新型O6-芐基鳥(niǎo)嘌呤衍生物的合成及其細(xì)胞毒性

李思思， 彭瑞增

(1. 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心 環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所，北京　100021；

2. 北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京　100124)

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·研究簡(jiǎn)報(bào)·

新型O6-芐基鳥(niǎo)嘌呤衍生物的合成及其細(xì)胞毒性

李思思1*， 彭瑞增2

(1. 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心 環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所，北京100021；

2. 北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京100124)

摘要：以O(shè)6-芐基鳥(niǎo)嘌呤(O6-BG)為起始原料，經(jīng)4步反應(yīng)合成了一個(gè)新型的O6-BG衍生物——4-硝基芐基-[6-(芐氧基)-9H-嘌呤-2]氨基甲酸酯(4)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和HR-ESI-MS表征。用CCK-8法研究了4對(duì)人腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(SF126， SF763和SF767)的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明：在低氧環(huán)境下，4與ACUN的協(xié)同作用對(duì)SF126， SF763和SF767均有較好的抑制活性，其IC50分別為0.04 mM， 0.1 mM和0.03 mM，優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥O6-BG。

關(guān)鍵詞：O6-芐基鳥(niǎo)嘌呤； 低氧激活； 4-硝基芐基-[6-(芐氧基)-9H-嘌呤-2]氨基甲酸酯; 合成； 細(xì)胞毒性

氯乙基亞硝基脲類(lèi)化合物(CENUs)是治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤的重要化療藥物。該藥物通過(guò)產(chǎn)生DNA股間交聯(lián)[1-2]，抑制細(xì)胞正常復(fù)制，從而發(fā)揮抗癌作用。O6-烷基鳥(niǎo)嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶(AGT)是存在于細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)蛋白，可修復(fù)CENUs對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA產(chǎn)生的烷化損傷[3-4]，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性[5]。近年來(lái)，有多種AGT抑制劑與烷化劑聯(lián)合應(yīng)用于腫瘤患者，其中O6-芐基鳥(niǎo)嘌呤(O6-BG)已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段。但O6-BG不具有靶向性，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮增敏作用的同時(shí)，亦會(huì)抑制正常細(xì)胞內(nèi)AGT活性，增加藥物敏感性，導(dǎo)致烷化劑的使用劑量大量降低至無(wú)效水平之下[6-8]。因此，合成具有靶向性的AGT抑制劑對(duì)提高CENUs抗癌效果具有較大的臨床意義。

藥物作用環(huán)境對(duì)藥效有較大影響。文獻(xiàn)[9-13]研究表明，實(shí)體腫瘤中會(huì)出現(xiàn)缺氧腫瘤細(xì)胞區(qū)域，利用該低氧環(huán)境，可以選擇性地激活前體藥物，使其分解產(chǎn)生AGT抑制劑，提高細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。

Scheme 1

為合成兼具良好AGT抑制活性和靶向性的新型抗腫瘤藥物，本文以O(shè)6-BG為原料，與特戊酸氯甲酯經(jīng)烷基化反應(yīng)后，與三光氣發(fā)生羰基化反應(yīng)制得中間體(2)； 2與對(duì)硝基苯甲醇發(fā)生加聚反應(yīng)后，再經(jīng)脫保護(hù)基反應(yīng)合成了一個(gè)新型的O6-芐基鳥(niǎo)嘌呤衍生物——4-硝基芐基-[6-(芐氧基)-9H-嘌呤-2]氨基甲酸酯(4, Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和HR-ESI-MS表征。用CCK-8法研究了4對(duì)人腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(SF126， SF763和SF767)的細(xì)胞毒性。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

Bruker AC-P 400 MHz型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；Bruker Vertex 70型傅立葉變換紅外光譜儀(KBr壓片)；TSQ Quantum型高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。

