無論是原核單細(xì)胞有機(jī)體、高等動(dòng)植物還是人類的許多生理代謝活動(dòng)都是在生物鐘控制下進(jìn)行的。藍(lán)藻是已知的具有晝夜節(jié)律生物鐘的最簡(jiǎn)單模式生物，為闡明晝夜節(jié)律的基本分子機(jī)制帶來很大便利，其KaiA、KaiB及KaiC三種核心蛋白維持的生物振蕩，不依賴于DNA轉(zhuǎn)錄水平與RNA翻譯水平調(diào)控的轉(zhuǎn)錄/翻譯負(fù)反饋回路(Transcriptional/Translational Feedback Loop, TTFL)，稱為翻譯后振蕩(Post-Translational Oscillation，PTO)[1]。更為重要的是，KaiA/KaiB/KaiC體系是目前唯一能在體外重組的、翻譯后振蕩的生物鐘體系，并且生物鐘所具有的自我維持性、周期性及溫度補(bǔ)償性都可以由KaiA、KaiB、KaiC及ATP在試管條件下重現(xiàn)[2]。因此，該體系對(duì)于體外研究蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)模式具有重要意義，對(duì)理解晝夜節(jié)律振蕩器的形成機(jī)制也具有重要價(jià)值。本文對(duì)近些年來KaiB在振蕩體系中參與Kai蛋白的相互作用而共同調(diào)節(jié)生物振蕩，KaiB對(duì)ATP酶的影響及誘導(dǎo)KaiC單體的交換等一系列過程進(jìn)行了綜述，并介紹了KaiB與信號(hào)輸出蛋白SasA的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，這對(duì)揭示體外生物鐘的工作機(jī)制有著非常重要的意義。

1KaiABC生物節(jié)律簡(jiǎn)介

藍(lán)藻生物鐘基因是一個(gè)由KaiA、KaiB及KaiC基因組成的基因簇KaiABC，其中KaiA單獨(dú)轉(zhuǎn)錄，KaiB、KaiC共同轉(zhuǎn)錄，它們的表達(dá)產(chǎn)物KaiA、KaiB及KaiC蛋白共同組成生物鐘的中央振蕩器，產(chǎn)生晝夜節(jié)律的計(jì)時(shí)機(jī)制。具體表現(xiàn)有：基因簇轉(zhuǎn)錄水平呈高低的節(jié)律性變化，KaiC蛋白磷酸化水平高低的節(jié)律性變化。在轉(zhuǎn)錄水平，KaiA蛋白會(huì)增加KaiB與KaiC的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)其產(chǎn)物KaiC蛋白會(huì)抑制KaiA基因的表達(dá)，一旦KaiA基因的表達(dá)受抑制，KaiA蛋白量會(huì)下降，KaiB與KaiC的轉(zhuǎn)錄效率也隨之下降，即KaiB與KaiC的轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)出節(jié)律性。在蛋白水平，核心蛋白KaiC同時(shí)具有自激酶(Autokinase)和自磷酸酶(Autophosphatase)的活性，自激酶活性的存在，使KaiC能夠在自身亞基間相互磷酸化；而自磷酸酶活性則使磷酸化的KaiC能夠自動(dòng)去磷酸化，這兩種酶活性的存在使KaiC發(fā)生磷酸化-去磷酸化周期性變化具備了可能性[3]。KaiA蛋白通過促進(jìn)KaiC蛋白的磷酸化與抑制KaiC蛋白的去磷酸化，提高KaiC的磷酸化水平，而KaiB是KaiC磷酸化的負(fù)調(diào)控因子，能降低由KaiA增強(qiáng)的KaiC的磷酸化水平，使KaiC自身去磷酸化，在KaiA與KaiB的共同作用下，KaiC從整體上表現(xiàn)出磷酸化和去磷酸化的周期性振蕩[4]。

Kai蛋白與其他生物鐘蛋白沒有相似性，只要破壞這三種蛋白中的任何一種就將會(huì)使生物節(jié)律紊亂，而KaiC蛋白的生物化學(xué)性質(zhì)是了解生物鐘特性的關(guān)鍵。KaiC蛋白的功能形式是由六個(gè)單體聚合而成的同源六聚體，每個(gè)單體有兩個(gè)亞基，即N端的CI亞基與C端的CII亞基，每個(gè)CII亞基有431位的絲氨酸(S431)殘基和432位的蘇氨酸(T432)殘基兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)。因此，每個(gè)KaiC單體就有四種可能的磷酸化狀態(tài)，分別呈現(xiàn)出不同的功能。具體的表現(xiàn)為為KaiC磷酸化/去磷酸化循環(huán)的四個(gè)步驟：a. T432的磷酸化；b. S431的磷酸化；c. T432的去磷酸化；d. S431的去磷酸化(圖1)。這2個(gè)磷酸化位點(diǎn)的磷酸化和去磷酸化嚴(yán)格按照上面的順序進(jìn)行，形成一個(gè)精密的時(shí)間記錄元件，單向記錄時(shí)間的流逝[5]。

