前列腺癌組織中Skp2的表達(dá)及其與前列腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系

段　松

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·論著·

前列腺癌組織中Skp2的表達(dá)及其與前列腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系

段松

[摘要]目的研究S期激酶相關(guān)蛋白2(S-phase kinase associated protein 2, Skp2)在前列腺癌患者中的表達(dá)及其與前列腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系。方法選擇2010年6月-2012年6月接受手術(shù)的前列腺癌86例作為觀察組，同時(shí)選取良性前列腺增生25例作為對(duì)照組，檢測(cè)兩組前列腺組織中Skp2的mRNA水平和Skp2蛋白的表達(dá)，根據(jù)Skp2表達(dá)情況將觀察組分為陽(yáng)性組和陰性組，分析Skp2表達(dá)與臨床病理特征及術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系。結(jié)果與對(duì)照組相比，觀察組前列腺癌組織中Skp2 mRNA和Skp2蛋白的表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。觀察組Skp2陰性35例的1、2、3年復(fù)發(fā)率為8.57%、25.71%、31.43%，顯著低于Skp2陽(yáng)性51例的27.45%、39.22%、49.02%(P<0.05)；Skp2陰性患者1、2、3年生存率分別為97.14%、91.43%、82.86%，顯著高于Skp2陽(yáng)性患者的90.19%、84.31%、70.59%(P<0.05)。結(jié)論前列腺癌組織中Skp2 mRNA和Skp2蛋白的高水平表達(dá)與前列腺癌組織分型、臨床分期、腫瘤浸潤(rùn)程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系，可能是前列腺癌發(fā)展的重要機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞]前列腺癌；S期激酶相關(guān)蛋白2；復(fù)發(fā)率；生存率

作者單位：404000重慶,重慶三峽中心醫(yī)院病理科

引用格式：段松.前列腺癌組織中Skp2的表達(dá)及其與前列腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系[J].東南國(guó)防醫(yī)藥，2016,18(1):47-50.

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是一種發(fā)生在前列腺的上皮性惡性腫瘤，老年男性中常見(jiàn)，在世界癌癥總發(fā)病數(shù)中約占十分之一，全世界每年約有20萬(wàn)患者死于前列腺癌[1-2]。我國(guó)前列腺癌發(fā)病年齡在55歲左右，發(fā)病率隨著年齡的增長(zhǎng)而增長(zhǎng)，嚴(yán)重影響了老年男性的生活質(zhì)量和預(yù)期壽命[3]。目前手術(shù)治療是前列腺癌治療的主要方法，臨床顯示，早期前列腺癌行根治術(shù)患者的五年相對(duì)生存率達(dá)到99%，但大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)為腫瘤發(fā)展的中晚期，錯(cuò)失手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)[4]。我國(guó)前列腺癌的平均五年生存率僅為53.8%[5-6]。因此，闡明前列腺的發(fā)生發(fā)展機(jī)制對(duì)早期診斷、早期治療及預(yù)后判斷起著重要的作用。S期激酶相關(guān)蛋白2(S-phase kinase associated protein 2, Skp2)是DNA復(fù)制所必需的人類(lèi)F-box蛋白家族的一員，在泛素蛋白酶降解途徑中起特異性識(shí)別蛋白底物的作用，參與抑癌蛋白的降解、細(xì)胞周期調(diào)控及細(xì)胞增生與凋亡的調(diào)控，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后關(guān)系密切，具有潛在的診斷和治療價(jià)值[7-9]。本研究探討Skp2在前列腺癌患者中的表達(dá)及其與前列腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系，旨在為前列腺癌的臨床診斷和治療提供幫助。

