丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑對(duì)荔枝釀酒酵母代謝醋酸的影響

曾英杰， 商玉薈， 鐘秋平

(海南大學(xué)食品學(xué)院， 海南 ?？冢?570228)

丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑對(duì)荔枝釀酒酵母代謝醋酸的影響

曾英杰， 商玉薈， 鐘秋平*

(海南大學(xué)食品學(xué)院， 海南 海口， 570228)

為降低荔枝酒中揮發(fā)酸含量，以同時(shí)利用可發(fā)酵性糖和乙酸的釀酒酵母為出發(fā)菌株，研究丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑對(duì)釀酒酵母代謝醋酸的影響。結(jié)果表明：在荔枝酒釀造過(guò)程中，添加0.5～0.75 mmol/L的α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-CCA)對(duì)釀酒酵母代謝醋酸具有顯著影響，促使釀酒酵母表達(dá)較高的乙醇脫氫酶(ADH)、乙酰輔酶A合成酶(ACS)、異檸檬酸裂解酶(ICL)和蘋果酸合成酶(MS)的酶活性，提高釀酒酵母代謝醋酸的能力。添加0.5 mmol/L的α-CCA，釀酒酵母代謝醋酸的量比對(duì)照提高150 mg/L。

釀酒酵母； 荔枝汁； 丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑；α-氰基-4-羥基肉桂酸

荔枝是果酒加工的適宜原料，已引起眾多研究者的興趣[1]。因地處熱帶亞熱帶，利用荔枝原料釀酒時(shí)容易出現(xiàn)揮發(fā)酸(主要是醋酸)含量偏高的問(wèn)題，其主要原因是果實(shí)生長(zhǎng)過(guò)程中存在的醋酸菌在發(fā)酵前的果汁制備過(guò)程中大量繁殖，導(dǎo)致果汁中的醋酸含量在發(fā)酵前可達(dá)1.0 g/L以上,這部分醋酸最終會(huì)殘留在果酒中。當(dāng)果酒中的揮發(fā)醋酸含量達(dá)0.9 g/L以上時(shí)，會(huì)產(chǎn)生尖酸及苦味[2]，進(jìn)而降低果酒的品質(zhì)。因此，降低果酒中揮發(fā)酸的含量，提高果酒的品質(zhì)已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)[3]。與對(duì)酸酒進(jìn)行再發(fā)酵、反滲透、電滲析及中和處理來(lái)降低果酒中揮發(fā)酸含量等手段相比，采用能同時(shí)利用可發(fā)酵性糖和醋酸的釀酒酵母進(jìn)行果酒的發(fā)酵生產(chǎn)以控制揮發(fā)酸含量是可行的方法，具有工藝簡(jiǎn)單、不破壞酒質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)。Vasserot等[4]利用篩選到的3株商業(yè)釀酒酵母DV10、IOC和CHP處理含一定濃度醋酸的新鮮葡萄汁發(fā)現(xiàn)，3株酵母都能較好地代謝醋酸。郝文娟等[5]篩選到1株可用于荔枝酒釀造中代謝揮發(fā)醋酸的釀酒酵母。曾英杰等[6]以此釀酒酵母為出發(fā)菌株，研究荔枝高溫釀酒過(guò)程中同步代謝揮發(fā)醋酸的效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)初始醋酸濃度為1.5 g/L時(shí)，釀酒酵母對(duì)醋酸的代謝率最大(達(dá)48.0%)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)醋酸含量符合產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)要求。

丙酮酸是糖酵解過(guò)程中的樞紐產(chǎn)物，連接許多代謝途徑。酵母生長(zhǎng)過(guò)程中，丙酮酸在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作用下由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入線粒體后氧化脫羧形成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A進(jìn)入TCA循環(huán)而獲得酵母生長(zhǎng)所需的能量并產(chǎn)生各種中間代謝產(chǎn)物。α-CCA是有效的丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑，能抑制丙酮酸進(jìn)入線粒體，從而降低釀酒酵母生長(zhǎng)所需的能量。為了彌補(bǔ)能量的不足，利用醋酸作為碳源的釀酒酵母在乙酰輔酶A合成酶的作用下將乙酸轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A，回補(bǔ)由丙酮酸形成乙酰輔酶A的不足，從而實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步代謝醋酸的目的。但這方面的研究未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，筆者以丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑為研究對(duì)象，探討其對(duì)釀酒酵母代謝醋酸的影響，為荔枝酒的降酸提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母Ydcs101：由海南大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；荔枝(品種：金澄荔A4)：購(gòu)于陸橋農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司。