O6-BG，純度98%，百靈威科技有限公司；三光氣(BTC)，純度99%，Sigma公司；其余所用試劑均為分析純或優(yōu)級(jí)純。

1.2合成

(1) 1的合成

在反應(yīng)瓶中加入O6-BG 0.24 g(1 mmol)和1 mol·L-1乙醇鈉68 mg的乙醇(1 mL)溶液，超聲10 min使其溶解；真空抽干乙醇，殘余物用DMF(2 mL)溶解，攪拌下滴加特戊酸氯甲酯0.14 mL(1 mmol)，滴畢，于室溫反應(yīng)30 min。真空抽干DMF，殘余物經(jīng)硅膠柱色譜[洗脫劑：V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯)=1 ∶1]純化得白色粉末1 0.26 g，產(chǎn)率72.3%， m.p.161~162 ℃；1H NMRδ： 1.09(s, 9H, CH3)， 5.48 (s, 2H, CH2N)， 5.96(s, 2H, CH2in Bn)， 6.64(s, 2H, NH2)， 7.34(m, 1H, ArH)， 7.39(m, 2H, ArH)， 7.50(m, 2H, ArH)， 7.92(s, 1H, 8-H)； ESI-MSm/z： 356{[M+H]+}。

(2) 2的合成

避光、氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在圓底燒瓶中依次加入1 106 mg(0.3 mmol),無(wú)水二氯甲烷7 mL和無(wú)水吡啶0.5 mL，充分?jǐn)嚢璧萌芤篈。

冰浴冷卻，在反應(yīng)瓶中加入20%BTC 0.26 g(0.88 mmol)的甲苯(1.5 mL)溶液，攪拌下滴加溶液A，滴畢，反應(yīng)20 h。升至室溫得白色結(jié)晶2，直接投入下步反應(yīng)。

(3) 3的合成

超聲至2溶解，攪拌下加入對(duì)硝基苯甲醇0.11 g(0.7 mmol)的二氯甲烷(3 mL)溶液，反應(yīng)2 h。反應(yīng)液經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：V(二氯甲烷) ∶V(乙醇)=30 ∶1]純化得白色粉末3 0.142 g，產(chǎn)率89%， m.p.146~148 ℃；1H NMRδ： 10.20(s, D2O exchangeable, 1H)， 8.24(d,J=8.5 Hz, 2H )， 8.03(s, 1H)， 7.33~7.61(m, 7H)， 6.08(s, 2H)， 5.62(s, 2H)， 5.37(s, 2H)， 1.16(s, 9H)； ESI-MSm/z： 535{[M+H]+}。

(4) 4的合成

在圓底燒瓶中加入3 0.53 g(1 mmol)和0.1 mol·L-1氨的甲醇(40 mL)溶液，攪拌使其溶解；于室溫反應(yīng)約40 h(TLC跟蹤)。析出白色粉末，水浴反應(yīng)1 h。過(guò)濾，濾餅依次用甲醇和乙醚洗滌，干燥得白色粉末4 0.36 g，產(chǎn)率85%， m.p.233~235 ℃；1H NMRδ： 13.24(s, 1H)， 10.51(s, 1H)， 8.29~8.21(m, 3H)， 7.74(d,J=8.7 Hz, 2H)， 7.61~7.49(m, 2H)， 7.46~7.26(m, 3H)， 5.59(s, 2H)， 5.34(s, 2H)；13C NMRδ： 151.8, 151.7, 147.0, 144.7, 136.3, 128.9, 128.5, 128.3, 123.6, 67.5, 64.5； HR-ESI-MSm/z: Calcd for C20H16N6O5{[M+H]+}421.125 5, found 421.125 7。

1.3細(xì)胞毒性測(cè)定

以O(shè)6-BG為陽(yáng)性對(duì)照，4和O6-BG作前體藥物與CENUs抗腫瘤藥物尼莫司汀(ACNU)協(xié)同作用于人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SF126， SF763和SF767，采用CCK-8法測(cè)定4與ACNU聯(lián)合用藥的體外抗癌活性。

用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至5~7×104個(gè)/mL，接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)過(guò)夜。依次用不同濃度的4的培養(yǎng)基處理細(xì)胞，同時(shí)設(shè)不含藥物的陰性對(duì)照組和試劑空白對(duì)照組。每個(gè)劑量組設(shè)3組平行，分別于37°C, 5%CO2培養(yǎng)箱中和厭氧培養(yǎng)罐中培養(yǎng)24 h。更換培養(yǎng)基，每孔加入含10%CCK-8試劑的100 μL培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2~3 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定待測(cè)液在450 nm處的吸光值A(chǔ)450(A與活細(xì)胞數(shù)成正比，取平均值)，計(jì)算細(xì)胞存活率[細(xì)胞存活率/%=(OD實(shí)驗(yàn)-OD空白)/OD對(duì)照-OD空白×100%]，再計(jì)算IC50。