1資料與方法

隨機(jī)選取2010年6月-2012年6月在我院接受手術(shù)的并經(jīng)臨床和病理確診為前列腺癌的86例作為觀察組，取其前列腺癌手術(shù)切除組織用于本研究?；颊吣挲g58～76(70.03±14.21)歲,均為初治者,術(shù)前未經(jīng)內(nèi)分泌治療、化療、放療、生物免疫治療及其他相關(guān)抗腫瘤治療,所有病例均無(wú)合并其他惡性腫瘤。取同期經(jīng)手術(shù)切除并由臨床和病理確診為良性前列腺增生的25例的組織作為對(duì)照組，患者年齡55～75(68.79±13.45)歲。兩組患者年齡等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.1儀器與試劑總RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自南京唯贊生物有限公司；兔抗人Skp2多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗、GAPDH內(nèi)參等均購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司；C1000 RT-PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司;PSA檢測(cè)試劑盒由鄭州博賽生物技術(shù)研究所提供。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1RT-PCR檢測(cè)Skp2 mRNA水平根據(jù)總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)兩組標(biāo)本的總RNA進(jìn)行提取，按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GeneBank提供的Skp2 mRNA序列，設(shè)計(jì)如下引物(上海生工生物有限公司)：Skp2-F：5′-ATGTGACTGGTCGGTT-3′；Skp2-R:5′-TCGATA￣G￣G￣T￣C￣C￣A￣T￣G￣T￣G￣C￣T￣-￣3￣′￣;￣G￣A￣P￣D￣H￣-￣F￣:￣5￣′￣-￣A￣G￣A￣A￣G￣G￣C￣T￣G￣G￣G￣G￣C￣T￣C￣A￣T￣T￣T￣G￣-￣3￣′￣;￣G￣A￣P￣D￣H￣-￣F￣:￣5￣′￣-￣A￣G￣G￣G￣G￣C￣C￣A￣T￣C￣C￣A￣C￣A￣G￣T￣C￣T￣T￣C￣-￣3￣′￣。￣對(duì)￣引￣物￣特￣異￣性￣和￣退火溫度進(jìn)行條件優(yōu)化后制備以下反應(yīng)體系：2×SYBR Green通用型qPCR Master Mix 10 μL，上游/下游引物(10 μmmol/L)各0.6 μL，1∶100稀釋后的cDNA 8.8 μL?？偡磻?yīng)體積20 μL。30 ℃水浴10 min；96 ℃，預(yù)變性2 min，1個(gè)循環(huán)；96 ℃，變性30 s；56 ℃，退火30s；72 ℃，延伸2 min；共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃總延伸6 min，于PCR儀上讀取數(shù)據(jù)。

1.2.2免疫組化檢測(cè)Skp2蛋白水平兩組標(biāo)本離體后經(jīng)10%中性福爾馬林固定48 h，石蠟包埋，作 4 μm切片。在55 ℃烤箱中烘烤1 h；依次進(jìn)行脫蠟、水化；按說(shuō)明書(shū)操作，采用DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)脂封固。

1.2.3免疫組化評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)每個(gè)組織標(biāo)本隨機(jī)選取6個(gè)視野，根據(jù)細(xì)胞核的染色情況進(jìn)行陽(yáng)性率判斷。染色強(qiáng)度分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)色：0分；淡黃色：1分；棕黃色：2分；棕褐色：3分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：1%～10%視為1分；1l%～50%視為2分；51%～75%視為3分；>75%視為4分。兩者得分相乘，以總分4分為分界點(diǎn)，因Skp2表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)，由此將<4分者定義為Skp2陰性，≥4分者為Skp2陽(yáng)性[10]。

1.2.4PSA濃度測(cè)定陰性和陽(yáng)性組患者均于手術(shù)前3 d清晨空腹采靜脈血 3 mL，離心收集血清測(cè)定血清PSA的濃度，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5臨床及病理學(xué)特征分析腫瘤穿透前列腺包膜和淋巴轉(zhuǎn)移參照NCCN前列腺癌臨床實(shí)踐指南亞洲共識(shí)(V2.2013版)的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[11]：腫瘤穿透前列腺包膜33例，淋巴轉(zhuǎn)移42例。腫瘤分期根據(jù)Jewett-Whitmore-Prout 方案評(píng)價(jià)：A期8例、B期28例、C期31例、D期19例。按照已有文獻(xiàn)報(bào)道[12]進(jìn)行PSA分組，術(shù)前血清前列腺特異抗原(PSA)值<4 μg/L者 13例,4~10 μg/L者18例, >10 μg/L者55例?；颊叱鲈汉蠖ㄆ谶M(jìn)行檢查，根據(jù)患者臨床癥狀、體征、相應(yīng)的檢查(CT掃描和病理檢查等)及淋巴結(jié)檢測(cè)判斷患者是否出現(xiàn)復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移。對(duì)于患者的預(yù)后采用術(shù)后復(fù)發(fā)率和1、2、3年生存率進(jìn)行評(píng)定。

2結(jié)果

2.1兩組Skp2 mRNA的表達(dá)觀察組Skp2 mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(圖1，P<0.05)。

