膿毒癥實(shí)驗(yàn)室診斷及其研究進(jìn)展

陳洪衛(wèi)，梁冬雨，侯彥強(qiáng)

(上海市松江區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海201600)

膿毒癥(sepsis)是致病菌或條件致病菌侵入血循環(huán)，并在血中生長繁殖，產(chǎn)生毒素而發(fā)生的過度炎癥反應(yīng)。膿毒癥經(jīng)早期診斷和有效抗菌藥物治療可以痊愈;但若炎癥失控，常發(fā)展成多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，直至死亡。多年來，盡管各國投入了大量的人力、物力，目前膿毒癥仍是重癥監(jiān)護(hù)室患者死亡的第一大原因，而且病死率以5% ～10%的速度上升。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在西方發(fā)達(dá)國家大約每年有150萬人患病，死亡率高達(dá)30% ～50%[1-2]。膿毒癥之所以病死率高，主要原因之一是缺少有效的診斷指標(biāo)，早期診斷困難，延誤了早期有效的抗菌藥物治療。血培養(yǎng)是目前診斷膿毒癥的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但此方法檢測時(shí)間長，對血液樣本要求較高，陰性結(jié)果并不能完全排除膿毒癥。目前臨床用于診斷膿毒癥的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)主要包括C反應(yīng)蛋白(C reactive protein，CRP)、白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)、白細(xì)胞介素8(interleukin 8，IL-8)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha ，TNF-α)和降鈣素原(procalcitonin，PCT)等，但因在診斷的特異性和敏感性方面存在不足，這些指標(biāo)都不是理想的診斷標(biāo)志物[3]。因此，急需尋找新的標(biāo)志物用于膿毒癥的診斷、鑒別診斷及預(yù)后判斷。我們就近幾年來臨床應(yīng)用較多、研究較熱門的膿毒癥診斷標(biāo)志物作一綜述。

一、臨床檢測指標(biāo)概述

目前，常用于膿毒癥診斷的檢測指標(biāo)有血培養(yǎng)、外周血象分析、CRP、細(xì)胞因子、PCT等。

1.血培養(yǎng) 血培養(yǎng)結(jié)果陽性是診斷膿毒癥的“金標(biāo)準(zhǔn)”，通過對血液中的細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)、染色鏡檢及鑒定能夠準(zhǔn)確地確定細(xì)菌的種類;體外藥物敏感性試驗(yàn)更為臨床抗菌藥物的合理使用提供了可靠的依據(jù)，這些都是其他方法所不能替代的。但是血培養(yǎng)也存在許多不足:陽性率低、耗時(shí)長、特殊致病菌很難通過普通培養(yǎng)檢出，臨床診斷困難[4]。

2.血常規(guī) 對膿毒癥患者外周血細(xì)胞分析可以動態(tài)反應(yīng)患者感染狀態(tài)，具有操作簡單、檢測速度快等優(yōu)點(diǎn)。目前臨床認(rèn)為白細(xì)胞(white blood cell，WBC)＜5×109/L或≤3 d者 WBC＞25×109/L，＞3 d者WBC＞20×109/L應(yīng)高度懷疑感染[5]。然而有研究表明50%的新生兒膿毒癥患兒WBC可在正常范圍內(nèi)，而且異常的WBC計(jì)數(shù)在其他病理?xiàng)l件下也可出現(xiàn)，因此WBC計(jì)數(shù)對于膿毒癥診斷缺乏敏感性和特異性。

3.CRP CRP是急性時(shí)相反應(yīng)蛋白家族中的一種，健康人血清中濃度很低。當(dāng)炎癥、組織損傷和手術(shù)后其濃度顯著增高，急性期濃度可升高上千倍，在炎癥進(jìn)程開始后6～12 h就可檢測到[6]。動態(tài)分析CRP的測定結(jié)果要比單一測定CRP結(jié)果更具診斷價(jià)值，當(dāng)CRP測定結(jié)果接近80 mg/L時(shí)，炎癥感染的診斷敏感性從67.6%增至93.4%，特異性從 61.3%增至 86.3%，結(jié)合體溫＞38.2℃，診斷特異性接近100.0%。CRP增高多見于細(xì)菌感染，而病毒感染檢測結(jié)果常在參考范圍以內(nèi)，故可作為細(xì)菌感染與病毒感染的鑒別指標(biāo)[7]。