磷酸化時(shí)相，在KaiA的作用下，處于低磷酸化狀態(tài)的KaiC(TS)先T432的磷酸化(pTS)，然后 S431的磷酸化(pTpS)；去磷酸化時(shí)相，在KaiA與KaiB共同作用下，處于高磷酸化狀態(tài)的KaiC(pTpS)先T432的去磷酸化(TpS)，然后 S431的去磷酸化，KaiC回到低磷酸化狀態(tài)(TS)，一個(gè)循環(huán)結(jié)束，新的循環(huán)開始圖1　KaiC的磷酸化/去磷酸化循環(huán)

2Kai蛋白的結(jié)合位點(diǎn)

目前已經(jīng)證實(shí)KaiA有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，在磷酸化時(shí)相與去磷酸化時(shí)相分別與KaiCII的A-Loop結(jié)構(gòu)域[6]和KaiB[7]相互作用。KaiA二聚體對(duì)低磷酸化的KaiC的親和力高于處于高磷酸化狀態(tài)的KaiC[8]，當(dāng)KaiC的CII亞基處于低磷酸化狀態(tài)時(shí)，KaiA通過結(jié)合C端的A-loop(488-497位)，增強(qiáng)KaiC的自激酶的活性同時(shí)減弱磷酸酶的活性，加速其向高磷酸化狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，從而促進(jìn)KaiC磷酸化反應(yīng)。而KaiB則選擇性的結(jié)合到處于高磷酸化狀態(tài)的KaiC上，通過抑制KaiA的活性，從而使KaiC在磷酸酶的優(yōu)勢(shì)活性下，向低磷酸化狀態(tài)轉(zhuǎn)變[9]。定向標(biāo)記的電子自旋共振分析表明KaiA-KaiB有瞬間的相互作用。電子自旋磁共振顯示KaiA的C端與KaiB相互作用，而KaiA的N端對(duì)KaiA-KaiB的相互作用不是必需的。進(jìn)一步研究顯示，KaiA缺失1-179位就不能與KaiB相互作用[6]，所以KaiA連接N端與C端的連接區(qū)域(147-170位)，對(duì)KaiA-KaiB的相互作用非常重要。進(jìn)一步研究顯示KaiC的N端能夠增強(qiáng)ΔNKaiA-KaiB(ΔNKaiA為KaiA缺失1-135位)的相互作用[10]。

KaiB的主要作用是結(jié)合磷酸化狀態(tài)的KaiC，阻止KaiA與KaiC的相互作用，從而促進(jìn)KaiC向去磷酸化狀態(tài)轉(zhuǎn)變，但KaiB與KaiC相互作用區(qū)域迄今尚不明確。電鏡、小角散射實(shí)驗(yàn)表明KaiB是和KaiC的CII亞基結(jié)合的，那么KaiB最可能是通過結(jié)合在KaiC的CII亞基端，直接占據(jù)KaiA的結(jié)合位點(diǎn)，或形成空間位阻，來影響KaiA與KaiC的結(jié)合；Villarreal等[11]的研究，較好地支持KaiB-KaiC相互作用發(fā)生在CII端的ATP溝槽。Chang等[12]利用NMR實(shí)驗(yàn)表明KaiB和KaiC反應(yīng)發(fā)生在CI亞基由一些非極性氨基酸及帶負(fù)電的氨基酸殘基組成的B-loop(116-123位)，但具體的作用區(qū)域目前還不明確，且存在爭(zhēng)議。一般情況下，KaiB是不能結(jié)合到KaiC的CI亞基上的，因?yàn)檫@個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是隱藏的。但是當(dāng)CI亞基和CII亞基之間有堆積力的作用，使CI亞基構(gòu)象發(fā)生變化，暴露出KaiB結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，KaiB才能結(jié)合上去[12]。這說明KaiB有也可能結(jié)合在CI亞基來調(diào)節(jié)KaiC的磷酸化程度。