與對(duì)照組比較，*P<0.05圖1　兩組組織標(biāo)本Skp2 mRNA水平比較

2.2兩組Skp2蛋白表達(dá)的比較Skp2蛋白主要表達(dá)于前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞核中，在正常前列腺組織中其表達(dá)水平極低甚至不表達(dá)(圖2A)，在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平顯著增加(圖2B)。觀察組前列腺腫瘤組織中Skp2蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組的良性前列腺增生(圖3，P<0.05)。

A：對(duì)照組前列腺組織；B：觀察組前列腺組織圖2　兩組組織中Skp2蛋白的表達(dá)

與對(duì)照組比較，*P<0.05圖3　兩組Skp2蛋白分析結(jié)果比較

2.3觀察組中Skp2水平與臨床病理特征的相關(guān)觀察組中35例Skp2蛋白表達(dá)為陰性，51例為Skp2蛋白表達(dá)陽(yáng)性。表1顯示觀察組Skp2蛋白陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理特征具有明顯的相關(guān)性，觀察組中Skp2蛋白陽(yáng)性表達(dá)與前列腺癌術(shù)前PSA水平(>10 μg/L)、腫瘤穿透前列腺被膜(有)、淋巴轉(zhuǎn)移(有)呈密切正相關(guān)(r分別為0.540、0.610、0.528，均P<0.05), 而與組織分化程度(低分化)，腫瘤分期(C+D)呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.478、-0.513，均P<0.05)。

2.4不同Skp2蛋白表達(dá)的患者術(shù)后復(fù)發(fā)、生存率比較兩組患者治療后均回訪3年以上，Skp2陰性患者共11例復(fù)發(fā)；Skp2陽(yáng)性患者共25例復(fù)發(fā)。Skp2陰性患者1、2和3年的復(fù)發(fā)率分別為8.57%(3例)、25.71%(9例)、31.43%(11例)；Skp2陽(yáng)性患者的1、2和3年的復(fù)發(fā)率分別為27.45%(14例)、39.22%(20例)、49.02%(25例)，兩組復(fù)發(fā)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Skp2陰性患者1、2、3年生存率分別為97.14%(34例)、91.43%(32例)、82.86%(29例)，Skp2陽(yáng)性患者1、2、3年生存率分別為90.19%(46例)、84.31%(43例)、70.59%(36例)，Skp2陰性患者1、2、3年生存率顯著高于Skp2陽(yáng)性患者(P<0.05)。

表1　觀察組Skp2蛋白的表達(dá)與臨床病理

3討論

前列腺癌為老年男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中僅次于膀胱腫瘤和腎腫瘤的惡性腫瘤，且逐漸呈低齡化[13],在中國(guó)的一些經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)其發(fā)病率在逐年攀升。前列腺癌患者的預(yù)后情況根據(jù)腫瘤的臨床分期和病理分級(jí)亦呈現(xiàn)多種變化[14],臨床希望能尋找前列腺癌的特異性分子標(biāo)記物來(lái)幫助解決目前所遇到的困境。

Skp2是1995年Demetrick等通過(guò)熒光原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與細(xì)胞周期密切相關(guān)的基因，因其能與S期激酶CyclinA-CDK1相互作用而得名，分子量45KD，因此又稱(chēng)為P45蛋白，屬于原癌蛋白[15-16]。Skp2作為一種DNA復(fù)制所必需的F-box蛋白，是人類(lèi)SCF復(fù)合物中行使特異性識(shí)別底物功能的組分，參與泛素依賴性蛋白水解途徑，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的含量，從而調(diào)控細(xì)胞周期及細(xì)胞的增殖和凋亡[17]。Skp2蛋白主要在細(xì)胞核中表達(dá),在細(xì)胞核中Skp2的過(guò)表達(dá)與細(xì)胞周期激酶抑制劑(CDKi)p27蛋白的低表達(dá)密切相關(guān)，使受損的細(xì)胞由G1期過(guò)渡到S期，該過(guò)程與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)[18-19]。Bochis等[20]通過(guò)對(duì)結(jié)腸癌中Skp2表達(dá)水平的分析發(fā)現(xiàn)，Skp2表達(dá)水平與結(jié)腸癌的不良預(yù)后密切相關(guān)，Skp2高表達(dá)患者，其預(yù)后較差， Skp2可作為結(jié)腸癌一個(gè)重要的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，并可能成為結(jié)直腸癌的一個(gè)有前途的治療目標(biāo)。另外有研究發(fā)現(xiàn)，Skp2的高表達(dá)和p27的低表達(dá)與多種腫瘤呈正相關(guān)關(guān)系。Zheng等[21]通過(guò)分析雌激素受體表達(dá)不同的乳腺癌患者中Skp2和p27的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在雌激素受體陰性的乳腺癌患者中Skp2通常高表達(dá)，且患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例較高，Skp2高表達(dá)與p27低表達(dá)高度相關(guān)。