4.白細(xì)胞介素(interleukin，IL)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)等細(xì)胞因子 IL和TNF等細(xì)胞因子是全身感染的重要炎癥介質(zhì)，血中TNF-α、IL-6的水平與MODS的發(fā)生和嚴(yán)重程度有著很好的相關(guān)性，動態(tài)監(jiān)測這些細(xì)胞因子對膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展有積極意義[8]。IL-6在感染后1 h內(nèi)釋放，膿毒癥癥狀出現(xiàn)前2 d明顯升高，可以作為膿毒癥的早期診斷指標(biāo)。

5.PCT PCT是降鈣素的前體，其與急性時(shí)相蛋白類似，正常情況下血清中PCT水平極低(＜0.1 ng/mL)，機(jī)體細(xì)菌感染4 h時(shí)開始迅速升高，8～24 h達(dá)到頂峰，測定值在1～1 000 ng/mL之間，其在體內(nèi)半衰期長，可達(dá)30 h，穩(wěn)定性非常好，升高的程度反映了系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度，對于臨床檢測有利。經(jīng)抗菌藥物或手術(shù)清除感染后，PCT水平顯著下降，其特異性和敏感性明顯優(yōu)于 CRP、WBC 計(jì)數(shù)等[9]。PCT ＞0.25 ng/mL 即提示炎癥感染，與器官衰竭和病死率相關(guān)，被認(rèn)為是目前最好的膿毒癥實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)志物[10]。但是PCT在正常嬰兒出生后48 h內(nèi)均可觀察到升高，診斷價(jià)值存在爭議，且PCT在膿毒癥與全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)的鑒別診斷和預(yù)后方面也存在不足，實(shí)驗(yàn)室檢測成本較CRP、WBC計(jì)數(shù)等指標(biāo)高，分析檢測多以半自動儀器為主，效率低，臨床應(yīng)用價(jià)值并不十分理想。

二、膿毒癥熱門指標(biāo)研究進(jìn)展

特異性標(biāo)志物的測定可對疾病的早期診斷、鑒定、預(yù)防及監(jiān)控治療可起到協(xié)助作用，尋找好的膿毒癥診斷標(biāo)志物已成為目前國際研究的熱點(diǎn)。理想的膿毒癥標(biāo)志物應(yīng)具備敏感性高、特異性好、易于檢測、價(jià)格低廉等特點(diǎn)?？扇苄约?xì)胞間黏附分子 1(soluble intercellular adhesion molecule 1，sICAM-1)、可溶性尿激酶型纖溶酶原激活物受體(soluble urokinase plasminogen activator receptor，suPAR)、DNA檢測和微小 RNAs(microRNAs，miRNAs)檢測是近幾年研究較熱門的膿毒癥指標(biāo)。

1.sICAM-1 細(xì)胞表面黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和部分上皮細(xì)胞中，介導(dǎo)WBC黏附于內(nèi)皮細(xì)胞[11]。sICAM-1主要來源于細(xì)胞表面的黏附分子脫落，其在血清中是與ICAM-1同型的蛋白質(zhì)分子，是免疫球蛋白超家族黏附分子的成員之一，參與細(xì)胞間的識別、黏附和信號傳遞，介導(dǎo)WBC向炎癥區(qū)移行和定位，膿毒癥時(shí)是中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞作用的關(guān)鍵，感染時(shí)細(xì)胞毒素、細(xì)胞因子均可上調(diào)sICAM-1的表達(dá)，在炎癥早期對WBC活性的調(diào)節(jié)尤其重要[12]。外周血WBC在靜止?fàn)顟B(tài)下僅少量表達(dá)sICAM-1，膿毒癥時(shí)sICAM-1明顯升高，內(nèi)毒素等致病因子可損害生物膜，激活免疫細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，如IL-1、TNF-α、γ 干擾素(interferon gamma ，INF-γ)，從而刺激內(nèi)皮細(xì)胞，使黏附分子由胞內(nèi)貯存池轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面，或啟動胞內(nèi)mRNA的表達(dá)促使蛋白質(zhì)合成增加，增強(qiáng)細(xì)胞間黏附作用，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[13]。sICAM-1在膿毒癥時(shí)具有敏感性高、升高速度快、持續(xù)時(shí)間長等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合臨床癥狀和感染因素，可為膿毒癥早期診斷提供依據(jù)，但尚不能評價(jià)療效。膿毒癥休克時(shí)sICAM-1可明顯升高，且與休克嚴(yán)重程度和器官衰竭程度相關(guān)，當(dāng)sICAM-1＞1 200 ng/mL時(shí)則提示患者死亡的可能性很高。