綜上所述，KaiB可能結(jié)合在KaiC的CI亞基和CII亞基。如果KaiB結(jié)合在CII亞基上則主要可能是通過直接影響CII亞基的表面靜電勢(shì)(electrostatic surface potential，ESP)調(diào)節(jié)KaiC的運(yùn)行，也有可能是阻礙KaiA與KaiC的結(jié)合位點(diǎn)來調(diào)節(jié)KaiC的振蕩，還有可能是調(diào)節(jié)ATP與KaiC的反應(yīng)來調(diào)節(jié)KaiABC的正常運(yùn)行。如果KaiB結(jié)合在CI亞基上，則可能是從KaiC的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面來間接調(diào)節(jié)KaiABC反應(yīng)。雖然KaiB與KaiC的具體結(jié)合位點(diǎn)存在爭(zhēng)議，但是KaiB的結(jié)合都可以占領(lǐng)或影響KaiA與KaiC的結(jié)合，來實(shí)現(xiàn)使KaiC從高磷酸化狀態(tài)向低磷酸化狀態(tài)的轉(zhuǎn)變[13]。

3KaiB結(jié)合KaiC時(shí)的聚合形式

KaiB是三種蛋白中最小的一個(gè)，結(jié)構(gòu)類似于硫氧還蛋白折疊的二聚體或四聚體，單體由102個(gè)氨基酸組成。KaiB蛋白會(huì)發(fā)生自身相互作用而形成二聚體、四聚體甚至多聚體。最近的研究發(fā)現(xiàn)，生物鐘蛋白KaiB不具有自激酶活性，但可以與KaiC直接發(fā)生相互作用而參與生物鐘的調(diào)控，并且KaiB的不同的聚合形式之間的平衡和轉(zhuǎn)化，對(duì)核心振蕩器的節(jié)律性有影響[14]。那么，KaiB究竟以何種形式與KaiC結(jié)合的呢？

基于以前的研究我們認(rèn)為KaiB是以穩(wěn)定的同源四聚體存在，但它的四聚體不能與KaiA或KaiC相互作用，只有當(dāng)聚合物解聚后才有此功能。KaiA就是通過加速KaiB四聚體的解離，從而促進(jìn)KaiB與KaiC的結(jié)合。同樣的方法，KaiC促進(jìn)KaiB與KaiA的相互作用。已經(jīng)有研究顯示，KaiB是以二聚體的形式結(jié)合到CII亞基上的，KaiB二聚體與CII亞基的頂端相互作用形成三層夾心的結(jié)構(gòu)[15]。Heck等用質(zhì)譜的手段發(fā)現(xiàn)在與KaiC的結(jié)合過程中，KaiB的單體、二聚體、四聚體等形式都有參與，他們指出KaiB單體是和KaiC發(fā)生反應(yīng)的基本單位，而且不排除KaiB能和KaiC的CI亞基、CII亞基都發(fā)生反應(yīng)[16]。因此，KaiB的單體、二聚體和四聚體形式的動(dòng)態(tài)變化，可能與KaiC的磷酸化振蕩息息相關(guān)。而KaiB的尾端可能通過影響單體-二聚體-四聚體的平衡而影響其聚合狀態(tài)，然而只有二聚體與KaiC發(fā)生相互作用，不同時(shí)期可能KaiB有不同的聚合體形式和KaiC發(fā)生相互作用[17]。我們通過構(gòu)建不同的共價(jià)連接寡聚體的策略，研究了KaiA和KaiB蛋白的共價(jià)二聚體的功能，初步發(fā)現(xiàn)共價(jià)連接的蛋白對(duì)KaiC的振蕩現(xiàn)象產(chǎn)生了很大影響，反映出寡聚體間動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)變對(duì)該振蕩體系正常功能的重要性。相信對(duì)KaiA/KaiB/KaiC核心振蕩體系的分子機(jī)制的進(jìn)一步闡明，將有助于我們對(duì)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)、生物振蕩器以及高等生物晝夜節(jié)律現(xiàn)象等的深入理解。

4KaiB影響ATP酶的活性及誘導(dǎo)KaiC單體的交換

除了KaiC的磷酸循環(huán)，ATP的結(jié)合也是藍(lán)藻生物計(jì)時(shí)機(jī)制的一個(gè)重要的生物過程。ATP的主要功能是為該體系提供能量、維持KaiC的六聚體功能狀態(tài)以及為KaiC的磷酸化提供磷酸基團(tuán)參與KaiC的磷酸化振蕩。而KaiB通過影響ATP的結(jié)合而間接的影響到該體系的能量供給及KaiC功能六聚體的形成，從而阻礙KaiC的磷酸化循環(huán)的正常運(yùn)行。