本研究進(jìn)一步探討了前列腺癌組織中Skp2的表達(dá)及臨床意義，對(duì)比分析前列腺癌組織和良性前列腺組織，結(jié)果顯示前列腺癌組織中Skp2 mRNA表達(dá)水平明顯高于良性前列腺組織，提示前列腺癌組織中Skp2基因的轉(zhuǎn)錄處于激活狀態(tài)。進(jìn)一步分析Skp2蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中Skp2蛋白的表達(dá)也明顯高于良性前列腺組織，并與Skp2 mRNA的表達(dá)一致，這一結(jié)果與Wei等[22]的研究結(jié)果相同。此外，結(jié)果還顯示Skp2蛋白的表達(dá)與患者臨床病理特征如血清PSA水平、臨床分期、組織分型、浸潤(rùn)程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間存在一定關(guān)系，提示Skp2蛋白與前列腺癌患者的術(shù)后復(fù)發(fā)和生存存在聯(lián)系。本文亦通過(guò)隨訪分析了Skp2蛋白不同表達(dá)水平的前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)和生存情況，結(jié)果顯示Skp2蛋白表達(dá)陽(yáng)性患者術(shù)后1、2、3年的復(fù)發(fā)率明顯高于陰性者，而生存率則明顯低于陰性者，說(shuō)明Skp2蛋白的表達(dá)水平與前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)和生存存在密切聯(lián)系。綜上所述，Skp2在前列腺癌組織中的表達(dá)異常，與患者臨床病理特征和預(yù)后關(guān)系密切，對(duì)后期治療與判斷預(yù)后有一定幫助。

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(本文編輯：張仲書(shū)；英文編輯：王建東)

The expression of Skp2 in prostate cancer and its relationship with postoperative recurrence

DUANSong.

DepartmentofPathological,theThreeGorgesCentralHospitalofChongqing，Chongqing404000,China

[Abstract]ObjectiveTo study the expression of Skp2 in prostate cancer and its relationship with the recurrence of prostate cancer. Methods86 cases of patients diagnosed with prostate cancer and received operation in our hospital from June 2010 to June 2012 were randomly selected as observation group. At the same time, 25 cases patients with benign prostatic hyperplasia were selected as control group. Skp2 mRNA level in the two groups were determined by real-time quantitative PCR. Skp2 protein level was analyzed by immunohistochemistry. According to Skp2 level, 86 cases of patients were divided into Skp2 positive group and Skp2 negative group. The relationship between Skp2 protein level and clinical pathological features and postoperative recurrence in Skp2 positive group and Skp2 negative group were analyzed. ResultsCompared with the control group, Skp2 mRNA and protein levels in the prostate cancer tissues of the observation group increased significantly (P<0.05). 1, 2 and 3 year cumulative recurrence rate in the Skp2 negative patients were 8.57%, 25.71 and 31.43%, while 27.45%, 39.22% and 49.02% in Skp2 positive patients. The cumulative recurrence rate of Skp2 protein-negative patients was significantly lower than that of Skp2 positive patients (P<0.05). 1, 2 and 3 year cumulative survival rate in the Skp2 protein-negative patients were 97.14%, 91.43% and 82.86%, while 90.19%, 84.31% and 70.59% in Skp2 positive patients. The cumulative survival rate of Skp2 protein-negative patients was significantly higher than that of Skp2 positive patients (P<0.05). ConclusionThe high expression of Skp2 mRNA and protein in prostate cancer tissues are closely related to types, clinical stage, tumor invasion and lymph node metastasis of prostate cancer, which may be one of the important mechanism of prostate cancer development.

[Key words]prostate cancer; Skp2; recurrence rate; survival rate

(收稿日期：2015-08-24；修回日期：2015-11-23)

[中圖分類(lèi)號(hào)]R737.25

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi：10.3969/j.issn.1672-271X.2016.01.014