2.suPAR 尿激酶型纖溶酶原激活物受體(urokinase plasminogen activator receptor，uPAR)是纖溶系統(tǒng)家族的重要成員，在血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及大多數(shù)WBC表面表達(dá)。當(dāng)病理狀態(tài)如腫瘤、炎癥時(shí)，細(xì)胞表面的uPAR表達(dá)升高，從細(xì)胞表面脫落釋放入外周血中形成suPAR。近來，suPAR被認(rèn)為是診斷高?；颊叩臐撛跇?biāo)志物。在健康個(gè)體suPAR水平含量低而穩(wěn)定，為1.04～4.01 ng/mL，在 SIRS、膿毒癥和感染性休克時(shí)，外周血suPAR含量升高，且檢測值水平與患者生存率相關(guān)[14-15]。Savva 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥的嚴(yán)重程度與血漿suPAR濃度呈正相關(guān)，當(dāng)suPAR值達(dá)到10.5 ng/mL時(shí)，區(qū)分重度膿毒癥和輕型膿毒癥的特異性和陽性預(yù)測值分別為80.0%和77.6%，且該陽性預(yù)測值高于 PCT(72.1%)、急性生理和慢性健康評分(acute physiology and chronic health evaluation ，APACHE Ⅱ)(73.3%)，血漿suPAR在區(qū)分不同程度的膿毒癥時(shí)工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線下面積(area under curve，AUC)為 0.758，同樣高于PCT(0.652)。

suPAR在膿毒癥的早期診斷、療效和預(yù)后評估中發(fā)揮重要作用，是一種反映感染性疾病嚴(yán)重程度及其預(yù)后的標(biāo)志物，可以用于感染性疾病患者的危險(xiǎn)度分級，從而有利于盡早制定出個(gè)體化治療方案。然而，suPAR作為單一指標(biāo)輔助診斷膿毒癥的準(zhǔn)確性較差，suPAR是否參與危重病發(fā)生和發(fā)展還需進(jìn)一步探討。

3.DNA檢測 (1)血漿循環(huán)DNA(cell free DNA，cf-DNA)檢測:目前以核酸為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)已應(yīng)用于臨床，利用分支鏈DNA Alu技術(shù)定量檢測膿毒癥患者血漿中cf-DNA的表達(dá)水平，對膿毒癥的診斷和鑒別診斷有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。cf-DNA是存在于人血液和體液中的細(xì)胞外DNA，正常人體內(nèi)含量很少，但在炎癥、腫瘤和免疫性疾病中表達(dá)升高[17]。侯彥強(qiáng)等[18]利用分支鏈DNA Alu技術(shù)定量檢測重癥監(jiān)護(hù)室內(nèi)24例膿毒癥患者、43例SIRS患者和73名健康人血漿cf-DNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示膿毒癥患者血漿cf-DNA水平明顯高于SIRS患者和健康人群(P＜0.001);ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，血漿cf-DNA指標(biāo)對膿毒癥具有較高的診斷價(jià)值(AUC=0.955)，當(dāng)最佳臨界值為385 ng/mL時(shí)，敏感性為91.7%，特異性為98.6%。在膿毒癥和SIRS的鑒別診斷中，血漿cf-DNA指標(biāo)也表現(xiàn)出較高的價(jià)值，AUC為0.777，最佳臨界值為 522 ng/mL，敏感性為91.7%，特異性為60.5%[19]。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是目前最常用的cf-DNA檢測方法，但是該方法存在操作復(fù)雜、技術(shù)要求高等缺陷，不確定因素也較多;(2)細(xì)菌DNA檢測:通過對細(xì)菌DNA或RNA進(jìn)行擴(kuò)增來檢測細(xì)菌的存在，已成為微生物診斷的一個(gè)發(fā)展趨勢。細(xì)菌主要包含16S、5S和23S 3個(gè)DNA序列，其中16S DNA序列保守性最強(qiáng)，序列中的某些片段為所有細(xì)菌共有。Loens等[20]通過設(shè)計(jì)細(xì)菌16S DNA基因保守區(qū)引物對臨床標(biāo)本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)置了標(biāo)準(zhǔn)菌株和人基因組作為陽性對照和陰性對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有標(biāo)準(zhǔn)菌株均出現(xiàn)了371 bp的陽性條帶，而人基因組DNA無陽性條帶出現(xiàn)，充分證明了此方法對細(xì)菌檢測具有高度的特異性。PCR是一種擴(kuò)增反應(yīng)，此方法的最小檢出量可達(dá)1 pg/mL，敏感性可達(dá)100.0%，特異性為96.8%。應(yīng)用16S DNA保守區(qū)引物對細(xì)菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增，其優(yōu)點(diǎn)是不受抗菌藥物影響，且不需要體外培養(yǎng)，節(jié)省了診斷時(shí)間，從而為膿毒癥的早期診斷提供了強(qiáng)有力的支撐。

