納豆芽孢桿菌代謝產(chǎn)γ-聚谷氨酸液體發(fā)酵中試研究

陳衛(wèi)鋒，秦 濤，劉成更，李文孝，馬 齊

（1.陜西省科學(xué)院酶工程研究所，陜西西安 710600；2.西北生物農(nóng)業(yè)中心，陜西西安 710043）

納豆芽孢桿菌代謝產(chǎn)γ-聚谷氨酸液體發(fā)酵中試研究

陳衛(wèi)鋒1，秦 濤1，劉成更1，李文孝1，馬 齊2

（1.陜西省科學(xué)院酶工程研究所，陜西西安 710600；2.西北生物農(nóng)業(yè)中心，陜西西安 710043）

以納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilis natto）HSF1410為發(fā)酵菌株，在前期發(fā)酵條件基礎(chǔ)上，利用10 L發(fā)酵罐優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和供氧條件，再進(jìn)行500 L發(fā)酵罐中試試驗(yàn)，中試γ-聚谷氨酸最高產(chǎn)量達(dá)32.4 g/L。

γ-聚谷氨酸；發(fā)酵；中試生產(chǎn)

γ-聚谷氨酸（Poly γ-glutamic acid，γ-PGA）是由D-谷氨酸和L-谷氨酸單體以酰胺鍵形式縮合而成的一種氨基酸聚合物。γ-PGA具有可降解性、成膜性、保濕性、可食性等特點(diǎn)，在醫(yī)藥、環(huán)保、食品、化妝品及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[1-3]。

γ-PGA可以通過化學(xué)合成[4]、天然產(chǎn)物提取以及微生物發(fā)酵而得，微生物發(fā)酵法[5]與前2種方法相比，不僅生產(chǎn)成本低，而且生產(chǎn)過程污染小，適合大規(guī)模生產(chǎn)，因此采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)聚谷氨酸成為目前研究方向的主流，現(xiàn)在絕大多數(shù)γ-PGA產(chǎn)品由利用芽孢桿菌[6]發(fā)酵、提取分離得到。

試驗(yàn)以納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilis natto）HSF1410為生產(chǎn)菌株，在搖瓶發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件及10 L發(fā)酵罐小試的基礎(chǔ)上，進(jìn)行500 L發(fā)酵罐中試研究，確定其最適發(fā)酵工藝參數(shù)。

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilis natto）HSF1410，由陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院提供；葡萄糖、酵母粉、K2HPO4，NH4Cl，MgSO4，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供。

GRJB-10D型10 L發(fā)酵罐，鎮(zhèn)江格瑞生物工程有限公司產(chǎn)品；500 L發(fā)酵罐，陜西美樂設(shè)備有限公司產(chǎn)品；UV-2802SH型紫外可見分光光度計(jì)，上海尤尼柯儀器有限公司產(chǎn)品；NDJ-5型黏度測(cè)定儀，北京東西器材有限公司產(chǎn)品；S1100型高效液相色譜儀，美國Agilent公司產(chǎn)品。

（1）液體種子培養(yǎng)基。液體LB培養(yǎng)基，pH值7.0，于121℃條件下蒸汽滅菌20 min。

（2）原發(fā)酵培養(yǎng)基。葡萄糖30 g/L，NH4Cl 4 g/L，L-谷氨酸鈉15 g/L，酵母粉1 g/L，K2HPO43 g/L，MgSO40.2 g/L，無水 CaCl20.2 g/L，pH值 7.0，于121℃下蒸汽滅菌20 min。

（3）優(yōu)化培養(yǎng)基。用玉米淀粉經(jīng)液化和糖化部分替代原發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖，用玉米漿部分替代酵母粉，滅菌同原發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 10 L發(fā)酵罐液體發(fā)酵條件的優(yōu)化

（1）滅菌。采用高壓蒸汽滅菌，滅菌溫度121℃，滅菌時(shí)間20 min。

（2）接種。用氨水調(diào)節(jié)pH值至6.8左右，接入菌種，再調(diào)節(jié)pH值至7.0，接種量約為1%。

（3）培養(yǎng)。發(fā)酵溫度28℃，風(fēng)量1∶0.5，壓強(qiáng)0.05 MPa，pH值7.0，發(fā)酵時(shí)間2 h，光密度0.35～0.50，可轉(zhuǎn)入發(fā)酵。

