高效氯氰菊酯降解菌RH7的鑒定及其降解條件的優(yōu)化

劉清斌， 劉 奎， 王 軍， 李 覓， 楊小龍

(1.四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院， 四川 自貢 643000； 2.四川國光農(nóng)化股份有限公司， 四川 簡陽 641400)

高效氯氰菊酯降解菌RH7的鑒定及其降解條件的優(yōu)化

劉清斌1， 劉 奎1， 王 軍2， 李 覓1， 楊小龍1

(1.四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院， 四川 自貢 643000； 2.四川國光農(nóng)化股份有限公司， 四川 簡陽 641400)

為探明高效氯氰菊酯降解菌RH7的種屬地位及其對(duì)高效氯氰菊酯的降解率，通過分子生物學(xué)方法對(duì)菌株RH7進(jìn)行鑒定，并采用響應(yīng)曲面法對(duì)其降解條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：菌株RH7屬于銅綠假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，將其命名為Pseudomonassp.RH7。通過響應(yīng)面模型分析，得最優(yōu)降解條件為高效氯氰菊酯濃度111.7 mg/L、溫度32.05℃、pH 6.88。在此條件下，菌株RH7在5 d內(nèi)對(duì)高效氯氰菊酯降解率為79.46%，與所建立模型的預(yù)測(cè)值(80.83%)接近。

銅綠假單胞菌屬； 高效氯氰菊酯； 降解條件

2015年4月20日提請(qǐng)全國人大常委會(huì)審議的食品安全法修訂草案三審稿提出“國家鼓勵(lì)和支持使用高效低毒低殘留農(nóng)藥，推動(dòng)替代劇毒、高毒農(nóng)藥產(chǎn)品的研發(fā)和應(yīng)用，加快淘汰劇毒、高毒農(nóng)藥。劇毒、高毒農(nóng)藥不得用于蔬菜、瓜果、茶葉和中草藥材”。

高效氯氰菊酯作為低毒的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥具有對(duì)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定、降解速度慢的特點(diǎn)[1]，隨著擬除蟲菊酯農(nóng)藥廣泛、大量的應(yīng)用和使用時(shí)間的延長，造成菊酯類農(nóng)藥在農(nóng)產(chǎn)品中蓄積或殘留[2-3]。作為一種廣譜殺蟲劑，菊酯類農(nóng)藥可應(yīng)用于多種果樹、糧棉油、蔬菜和林木等多種蟲害的防治[4-5]，與人們的生活息息相關(guān)。已有研究表明，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對(duì)某些有益昆蟲(家蠶、蜜蜂和赤眼蜂等)的毒性很高[6]，對(duì)人體也有較大毒害，如神經(jīng)毒性、急性毒性、生殖和發(fā)育毒性等[7]。因此，消除和降低擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的污染物，提高食品和環(huán)境安全已成為人類亟待解決的問題。

微生物降解是消除環(huán)境中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥污染的有效途徑之一。有關(guān)高效氯氰菊酯的降解菌主要在假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)和腸桿菌屬(Enterobacter)等微生物種類中被發(fā)現(xiàn)。為豐富高效氯氰菊酯降解菌資源，筆者從土壤中篩選到的菌株RH7，采用分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，并利用響應(yīng)面法對(duì)其降解條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高其對(duì)高效氯氰菊酯的降解率，為進(jìn)一步利用該菌對(duì)高效氯氰菊酯農(nóng)藥污染的治理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

高效氯氰菊酯原藥(純度>95%，成都艾克達(dá)化學(xué)試劑有限公司)，色譜純乙腈(東莞市喬科化學(xué)有限公司)，rTaq酶、dNTPmixture；10×Pcrbuffer(freeMg2+)、MgCl2(25 mmol/L)、引物16F27/16R1492，均購于TaKaRa公司。

D3024臺(tái)式高速微量(冷凍型)離心機(jī)(大龍創(chuàng)新試驗(yàn)儀器北京有限公司)，BD-30生物顯微鏡(深圳市博視達(dá)光學(xué)儀器有限公司)，GZ-250-HSH恒溫恒濕培養(yǎng)箱(韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司)。

1.2 降解率測(cè)定

以接菌一定濃度高效氯氰菊酯培養(yǎng)液為試驗(yàn)樣，以未接菌同濃度高效氯氰菊酯培養(yǎng)液為空白樣，采用HPLC法測(cè)其殘留量。

降解率=[(a0-a)/a0]×100%

式中：a0為空白樣中高效氯氰菊酯的殘留濃度，a為試驗(yàn)樣中高效氯氰菊酯的殘留濃度。

1.3 降解菌的16SrDNA鑒定

1.3.1 細(xì)菌總DNA的提取

1) 將篩選得到的菌株活化后接種到LB固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)24 h后，挑取少量菌體到滅菌的1.5 mL EP管中。