試劑：果膠酶(上海杰兔工貿(mào)有限公司)，醋酸、乙醇、乙醛、甘油測(cè)定試劑盒R-biopharm AG,D-64297 Darmstadt Germany；丙酮酸測(cè)定試劑盒(南京建成生物科技有限公司)，L-蘋果酸、琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)品，SIGMA；α-氰基-4-羥基肉桂酸，阿拉丁。

儀器：LRH-250A型生化培養(yǎng)箱(韶關(guān)泰宏醫(yī)療器械有限公司)，美的榨汁機(jī)(BCD-190KHM)，海爾冰箱(青島海爾)，安捷倫1200液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)，超聲細(xì)胞破碎儀(上海之信儀器公司)TG16-WS高速離心機(jī)(長(zhǎng)沙平凡儀器儀表廠)，Evolution300紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(Thermo Fisher)。

1.2 荔枝果汁的制備

挑選新鮮健康的荔枝果實(shí)，用自來(lái)水沖洗干凈，去皮、核后取果肉打漿，加入0.2%的果膠酶在45℃處理2 h。過(guò)濾后的汁液于12 000 r/min室溫離心15 min。收集上清液供發(fā)酵用。經(jīng)分析，果汁的組成為pH 3.5，葡萄糖58.2 g/L,蔗糖161.3 g/L(含添加蔗糖40 g/L)，果糖2.3 g/L，總二氧化硫120 mg/L，游離二氧化硫14 mg/L。

1.3α-CCA的添加及接種發(fā)酵

在澄清的荔枝汁中分別添加0 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、0.75 mmol/L和1.0 mmol/L的α-CCA，100℃殺菌15 min以消除天然存在的醋酸菌及乳酸菌等微生物的影響。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)起始醋酸濃度為1.5 g/L時(shí)酵母對(duì)醋酸代謝的百分率最大。因此，殺菌后用冰醋酸將醋酸濃度調(diào)節(jié)至1.5 g/L以探討添加α-CCA對(duì)醋酸代謝的影響。接入在25℃培養(yǎng)24 h的酵母種子106CFU/mL。每100 mL三角瓶裝至其容積的70%，三角瓶口用PTFE膜封口，于20℃的恒溫條件下進(jìn)行發(fā)酵。以抑制劑0添加的試樣作對(duì)照。發(fā)酵至恒重時(shí)發(fā)酵完成。

1.4 酵母生長(zhǎng)曲線的繪制

通過(guò)比濁法用分光光度計(jì)在600 nm處測(cè)定發(fā)酵液的吸光度，然后分別繪制酵母細(xì)胞在不同α-CCA濃度下的生長(zhǎng)曲線。

1.5 粗酶液的提取

取指數(shù)期的發(fā)酵液在6 000 r/min條件下離心10 min，收集菌體細(xì)胞，然后用含有10 mmol/L Na3PO4和2 mmol/L EDTA,pH 7.5的磷酸鉀緩沖液沖洗2次。接著超聲波破碎細(xì)胞，破碎條件：0°C條件下300 W破碎5 min，超聲3 s，間歇2 s；然后重懸在含有100 mmol/L K3PO4、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L DTT pH 7.5的磷酸鉀緩沖液中，在12 000 r/min條件下離心20 min，上清液即為粗酶提取液。

1.6 酶活性的測(cè)定

PDC(丙酮酸羧化酶)、ADH(乙醇脫氫酶)、ALDH(乙醛脫氫酶)、ACS(乙酰輔酶A合成酶)活性的測(cè)定參照參考文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行，ICL(異檸檬酸裂解酶)和MS(蘋果酸合成酶)分別采用文獻(xiàn)[7]和[8]的方法進(jìn)行，比酶活性以U/mg蛋白表示。

1.7 生理生化指標(biāo)的測(cè)定

1.7.1 蛋白質(zhì)含量 參考Bradford法測(cè)定，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，于595 nm處測(cè)定吸光度值，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品蛋白質(zhì)含量可依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