將納豆芽孢桿菌HSF1410接種于液體LB搖瓶種子培養(yǎng)基中，以轉(zhuǎn)速160 r/min，溫度37℃搖床培養(yǎng)18 h，即為種子液。按照2%的接種量接種至10 L發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為55%，通氣量為2 vvm，對(duì)發(fā)酵過程中的溫度、轉(zhuǎn)速及補(bǔ)料方式進(jìn)行優(yōu)化。整個(gè)發(fā)酵過程中，每4 h取1次樣，檢測(cè)發(fā)酵液中菌體生物量、聚谷氨酸合成酶活力、γ-PGA含量，以此確定最優(yōu)的10 L罐發(fā)酵工藝。

1.2.2 500 L發(fā)酵罐液體發(fā)酵方法

（1）滅菌。采用高壓蒸汽滅菌，滅菌溫度121℃，滅菌時(shí)間20 min。

（2）接種。用氨水調(diào)節(jié)pH值至7.0左右，接種量約為2%。

（3）培養(yǎng)。發(fā)酵溫度37℃，通風(fēng)量、罐壓和攪拌轉(zhuǎn)速根據(jù)溶氧的要求調(diào)節(jié)溶氧水平。補(bǔ)料分批發(fā)酵時(shí)，當(dāng)殘?zhí)呛康陀?0 g/L時(shí)補(bǔ)充糖液，以維持殘?zhí)呛繛?0～20 g/L，發(fā)酵過程中每隔4 h取樣進(jìn)行各種參數(shù)測(cè)定。

1.2.3 分析方法

（1）細(xì)胞生長測(cè)定。采用比濁法，以發(fā)酵培養(yǎng)基作為參比溶液，于波長600 nm處測(cè)定發(fā)酵液的吸光度（OD600）。

（2）發(fā)酵液中γ-PGA含量的檢測(cè)[7]。按照γ-PGA的凝膠滲透色譜（GPC）檢測(cè)方法分析各編號(hào)菌株發(fā)酵液中產(chǎn)物的濃度；采用GPC法，將發(fā)酵液稀釋25倍后過0.22 μm濾膜去除菌體，用1100Series型高效液相色譜儀進(jìn)行分析；TSK-gelG5000PWxl-CP型色譜柱，10 μm，7.8 mm×30 mm（TOSOH，日本）；流動(dòng)相：0.015 mol/L Na2HPO4-KH2PO4，0.15 mol/L NaCl溶液，pH值7.0；流速0.4 mL/min；檢測(cè)波長220 nm；γ-PGA標(biāo)準(zhǔn)品（Vedan，中國臺(tái)灣）。

（3）殘?zhí)菧y(cè)定。采用改良裴林氏法[8]。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化

2.1.1 玉米淀粉添加量的優(yōu)化

在前期搖瓶液化發(fā)酵得出發(fā)酵培養(yǎng)基配方確定葡萄糖濃度25 g/L，試驗(yàn)采用玉米淀粉部分替代葡萄糖進(jìn)行10 L發(fā)酵罐試驗(yàn)。玉米淀粉按液化酶和糖化酶的使用說明經(jīng)過酶水解，玉米淀粉與葡萄糖質(zhì)量總計(jì)為20 g/L，玉米淀粉與葡萄糖按一定比例添加，按照接種量2%，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵pH值7.0，通過分批次調(diào)節(jié)通風(fēng)量、罐壓和攪拌轉(zhuǎn)速將溶氧控制在20%～25%，發(fā)酵52～54 h，測(cè)殘?zhí)呛亢挺?PGA產(chǎn)量。

玉米淀粉添加量對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響見圖1。

圖1 玉米淀粉添加量對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響

由圖1可知，隨著玉米淀粉添加量的增大，γ-PGA產(chǎn)量明顯減少。在玉米淀粉與葡萄糖添加比例在0.25時(shí)，γ-PGA產(chǎn)量降低不明顯，說明此發(fā)酵可以部分利用玉米淀粉水解的糖作為碳源。