2) 加入500 μL CTAB緩沖液和50 μL蝸牛酶(100 mg/μL)，37℃，225 r/min震蕩2 h。

3) 加入10%SDS 100 μL，接著在65℃水浴15 min和-80℃冷凍20 min，反復(fù)凍融3次之后，加等體積氯仿、酚、異戊醇(25∶24∶1，v/v/v)震蕩1 min，靜置10 min，10 000 r/min離心10 min。

4) 取上清液450 μL到新的EP中，加入0.6倍體積預(yù)冷的異丙醇，常溫靜置1 h后，20℃，10 000 r/min離心20 min。

5) 棄上清液，加入1 mL 70%乙醇，靜置10 min后，10 000 r/min離心15 min，棄乙醇溶液(重復(fù)洗滌2次)，在超凈工作臺(tái)吹干至無醇味，加入50 μL無菌雙蒸水，65℃水浴1 h。

6) 瓊脂糖電泳檢測(cè)有無DNA。

1.3.2 16SrDNA測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹的建立 將總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物1(27F)：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；引物2(1492R)：GGTTACCTTGTTACGACTT。PCR反應(yīng)體系(50 μL體系)：模板DNA 2 μL，10×PCR緩沖液5 μL，MgCl2(25 μmol/L)4 μL，引物(10 μmol/L)各0.5 μL，dNTP(2.5 μmol/L)4 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL(5 U/μL)，加ddH2O至50 μL。

PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，55℃復(fù)性1 min，72℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃溫育10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，進(jìn)行序列測(cè)定(經(jīng)上海杰李生物有限公司進(jìn)行測(cè)序)。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將測(cè)得的基因序列去除掉雜峰的部分后拼接，在Ezbiocloud上進(jìn)行序列比對(duì)，篩選相似度較高(>95%)的16SrDNA序列，采用Neighbor-Joining(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過自舉分析進(jìn)行置信度檢測(cè)，自舉系數(shù)為1 000。使用ClustalX軟件進(jìn)行序列比對(duì)，將DNA序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并將序列提交到GenBank申請(qǐng)得到注冊(cè)號(hào)。MEGA5.05繪制發(fā)育樹。

1.5 菌株降解條件優(yōu)化

綜合前期單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取高效氯氰菊酯濃度(A)、溫度(B)、pH(C)為自變量，用Design Expert V 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇3因素3水平的Box-Benhnken設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。其他培養(yǎng)條件：搖床轉(zhuǎn)速150 r/min、接種量5%(v/v)、培養(yǎng)時(shí)間5 d、普通培養(yǎng)基。

表1 菌株RH7降解高效氯氰菊酯的響應(yīng)面試驗(yàn) 因素與水平

Table 1 Factors and levels for response surface of strain RH7 to degrading Beta-cypermethrin

因素Factors編碼Number水平 Levels-101濃度/(mg/L)ConcentrationA50100150溫度/℃TemperatureB253035pHC678

1.6 回歸方程的建立

利用Design Expert V 8.0.6對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析，得到各個(gè)因素與高效氯氰菊酯降解率的回歸方程。

1.7 高效氯氰菊酯降解率的測(cè)定

1) 樣品前處理。降解試驗(yàn)定時(shí)取樣，加入等體積的三氯甲烷，旋渦混合器上充分振蕩抽提2 min，低溫離心去除菌體，取下層有機(jī)相檢測(cè)農(nóng)藥殘留濃度。

2) 色譜條件。色譜柱Sepax GP-C18柱，流動(dòng)相為乙腈∶水=75∶25(v/v)，流速1 mL/min，檢測(cè)波長278 nm，進(jìn)樣量10 μL。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=19.889x-151.06(R2=0.999 2)計(jì)算高效氯氰菊酯的降解率。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株RH7的16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

2.1.1 16SrDNA擴(kuò)增結(jié)果 由圖1可知，菌株RH7總DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物長度在1 500 bp左右，電泳條帶明亮，陰性對(duì)照無條帶，說明擴(kuò)增效果較好，結(jié)果可信。