此外，KaiC是一個(gè)特殊的ATP酶，并且這種ATP酶的活性也呈現(xiàn)節(jié)律性與溫度補(bǔ)償效應(yīng)，而且這種活性似乎還決定著KaiA/KaiB/KaiC振蕩體系周期的長(zhǎng)短：活性越高，周期越短；活性越低，周期越長(zhǎng)[18]。KaiC上的ATP酶的活性主要受KaiB與KaiA調(diào)控，與KaiC所處的磷酸化狀態(tài)無關(guān)[19]。KaiC的ATP酶和磷酸酶的活性是相互交融的。由于CI亞基結(jié)構(gòu)的特殊性，只有ATP酶活性，且較穩(wěn)定。如果KaiB與CI亞基結(jié)合則會(huì)影響CI亞基上的ATP酶活性，從而影響KaiC的磷酸化振蕩[10]。此外，KaiB可能通過結(jié)合到KaiC的CII亞基ATP結(jié)合槽上，影響ATP的結(jié)合，從而來調(diào)節(jié)KaiC磷酸化振蕩。當(dāng)KaiC達(dá)到一定的磷酸化程度后，其CII亞基的激酶活性由于KaiB對(duì)ATP結(jié)合槽的影響而轉(zhuǎn)向?yàn)锳TP合成酶活性和ATP水解酶活性，從而進(jìn)入去磷酸化相位[20]。因此，從一定意義上可以說，KaiB是KaiABC磷酸化振蕩體系的核心調(diào)節(jié)元件，該調(diào)控受到ATP結(jié)合比例的影響。

另外，KaiB通過影響ATP的結(jié)合誘導(dǎo)KaiC單體的交換。很多實(shí)驗(yàn)都證實(shí)在KaiC的磷酸化循環(huán)過程中，KaiC六聚體與單體及另外的KaiC六聚體會(huì)發(fā)生亞基的交換，即KaiC六聚體存在不斷的解聚與再聚合過程[5]。研究表明，任何狀態(tài)的KaiC單體都可以和六聚體的KaiC中的單體發(fā)生交換，從而改變六聚體KaiC的磷酸化水平[21]，這對(duì)維持較高的振蕩振幅是非常重要的。KaiC的CII結(jié)構(gòu)域ESP在處于低磷酸化狀態(tài)時(shí)是帶正電的，在轉(zhuǎn)向高磷酸化狀態(tài)時(shí)分子表面就會(huì)累積負(fù)電荷；KaiB的C末端富含酸性氨基酸，而ATP是該區(qū)域中唯一一個(gè)與KaiB尾巴帶有相同電性的分子。因此，KaiB很有可能定向的與KaiC相互作用而將其聚合體分離為單體及干擾ATP的結(jié)合。如果KaiB將它的尾巴插入到KaiC的兩個(gè)亞基之間，ATP的結(jié)合位點(diǎn)就會(huì)被破壞，從而減弱亞基之間的相互作用，最終導(dǎo)致亞基的分離甚至是促成他們之間的交換[22]。因此，KaiB除了抑制KaiA的功能，還可能用它帶負(fù)電荷的C末端減弱KaiCII亞基的相互作用及減弱ATP酶的活性甚至是替換ATP。KaiC的CI亞基與CII亞基以及這兩個(gè)亞基的相互作用，對(duì)這種酶活性的轉(zhuǎn)變起關(guān)鍵作用[23]。綜上所述，KaiB可以通過影響ATP的結(jié)合、影響ATP酶的活性及誘導(dǎo)KaiC單體的交換而間接的調(diào)控KaiC的磷酸化振蕩(圖2)。

圖2　KaiB調(diào)控KaiC的磷酸化振蕩

5KaiB與SasA競(jìng)爭(zhēng)KaiCII同一結(jié)合位點(diǎn)

信號(hào)輸出蛋白SasA，是組氨酸激酶感受器，最初的研究表明SasA與KaiC有相互作用，并且該作用發(fā)生在SasA的N端結(jié)構(gòu)域(1-97位)，進(jìn)一步的研究又發(fā)現(xiàn)他們的相互作用也是有節(jié)律性的。SasA-KaiC復(fù)合物的SAXS和EM的綜合結(jié)果顯示，兩個(gè)SasA的N端結(jié)合在KaiCII上KaiB的結(jié)合位點(diǎn)上，并且對(duì)之后KaiC的磷酸化狀態(tài)敏感。非變性PAGE膠顯示：SasA與KaiB都不結(jié)合KaiCI；SasA與KaiB 兩種蛋白競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合到KaiCII結(jié)構(gòu)域上；SasA結(jié)合KaiC比KaiB結(jié)合KaiC更緊密。簡(jiǎn)言之就是SasA與KaiB競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合到KaiCII結(jié)構(gòu)域上，這個(gè)結(jié)論就可以很好的解釋在KaiB的活性被抑制的時(shí)候，SasA可以替代KaiB與KaiC發(fā)生相互作用[24]。綜上所述，SasA[25]與KaiB[12]都結(jié)合到KaiCII結(jié)構(gòu)域上，并且KaiB與SasA競(jìng)爭(zhēng)同一結(jié)合位點(diǎn)B-Loop。