1.7.2 醋酸、乙醛、乙醇、甘油和丙酮酸 分別取不同起始濃度OAA在指數(shù)生長(zhǎng)期的發(fā)酵樣品，6 000 r/min離心10 min，取上清液，稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定醋酸、乙醛、乙醇和甘油含量，以Y(mg/g菌重)表示產(chǎn)量，Q(mg/g·h)表示比產(chǎn)率。丙酮酸的測(cè)定按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，丙酮酸的量以μmol/mg蛋白表示。

1.7.3 琥珀酸、蘋果酸的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行測(cè)定。色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq 250 mm×4.6 mm,5 μm；流動(dòng)相：以0.05 mol/L NH4H2PO4(用H3PO4調(diào)至pH2.6)為流動(dòng)相，檢測(cè)器紫外檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm，進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相流速1.0 mL/min，柱溫30℃。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每組數(shù)據(jù)取3次重復(fù)測(cè)量的平均值，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 13.0 ANOVA方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑制劑濃度對(duì)果汁中醋酸及酒精濃度的影響

從表1可以看出，隨著抑制劑α-CCA濃度的升高，發(fā)酵結(jié)束時(shí)醋酸含量先降低后升高。在抑制劑濃度為0.5 mmol/L時(shí)，發(fā)酵液醋酸含量最低，為0.38 g/L，與未添加抑制劑的對(duì)照相比，醋酸含量降低0.15 g/L，兩者差異顯著。與對(duì)照相比，添加0.25～1.0 mmol/Lα-CCA抑制劑的酒精含量顯著升高，說(shuō)明添加抑制劑后，進(jìn)入線粒體的丙酮酸減少，流向酒精生成支路的流量增加，因而酒精度增加。

表1 添加抑制劑α-CCA發(fā)酵結(jié)束的醋酸和酒精含量

Table 1 Contents of acetic acid and alcohol after fermentation supplemented with inhibitor

α?CCA濃度/(mmol/L)α?CCAconcentration醋酸/(g/L)Aceticacid酒精/%Ethanol0．000．53b11．2c0．250．56a11．7b0．500．38d12．1ab0．750．49c12．3a1．000．57a12．5a

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)。

Note：Different lowercase letters in the same column indicated significant difference atP<0.05. The same below.

2.2 抑制劑對(duì)果汁中酵母生長(zhǎng)的影響

由圖1可知，α-CCA抑制了酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)。與未添加抑制劑的對(duì)照相比，細(xì)胞生長(zhǎng)的遲滯期延長(zhǎng)、指數(shù)期最大生長(zhǎng)速率降低、穩(wěn)定期縮短，菌體數(shù)量減少。表明進(jìn)入細(xì)胞線粒體內(nèi)的丙酮酸減少，合成菌體生長(zhǎng)代謝所必需的一些基礎(chǔ)物質(zhì)相應(yīng)減少，致使酵母生長(zhǎng)速度明顯減慢，細(xì)胞數(shù)量降低。

圖1 不同α-CCA濃度的釀酒酵母生長(zhǎng)曲線

Fig.1 The growth of yeast at differentα-CCA concentration

圖2 不同α-CCA濃度的指數(shù)期酵母細(xì)胞糖 比消耗率和醋酸比消耗率

Fig.2 Specific sugar uptake ratio and specific acetic acid consumption ratio at exponential phase of yeast growth with various concentrations ofα-CCA

2.3 添加抑制劑對(duì)果汁中底物消耗的影響

由圖2可知，添加抑制劑增強(qiáng)了酵母細(xì)胞的糖比和醋酸比消耗率，其變化趨勢(shì)相同，隨著抑制劑濃度的增加呈先升后降再升高的趨勢(shì)。當(dāng)抑制劑濃度為0.75 mmol/L和1.0 mmol/L時(shí)具有最大的糖比和醋酸比消耗率，但兩者差異不顯著。對(duì)照細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，抑制劑雖然對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，卻提高了細(xì)胞對(duì)底物的比消耗率，這可能與降低的細(xì)胞生物量有關(guān)。

表2 添加α-CCA后丙酮酸的含量

Table 2 Content of pyruvate during fermentation supplemented withα-CCA

樣品α?CCA添加量/(mmol/L)Addingamountofα?CCA丙酮酸含量/(μmol/mg蛋白)Pyruvatecontent18h38h120h0．000．023e0．020d0．003d0．250．026d0．024c0．005d0．500．029c0．026c0．008c0．750．032b0．029b0．013b1．000．036a0．033a0．017a