4.miRNAs檢測 miRNAs是一類高度保守的非編碼小RNAs，大約包含21～22個(gè)核苷酸，其在腫瘤、炎癥等病理狀態(tài)特異性表達(dá)，并在細(xì)胞的發(fā)育、分化、增殖和凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮作用。有研究發(fā)現(xiàn)，血清或血漿中存在多種miRNAs標(biāo)志物，他們在疾病的診斷、治療和預(yù)后過程中發(fā)揮作用，循環(huán)miRNAs最早在腫瘤領(lǐng)域備受關(guān)注。血漿miRNAs可作為膿毒癥的診斷標(biāo)志物，并有望成為膿毒癥治療新靶點(diǎn)。

膿毒癥是由病原微生物感染引起的全身炎癥反應(yīng)，miRNAs可通過轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)炎癥因子和炎癥因子信號通路的受體來調(diào)控失衡的炎癥反應(yīng)，包括抗原呈遞、TLR信號途徑、細(xì)胞因子和淋巴細(xì)胞受體信號等。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs可在膿毒癥患者組表達(dá)水平明顯低于SIRS組和健康組。其中，miRNA-146a在血漿的水平與IL-6類似，其在SIRS、膿毒癥和健康者之間存在差異，可用于膿毒癥與SIRS的鑒別。而血漿miRNA-233僅在膿毒癥時(shí)降低，SIRS中不降低，其ROC曲線具有最高的 AUC(0.858)，miRNA-146a和 IL-6的 AUC 僅次其后，分別為 0.804 和0.785，miRNA-233具備高的準(zhǔn)確性和敏感性，有望成為膿毒癥理想的診斷標(biāo)志物[21]。

綜上所述，膿毒癥是SIRS的一種，早期診斷并給予規(guī)范化治療是降低死亡率的關(guān)鍵。雖然與膿毒癥相關(guān)的標(biāo)志物多達(dá)178種，但缺少理想的診斷標(biāo)志物。目前診斷膿毒癥仍以血培養(yǎng)為主，外周血WBC計(jì)數(shù)和分類、CRP和PCT等測定為輔。由于單一標(biāo)志物診斷存在局限性，學(xué)者們開始轉(zhuǎn)向多指標(biāo)聯(lián)合診斷技術(shù)的研究，旨在提高膿毒癥的診斷準(zhǔn)確性和臨床實(shí)用性。相信隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，研究人員的不懈努力，在不久的將來，人類一定會攻克這一難題，理想的膿毒癥實(shí)驗(yàn)診斷標(biāo)志物或?qū)嶒?yàn)診斷方法一定會出現(xiàn)。

[1]Gonsalves MD，Sakr Y.Early identification of sepsis[J].Curr Infect Dis Rep，2010，12(5):329-335.