2結(jié)果與討論

2.1合成

合成3時(shí)，反應(yīng)儀器和試劑均需保證嚴(yán)格無(wú)水，否則可能導(dǎo)致合成失敗。合成4時(shí)，需在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，用注射器向反應(yīng)母液中逐滴加入對(duì)硝基苯甲醇，使反應(yīng)物充分反應(yīng)。

2.2細(xì)胞毒性

表1為4的細(xì)胞毒性。由表1可見(jiàn)，在有氧條件下，4與ACNU的協(xié)同作用對(duì)SF126， SF763和SF767三種腫瘤細(xì)胞均無(wú)明顯抑制效果，其IC50分別為0.8 mM， 1.2 mM和0.6 mM，與ACNU(0.85 mM， >1.2 mM， 0.9 mM) 無(wú)顯著性差異；在無(wú)氧條件下，4與ACNU的協(xié)同作用對(duì)SF126， SF763和SF767三種腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制效果，且明顯優(yōu)于ACNU單獨(dú)作用和ACNU與O6-BG的協(xié)同作用效果。說(shuō)明4可以低氧激活靶向作用于腫瘤細(xì)胞。

4作為一種低氧激活前體藥物，其本身對(duì)細(xì)胞無(wú)毒或毒性很低，但在低氧條件下可被相應(yīng)還原酶激活，釋放具有細(xì)胞毒性的藥物，從而發(fā)揮治療作用，且對(duì)還原酶表達(dá)水平較低的正常組織影響較小，因此不論是抗腫瘤作用還是安全性均比傳統(tǒng)化療藥物更具優(yōu)勢(shì)[14]。此外，由于4的結(jié)構(gòu)中含有對(duì)硝基芐基，使其也能在低氧條件下靶向作用于實(shí)體瘤組織。研究表明，硝基芳烴化合物在低氧環(huán)境下很容易失去一個(gè)電子生成硝基陰離子自由基，而在有氧條件下與氧分子發(fā)生氧化反應(yīng)迅速生成硝基芳烴或超氧歧化物[15]。正是利用硝基芳香化合物的這一特點(diǎn)，4的靶向作用性得以進(jìn)一步增強(qiáng)。

表1　4與ACNU聯(lián)合用藥的IC50

3結(jié)論

合成了低氧激活的4-硝基芐基-(6-(芐氧基)-9H-嘌呤-2)氨基甲酸酯(4)。用CCK-8法研究了4的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明：在低氧條件下，4與ACUN的協(xié)同作用對(duì)人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SF126， SF763和SF767均具有顯著的抑制作用，在有氧條件下無(wú)明顯抑制效果，即4具有低氧激活靶向作用。低氧條件下，4作為前體藥物可以顯著抑制AGT活性，其對(duì)SF126， SF763和SF767三種腫瘤細(xì)胞的 IC50分別為0.04 mM， 0.1 mM和0.03 mM，均明顯優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥O6-BG。

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《合成化學(xué)》編輯部

Synthesis and Cytotoxicity of A Novel

O6-benzylguanine Derivative

LI Si-si1*,PENG Rui-zeng2

(1. Institute of Environmental Health and Related Product Safety, Chinese Center for Disease Control and Prevention,

Beijing 100021, China; 2. College of Life Science & Bioengineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China)

Abstract：A novelO6-benzylguanine(O6-BG) derivative, 4-nitrobenzyl-[6-(benzyloxy)-9H-purin-2-yl]carbamate(4), was synthesized by a four-step reaction, usingO6-BG as starting material. The structure was characterized by1H NMR and HR-ESI-MS. The cytotoxicities of 4 were investigated by CCK-8 method. The results indicated that 4 exhibited better inhibition activities against human glioma cell lines(SF126, SF763 and SF767) with ACUN thanO6-BG under hypoxia conditions. IC50of 4 against SF126, SF763 and SF767 were 0.04 mM, 0.1 mM and 0.03 mM, respectively.

Keywords：O6-benzylguanine; hypoxia activated; 4-nitrobenzyl-[6-(benzyloxy)-9H-purin-2-yl]carbamate; synthesis; cytotoxicity

作者簡(jiǎn)介：李思思(1990-)，女，漢族，北京人，碩士研究生，主要從事抗癌藥物的研究。E-mail: lisisi918731@aliyun.com

收稿日期：2015-03-16;

修訂日期：2015-12-03

中圖分類(lèi)號(hào)：0621.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.02.15080