2.1.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 RH7基因序列與BLAS比較，在QenBank中申請(qǐng)得到注冊(cè)號(hào)為KT715742。從圖2可知，菌株RH7與銅綠假單胞菌〔Pseudomonas aeruginosa JCM 5962(T)〕處于同一聚類分支上，分支置信度為100%，且BLAST比對(duì)結(jié)果表明，RH7與銅綠假單胞菌〔PseudomonasaeruginosaJCM 5962(T)〕的DNA序列相似度為99%，聚類分析與比對(duì)結(jié)果一致，因此可以確定該菌株屬于銅綠假單胞菌屬，將其命名為Pseudomonassp.RH7。

注：A為陰性對(duì)照，B為RH7擴(kuò)增產(chǎn)物。

Fig.1 The electrophoresis of amplification products of strain RH7

圖2 菌株RH7的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 菌株RH7降解高效氯氰菊酯的條件優(yōu)化

2.2.1 高效氯氰菊酯降解率的回歸方程建立及顯著性檢驗(yàn) 通過對(duì)菌株RH7降解高效氯氰菊酯響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果(表2)分析，得到3個(gè)因素與高效氯氰菊酯降解率的回歸方程：

降解率=78.63+2.74A+8.86B-1.09C+0.36AB-1.99AC+0.22BC-6.62A2-10.88B2-6.06C2

表2 菌株RH7降解高效氯氰菊酯的響應(yīng)面設(shè)計(jì) 試驗(yàn)及結(jié)果

Table 2 Response design and results of strain RH7 to degrading Beta-cypermethrin

處理TreatmentABC降解率/%Degradationrate110165．59201170．47300079．134-1-1050．6550-1-153．36600079．42700078．96800077．799-10164．621011072．341110-171．2612-11065．6013-10-162．351401-172．67151-1055．94160-1150．281700077．84

注：共有17個(gè)試驗(yàn)，其中12個(gè)為析因試驗(yàn)，5個(gè)為中心試驗(yàn)，以估計(jì)誤差。

Note：There are 17 tests including 12 factorial tests and five center tests.

2.2.2 菌株RH7降解高效氯氰菊酯的條件優(yōu)化及驗(yàn)證 采用Box-Behnken軟件對(duì)確立的回歸方程模型進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化分析，得出菌株RH7降解高效氯氰菊酯的最佳條件為高效氯氰菊酯濃度111.7 mg/L、溫度32.05℃、pH 6.88。在此條件下，實(shí)際測(cè)得高效氯氰菊酯降解率為79.46%，回歸模型預(yù)測(cè)降解率為80.83%，與預(yù)測(cè)值比較接近，說明回歸方程可真實(shí)地反應(yīng)各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。

3 結(jié)論

從土壤樣品中分離到一株高效氯氰菊酯降解菌RH7,采用分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，最終確定為銅綠假單胞菌屬(Pseudomonassp.)。依據(jù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)建立模型優(yōu)化后高效氯氰菊酯的降解條件為高效氯氰菊酯初始濃度111.7 mg/L、溫度32.05℃、pH為6.88，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min、接種量5%(v/v)、培養(yǎng)時(shí)間5 d，其預(yù)測(cè)值為80.83%。在此條件下，實(shí)際測(cè)得高效氯氰菊酯降解率為79.46%，與預(yù)測(cè)值相比其相對(duì)誤差范圍在±2%，說明該數(shù)學(xué)模型能較好預(yù)測(cè)各因素與降解率的關(guān)系。

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(責(zé)任編輯： 孫小嵐)

Identification of Beta-cypermethrin Degrading Strain RH7 and Its Optimization of Degradation Conditions

LIU Qingbin1, LIU Kui1, WANG Jun2, LI Mi1, YANG Xiaolong1

(1.CollegeofBioengineering,SichuanUniversityofScienceandEngineering,Zigong,Sichuan643000; 2.SichaunGuoguangAgrochemicalLimitedCompany,Jianyang,Sichuan641400,China)

Strain RH7 was identified by the molecular biological method and the degradation conditions were optimized by the response surface method to discuss species status of Beta-cypermethrin degrading strain RH7 and its degradation rate of Beta-cypermethrin. Results: Strain RH7 is identified asPseudomonassp. The optimum conditions for degrading Beta-cypermethrin include 111.7 mg/L Beta-cypermethrin, 32.05℃ and pH 6.88. The degradation rate of strain RH7 to Beta-cypermethrin reaches 79.46% within 5 d under the optimum conditions, which is close to the predicted value (80.83%) calculated by the established model.

Pseudomonas; Beta-cypermethrin; degradation condition

2015-11-10； 2016-05-07修回

劉清斌(1962-)，男，教授，從事食品安全研究。E-mail: 570877656@qq.com

1001-3601(2016)05-0201-0056-03

S481+.8

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