[2]Bauer M，Reinhart K.Molecular diagnostics of sepsis-where are we today[J].Int J Med Microbiol，2010，300(6):411-413.

[3]Sankar V，Webster NR.Clinical application of sepsis biomarkers[J].J Anesth，2013，27(2):269-283.

[4]Waring WS，Moonie A.Earlier recognition of nephrotoxicity using novel biomarkers of acute kidney injury[J].Clin Toxicol(Phila)，2011，49(8):720-728.

[5]Oncel MY，Dilmen U，Erdeve O，et al.Proadrenomedullin as a prognostic marker in neonatal sepsis[J].Pediatr Res，2012，72(5):507-512.

[6]Pedersen T，Roikjaer O，Jess P.Increased levels of C-reactive protein and leukocyte count are poor predictors of anastomotic leakage following laparoscopic colorectal resection[J].Dan Med J，2012，59(12):A4552.

[7]Vincent JL，Donadello K，Schmit X.Biomarkers in the critically ill patient:C-reactive protein[J].Cri Care Clin，2011，27(2):241-251.

[8]MclLwain RB，Timpa JG，Kurundkar AR，et al.Plasma concentrations of inflammatory cytokines rise rapidly during ECMO-related SIRS due to the release of preformed stores in the intestine[J].Lab Invest，2010，90(1):128-139.

[9]Kibe S，Adams K，Barlow G.Diagnostic and prognostic biomarkers of sepsis in critical care[J].J Antimicrob Chemother，2011，66(Suppl 2):ii33-ii40.

[10]Berg P，Lindhardt B?.A procalcitonin-guided algorithm for pneumonia may reduce antibiotic use and treatment duration[J].Ugeskr Laeger，2012，174(35):1986-1989.

[11]Bielinski SJ，Reiner AP，Nickerson D，et al.Polymorphisms in the ICAM1 gene predict circulating soluble intercellular adhesion molecule-1(sICAM-1)[J].Atherosclerosis，2011，216(2):390-394.

[12]Kowalska I，Borawski J，Nikolajuk A，et al.Insulin sensitivity，plasma adiponectin and sICAM-1 concentrations in patients with subclinical hypothyroidism:response to levothyroxine therapy[J].Endocrine，2011，40(1):95-101.

[13]Deneva-Koycheva TI，Vladimirova-Kitova LG，Angelova EA，et al.Serum levels of siCAM-1，sVCAM-1，sE-selectin，sP-selectin in healthy Bulgarian people[J].Folia Med，2011，53(2):22-28.

[14]Hoenigl M，Raggam RB，Wagner J，et al.Diagnostic accuracy of soluble urokinase plasminogen activator receptor(suPAR)for prediction of bacteremia in patients with systemic inflammatory response syndrome[J].Clin Biochem ，2013，46(3):225-229.

[15]Donadello K，Scolletta S，Covajes C，et al.suPAR as a prognostic biomarker in sepsis[J].BMC Med，2012，10:2.

[16]Savva A，Raftogiannis M，Baziaka F，et al.Soluble urokinase plasminogen activator receptor(suPAR)for assessmentofdisease severity in ventilatorassociated pneumonia and sepsis[J].J Infect，2011，63(5):344-350.

[17]Wagner J.Free DNA--new potential analyte in clinical laboratory diagnostics[J].Biochem Med(Zagreb)，2012，22(1):24-38.

[18]侯彥強(qiáng)，梁冬雨，彭 亮，等.分支鏈DNA Alu技術(shù)定量檢測敗血癥患者血漿循環(huán)DNA的表達(dá)[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2012，27(12):1050-1053.

[19]Moreira VG，Prieto B，Rodriguez JS，et al.Usefulness of cell-free plasma DNA，procalcitonin and C-reactive protein as markers of infection in febrile patients[J].Ann Clin Biochem，2010，47(Pt 3):253-258.

[20]Loens K，Bergs K，Ursi D，et al.Evaluation of NucliSens easyMAG for automated nucleic acid extraction from various clinical specimens[J].J Clin Microbiol，2007，45(2):421-425.

[21]Wu L，Li H，Jia CY，et al.MicroRNA-223 regulates FOXO1 expression and cell proliferation[J].FEBS Lett，2012，586(7):1038-1043.