N-SasA與KaiB有很大一段相似序列，它可以與KaiC直接相互作用。進(jìn)一步研究表明SasA與KaiB有許多相似的特性，其中包括ESP，但是N-SasA水溶液的核磁(NMR)圖顯示N-SasA與KaiB有很重要的不同點(diǎn)。SasA與KaiB的一個(gè)顯著的不同就是SasA單體就可以感知KaiC的磷酸化狀態(tài)，但目前沒有充足的證據(jù)證明KaiB也是以單體的形式結(jié)合到KaiC上的。另外，SasA與KaiB的C末端尾巴有很大的不同，KaiB的C末端顯著性的特征是富含酸性殘基的氨基酸，而SasA的C末端作為二聚體的連接子沒有這一特征[22]。KaiB只能結(jié)合到S431殘基磷酸化狀態(tài)的KaiC上[26]，而SasA能夠結(jié)合任何磷酸化狀態(tài)的KaiC[27]，但是KaiB能替換處于任何磷酸化狀態(tài)的KaiC上結(jié)合的SasA[14]。KaiC的N端直接與SasA相互作用接受時(shí)間信號(hào)，并促進(jìn)SasA的磷酸化循環(huán)然后將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移給轉(zhuǎn)錄因子RpaA，RpaA磷酸化而被激活[28]。在主觀黑暗條件下，KaiB-KaiC復(fù)合物激活CikA，從而誘導(dǎo)RpaA的去磷酸化而被抑制[29]。因此，KaiB-KaiC結(jié)合的節(jié)律可以通過調(diào)控隨后對(duì)RpaA具有相反作用的SasA與CikA而調(diào)控生物鐘信號(hào)的輸出。

6結(jié)語

生物鐘是生物適應(yīng)環(huán)境周期性變化的一種內(nèi)在機(jī)制，具有調(diào)控代謝、生理穩(wěn)態(tài)、睡眠及衰老等重要的生理功能，生物鐘的紊亂會(huì)嚴(yán)重影響健康或生存。近年來，陸續(xù)有研究證明了生物節(jié)律紊亂與皮膚病、心血管疾病及癌癥等疾病的發(fā)生發(fā)展存在著密切關(guān)系。生物鐘研究以同時(shí)考察時(shí)間和空間四維尺度的方式來研究生命現(xiàn)象的節(jié)律性動(dòng)態(tài)變化，可以更為準(zhǔn)確地揭示生命現(xiàn)象的規(guī)律及內(nèi)在機(jī)制。藍(lán)藻生物鐘體系是目前已知最簡(jiǎn)單的生物鐘體系，但機(jī)制又非常復(fù)雜，雖然經(jīng)過近30年的研究，僅就KaiB仍有諸多未解決的問題：KaiB與KaiC的具體結(jié)合部位，結(jié)合形式，結(jié)合狀態(tài)等都存在一些爭(zhēng)議，有些觀點(diǎn)甚至截然相反。KaiB與KaiC的相互作用對(duì)磷酸化時(shí)相轉(zhuǎn)向去磷酸化時(shí)相有非常重要的意義，但是目前其中的機(jī)制研究仍不清楚。對(duì)Kai復(fù)合物的研究顯示，KaiB存在單體、二聚體及四聚體，但是KaiB的結(jié)合模式，相互作用的化學(xué)計(jì)量以及確切的結(jié)合表面仍存在諸多疑點(diǎn)。對(duì)于這些問題的解決，有待更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的出現(xiàn)。通過對(duì)這些生物機(jī)制深入、系統(tǒng)的研究，為人們更好的適應(yīng)生存環(huán)境提供了科學(xué)合理的指導(dǎo)，同時(shí)也為相關(guān)疾病的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

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(本文編輯：張仲書)

(收稿日期：2015-11-08；修回日期：2015-12-08)

通訊作者：劉森，E-mail: senliu.ctgu@gmail.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21103098)

[中圖分類號(hào)]Q6，Q7

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi：10.3969/j.issn.1672-271X.2016.01.021