玉米淀粉添加量對(duì)底物轉(zhuǎn)化率的影響見表1。

表1 玉米淀粉添加量對(duì)底物轉(zhuǎn)化率的影響

玉米淀粉水解后，在發(fā)酵液中也是葡萄糖，底物轉(zhuǎn)化率是指γ-PGA的合成量與玉米淀粉和葡萄糖之合的比值。由表1可知，隨著玉米淀粉添加比例提高，糖的底物轉(zhuǎn)化率也隨之下降，但是在玉米淀粉添加量為0.25 g時(shí)轉(zhuǎn)化率下降不明顯。更進(jìn)一步證明，玉米淀粉可以部分替代葡萄糖作為碳源。

2.1.2 玉米漿添加量的確定

搖瓶發(fā)酵得出發(fā)酵培養(yǎng)基配方確定酵母粉2 g/L，試驗(yàn)采用玉米漿部分替代酵母粉進(jìn)行10 L發(fā)酵罐試驗(yàn)。玉米漿與酵母粉按一定比例添加，接種量2%，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵pH值7.0，通過分批次調(diào)節(jié)通風(fēng)量、罐壓和攪拌轉(zhuǎn)速將溶氧控制在20%～25%，發(fā)酵52～54 h，測(cè)γ-PGA產(chǎn)量。

玉米漿添加量對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響見圖2。

圖2 玉米漿添加量對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響

由圖2可知，隨著玉米漿添加量的增大，γ-PGA產(chǎn)量明顯減少。在玉米漿與酵母粉添加比例為0.5時(shí)，γ-PGA產(chǎn)量降低不明顯，說明此發(fā)酵可以部分利用玉米漿替代酵母粉。

2.2 分批控制溶氧10 L罐小試

在已經(jīng)確定的各項(xiàng)發(fā)酵參數(shù)條件下，在10 L發(fā)酵罐上進(jìn)行溶氧控制的研究，分別調(diào)節(jié)通氣量、罐壓、攪拌轉(zhuǎn)速，分階段控制溶氧參數(shù)。在延滯期（0～6 h）控制20%溶氧，在對(duì)數(shù)生長期（6～20 h）控制45%溶氧，進(jìn)入穩(wěn)定期（20 h以后） 控制20%溶氧。

分段控制溶氧與恒定溶氧對(duì)生物量的影響見圖3。

圖3 分段控制溶氧與恒定溶氧對(duì)生物量的影響

由圖3可知，分段控制溶氧明顯能提升發(fā)酵液生物量，菌種生長總體水平有較大幅度提高。

2.3 500 L發(fā)酵中試

分段控制溶氧與恒定溶氧對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響見圖4。

圖4 分段控制溶氧與恒定溶氧對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響

由圖4可知，分段控制溶氧提高了γ-PGA的產(chǎn)量。

2.3 500 L罐中試放大

為了評(píng)價(jià)10 L罐發(fā)酵工藝的穩(wěn)定性和可行性，在500 L罐中對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行放大試驗(yàn)。

500 L中試發(fā)酵試驗(yàn)見表2。

500 L罐中試產(chǎn)量在49～51 h達(dá)到最大，分別32.4，30.6，29.6 g/L，第3批次相對(duì)前2批次在接種時(shí)間上稍推遲，使得菌齡增長，但是仍未出對(duì)數(shù)生長期，導(dǎo)致菌種的生物量也相對(duì)前2批次增高，但

表2 500 L中試發(fā)酵試驗(yàn)

[1]Bhatt R，De Vries P，Tulinsky J，et al.Synthesis and in vivo antitumor activity of poly（L-glutamic acid） conjugates of 20S-camptothecin[J].Journal of Medicinal Chemistry，2003，46（1）：190-193.

[2]Sun M H，Park C，Kim C J，et al.Natural and ediblebiopolymer poly γ-glutamic acid：synthesis，production，and applications[J].The Chemical Record，2005（6）：352-366.