2.4 添加抑制劑對(duì)果汁中丙酮酸代謝的影響

從表2可見(jiàn)，酵母細(xì)胞內(nèi)丙酮酸含量在不同發(fā)酵時(shí)間隨抑制劑濃度的增加而增加，在同一抑制劑濃度下隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。與對(duì)照相比，各濃度抑制劑下胞內(nèi)丙酮酸累積顯著提高。說(shuō)明抑制了丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)作用，丙酮酸進(jìn)入線粒體進(jìn)一步氧化代謝的量減少，胞內(nèi)累積丙酮酸的量增加。

2.5 其他中間代謝產(chǎn)物的變化

酵母生長(zhǎng)過(guò)程中利用糖和醋酸形成各種代謝產(chǎn)物，并產(chǎn)生還原力NAD(P)H。由表3可見(jiàn)，乙醛產(chǎn)量隨著抑制劑濃度的提高而提高，各濃度抑制劑與對(duì)照相比差異顯著；添加0.25～1.0 mmol/L抑制劑時(shí)乙醇的比產(chǎn)率顯著高于對(duì)照；添加抑制劑降低了甘油的產(chǎn)量、比產(chǎn)率及胞內(nèi)輔酶率，與不添加抑制劑的對(duì)照相比差異顯著。琥珀酸和蘋果酸是TCA環(huán)和DCA環(huán)的中間產(chǎn)物，添加0.5 mmol/L及0.75 mmol/L的抑制劑增加了琥珀酸和蘋果酸的產(chǎn)量，與對(duì)照相比差異顯著。

表3 不同α-CCA濃度中間代謝產(chǎn)物的含量

注：同行不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)。

Note: Different lowercase letters in the same line indicated significant difference atP<0.05. The same below.

表4 不同α-CCA濃度的酵母酶比活性

2.6 酶比活性變化

由表4可見(jiàn)，PDC比活性隨著抑制劑濃度的提高略有升高，但各濃度抑制劑與對(duì)照間差異不顯著；ADH比活性的變化趨勢(shì)與PDC比活性的變化趨勢(shì)完全相反，ADH比活性隨著抑制劑濃度的提高線性增強(qiáng)，添加1.0 mmol/L的抑制劑其ADH酶比活性比對(duì)照提高了約120 U/mg蛋白，兩者差異顯著。而ACS比活性隨著抑制劑濃度的提高呈先升后降的變化趨勢(shì)，0.5 mmol/L和0.75 mmol/L濃度下的抑制劑有較高的酶比活性，比對(duì)照分別提高0.82 U/mg蛋白及0.71 U/mg蛋白。ICL和MS比活性的變化趨勢(shì)相似，高濃度(1.0 mmol/L)和低濃度(0.25 mmol/L)抑制劑有較低的酶比活性，與對(duì)照相比差異不顯著。但在中間濃度即0.5 mmol/L和0.75 mmol/L時(shí)，酶比活性最大，比對(duì)照分別提高了0.05 U/mg及0.06 U/mg蛋白，差異顯著。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，添加0.5～0.75 mmol/L的α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-CCA)對(duì)荔枝釀酒酵母代謝醋酸具有顯著影響，促使釀酒酵母表達(dá)較高的ADH、ACS、ICL和MS的酶活性，提高了釀酒酵母代謝醋酸的能力。添加0.5 mmol/L的α-CCA，釀酒酵母代謝醋酸的量比對(duì)照提高150 mg/L。

1) 丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑抑制了酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)，提高了酵母細(xì)胞糖和醋酸的比消耗率。抑制劑激活的酵母糖酵解和醋酸代謝可能通過(guò)降低酵母生物量對(duì)ATP的需求而實(shí)現(xiàn)[10-11]。

2) 酵母代謝糖和醋酸的過(guò)程中，丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑同樣對(duì)中間代謝產(chǎn)物的形成具有重要影響。添加抑制劑后胞內(nèi)積累了較多的丙酮酸，產(chǎn)生了較多的乙醛、蘋果酸和琥珀酸，較少的甘油和胞內(nèi)輔酶率。丙酮酸作為酒精發(fā)酵過(guò)程的中間產(chǎn)物，并且是許多代謝物質(zhì)的前體，既處于糖酵解(EMP)途徑的末端，又是連接EMP途徑和TCA循環(huán)及其他代謝途徑的關(guān)鍵產(chǎn)物，因此其所處的位置極為特殊。丙酮酸進(jìn)入線粒體要經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，而非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑α-CCA可以阻止或減少丙酮酸進(jìn)入線粒體[12]。試驗(yàn)結(jié)果表明，添加轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑抑制了轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，減少丙酮酸向線粒體的轉(zhuǎn)移，較多的流向丙酮酸脫羧酶旁路途徑，添加0.5 mmol/L的抑制劑，產(chǎn)乙醛能力和酒精產(chǎn)量比對(duì)照分別提高0.19 mg/g菌重和0.9%(v/v)。甘油的主要作用是維持酵母細(xì)胞內(nèi)的氧化-還原再平衡[13]，由于胞內(nèi)輔酶率的降低，需要較少的甘油來(lái)氧化維持胞內(nèi)平衡，因而表現(xiàn)出甘油產(chǎn)量降低。