[3]鞠蕾，馬霞.γ-聚谷氨酸的應(yīng)用進(jìn)展 [J].中國釀造，2011（9）：1-4.

[4]曹名鋒，金映虹，解慧，等.聚谷氨酸的微生物合成、相關(guān)基因及應(yīng)用展望 [J].微生物學(xué)通報(bào)，2011，38（3）：388-395.

[5]Yokoigawa K，Sato M，Soda K.Simple improvement in是在同樣的發(fā)酵條件下，最終γ-PGA產(chǎn)量減少，這說明菌種過度生長會(huì)對(duì)代謝產(chǎn)物累積量有影響。

500 L中試放大，γ-PGA累積量3批次平均值為30.5 g/L，相對(duì)于10 L罐γ-PGA平均產(chǎn)量25.8 g/L提高了18.2%，這可能是由于擴(kuò)大發(fā)酵體積提高了發(fā)酵液的傳質(zhì)效率，從而改善了微生物的生長環(huán)境，使得代謝物累積量增設(shè)。

3 結(jié)論

（1）在發(fā)酵過程中，用葡萄糖質(zhì)量25%的玉米淀粉可以部分替代葡萄糖，用酵母粉質(zhì)量50%的玉米漿可以部分替代酵母粉，這樣產(chǎn)業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)可以相對(duì)控制成本。

（2）在發(fā)酵過程中采用分段控氧的供氧工藝，即通過分別調(diào)節(jié)通氣量、罐壓、攪拌轉(zhuǎn)速，分階段控制溶氧參數(shù)，在延滯期（0～6 h） 控制為20%溶氧，在對(duì)數(shù)生長期（6～20 h）控制為45%溶氧，進(jìn)入穩(wěn)定期（20 h以后）控制為20%溶氧，可以有效地提高γ-PGA發(fā)酵累積量。

（3）將10 L罐發(fā)酵工藝放大到500 L罐，發(fā)酵結(jié)果代謝產(chǎn)物量明顯提升，證明了發(fā)酵工藝穩(wěn)定可行，為γ-PGA的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。目前，尚無報(bào)道中試或產(chǎn)業(yè)化為γ-PGA發(fā)酵工藝，試驗(yàn)的發(fā)酵水平達(dá)到了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)水平，具有良好的工業(yè)化前景。

freeze-tolerance of bakers'yeast with poly γ-glutamate[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，2006（3）：215-219.

[6]程艷玲，趙玉娥，王海玉.生物降解型聚谷氨酸的研究進(jìn)展 [J].北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008（2）：45-49.

[7]呂瑩，郝紫徽，李虹.γ-聚谷氨酸的分離提純 [J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（2）：133-134.

[8]梁金鐘，王風(fēng)青．微生物發(fā)酵法合成高分子聚合物 γ-PGA的研究 [J].北京工商大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011，29（1）：24-29．◇

Pilot Scale Fermentation of γ-Poly Glutamic Acidby Bacillus Subtilis Natto HSF1410

CHEN Weifeng1，QIN Tao1，LIU Chenggeng1，LI Wenxiao1，MA Qi2
（1.Enzyme Engineering Research Institute of Shaanxi Academy of Sciences，Xi'an，Shaanxi 710600，China；
2.Nerthwest Bio-agriculture Ceuter，Xi'an，Shaanxi 710043，China）

Bacillus subtilis natto HSF1410 is taken as start strains for fermentation，on the basis of the early stage of the fermentation conditions，10 L fermentation tank is used to optimize the fermentation culture medium and oxygen supply conditions，then pilot production of poly γ-glutamic acid is carried out use 500 L fermentation tank，pilot γ-PGA maximum yield of 32.4 g/L.

γ-PGA；fermentation；pilot production

TQ922.1

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.12.031

1671-9646（2016）12b-0018-03

2016-10-12

陜西省科學(xué)院基礎(chǔ)應(yīng)用項(xiàng)目支持（2011K-13）；陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目支持（2011K02-03）。

陳衛(wèi)鋒（1971— ），男，本科，助理研究員，研究方向?yàn)槲⑸锞N選育及發(fā)酵工程。