3) 丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑激活了釀酒酵母上調(diào)表達(dá)酒精形成及醋酸代謝相關(guān)酶的活性。在厭氧發(fā)酵條件下，當(dāng)發(fā)酵液中可發(fā)酵性糖量消耗近一半時(shí)，丙酮酸濃度達(dá)到最大值，隨后丙酮酸經(jīng)PDC催化生成乙醛，乙醛在ADH的作用下還原生成乙醇。乙醛和乙醇產(chǎn)量的變化基本與PDC和ADH酶活性變化一致。ACS、ICL和MS在醋酸代謝過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。ACS將輔酶A和乙酸轉(zhuǎn)化成乙酰CoA，乙酰CoA進(jìn)入線粒體與草酰乙酸在檸檬酸合成酶作用下形成檸檬酸，檸檬酸在順烏頭酸酶作用下轉(zhuǎn)化成異檸檬酸，異檸檬酸通過(guò)ICL的裂解產(chǎn)生琥珀酸酸和乙醛酸，隨后乙醛酸在MS作用下形成蘋果酸。添加0.5～0.75 mmol/L抑制劑減弱丙酮酸進(jìn)入TCA環(huán)通路的情況下，增強(qiáng)了釀酒酵母利用醋酸作為2C碳源的利用能力，提高了乙醛酸循環(huán)流量，進(jìn)而表現(xiàn)出琥珀酸和蘋果酸產(chǎn)量的增加。

利用具有一定醋酸代謝能力的釀酒酵母進(jìn)行醋酸代謝，通過(guò)研究添加丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑促進(jìn)對(duì)醋酸的代謝，揭示醋酸的代謝機(jī)制，為調(diào)控荔枝酒揮發(fā)酸含量提供必要的理論支撐。試驗(yàn)雖然基于荔枝汁為發(fā)酵基質(zhì)，但可為其他熱帶果酒揮發(fā)酸的調(diào)控提供借鑒。

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(責(zé)任編輯： 孫小嵐)

Effects of Pyruvate Transporter Inhibitor on the Acetic Acid Metabolism ofSaccharomycescerevisiae

ZENG Yingjie， SHANG Yuhui， ZHONG Qiuping*

(CollegeofFood,HainanUniversity,Haikou,Hainan570228,China)

In order to reduce the acetic acid in lychee wine,S.cerevisiae, which could simultaneously use the fermentative sugar and acetic acid as its carbon resources, was used to investigate the effects of supplemented withα-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (α-CCA) on acetic metabolism during lychee wine fermentation. The results indicated that supplemented with 0.5-0.75 mmol/L ofα-CCA had significantly influenced the acetic acid metabolism, since higher enzymatic activity of ADH, ACS, ICL and MS were expressed. When supplemented with 0.5 mmol/L ofα-CCA, compared with control, the amount of acetic acid metabolized was increased by 150 mg/L.

Saccharomycescerevisiae; lychee juice; pyruvic acid transport inhibitor;α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid

2015-09-07； 2016-03-05修回

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“荔枝酒釀酒過(guò)程中釀酒酵母代謝醋酸的調(diào)控機(jī)制”(31260398)；海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目“熱帶果酒揮發(fā)酸的調(diào)控研究”(313044.00)

曾英杰(1989-)，男，在讀碩士，研究方向：熱帶果酒釀制。E-mail: phhzyj@126.com

*通訊作者：鐘秋平(1966-)，男，教授，博士，從事食品發(fā)酵研究。E-mail：hainufood88@163.com

1001-3601(2016)03-0135-0148-04

TS 201.3

A

加工貯藏·農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量

Processing and Storage·Agricultural Product Quality