亞砷酸鈉對皮膚細(xì)胞角化相關(guān)基因表達(dá)的影響

李　煜， 吳　軍, 鄭玉建， 陳柔錦， 劉　媛， 葛　龍， 郎　曼

(新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生教研室， 烏魯木齊　830011)

?

亞砷酸鈉對皮膚細(xì)胞角化相關(guān)基因表達(dá)的影響

李煜， 吳軍, 鄭玉建， 陳柔錦， 劉媛， 葛龍， 郎曼

(新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生教研室， 烏魯木齊830011)

摘要:目的探討亞砷酸鈉對人角質(zhì)形成細(xì)胞角化相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響，為進(jìn)一步闡述砷致皮膚角化機制的研究提供依據(jù)。方法用濃度為0.00(對照)、1.30、3.25、6.50 μmol/L的亞砷酸鈉培養(yǎng)基培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞24、48、72、96 h；采用MTT還原法檢測細(xì)胞生長情況；采用實時熒光定量PCR法檢測HaCaT細(xì)胞角蛋白1(Keratin1，K-1)、角蛋白10 (Keratinl0，K-10)的mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果(1)1.30 μmol/L的亞砷酸鈉染毒能顯著促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖，3.25 μmol/L、6.50 μmol/L的亞砷酸鈉染毒48 h開始抑制HaCaT細(xì)胞的增殖，且與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(2)1.30 μmol/L的亞砷酸鈉染毒HaCaT細(xì)胞24 h能促進(jìn)K1和K10 mRNA的表達(dá)上調(diào)，3.25 μmol/L、6.50 μmol/L的亞砷酸鈉染毒72 h可使HaCaT細(xì)胞中K1、K10 mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)，且與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論亞砷酸鈉濃度<1.30 μmol/L時，對人皮膚細(xì)胞的促增殖作用明顯，促進(jìn)皮膚角化進(jìn)程；K1、K10的上調(diào)在皮膚細(xì)胞增殖和角化的過程中發(fā)揮一定作用。

關(guān)鍵詞：亞砷酸鈉； HaCaT細(xì)胞； 角蛋白1； 角蛋白10

地方性砷中毒(簡稱地砷病)是一種嚴(yán)重危害人類健康的地方病，主要臨床表現(xiàn)為皮膚病變。研究發(fā)現(xiàn)砷中毒初始期和早期只出現(xiàn)表皮角化而未有色素異常[1]。在表皮細(xì)胞分化過程中產(chǎn)生的角蛋白是角質(zhì)形成細(xì)胞的重要組成部分[2]，角蛋白的異?？赡軙?dǎo)致一系列以角質(zhì)形成細(xì)胞病變?yōu)橹鞯钠つw病。占正常皮膚表皮絕大部分的棘層主要表達(dá)角蛋白1(K1)和角蛋白10(K10)。K1和K10常被作為表皮正常分化的標(biāo)志物[3]。作為上皮分化標(biāo)志的角蛋白，其表達(dá)與上皮角質(zhì)形成細(xì)胞的生長分化密切相關(guān)。在疾病情況下，角蛋白異常表達(dá)會引起細(xì)胞增殖和分化的失調(diào)[4]。目前角蛋白的表達(dá)與皮膚細(xì)胞增殖和皮膚角化的聯(lián)系尚不清楚，需進(jìn)一步探討研究。本研究以亞砷酸鈉(NaAsO2)作為處理因素，人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT)為研究對象，模擬砷暴露后皮膚細(xì)胞形態(tài)、增殖的變化，并檢測亞砷酸鈉處理后HaCaT細(xì)胞相關(guān)角化基因mRNA的表達(dá)，為探討砷致皮膚角化過度的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器(NaAsO2)分析純(北京化學(xué)試劑三廠)，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、青鏈霉素混合液(美國GIBCO公司)，PBS緩沖液 (美國HyClone 公司)，75%乙醇、無水乙醇，四噻唑藍(lán)(MTT)粉劑、二甲基亞砜(DMSO)(德國Sigma公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國TAKARA公司)，Power SYBR Green PCR Master Mix(美國Applied Biosystems Life技術(shù)有限公司)，371型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific)，全自動酶標(biāo)儀(MC318，上海三科儀器有限公司)，CFX 96型實時熒光定量PCR儀(美國Bio-RAD公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與染毒生化角質(zhì)形成細(xì)胞株(HaCaT)購買于上海博谷生物科技有限公司。細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100μg/mL 鏈霉素)，在5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期、融合率>80%時，以0.25%胰蛋白酶消化傳代(1∶2 傳代)。亞砷酸鈉染毒HaCaT細(xì)胞24 h的LC50為65.00 μmol/L。實驗分為對照組及染毒組。各組染毒濃度分別為LC50的1/50、1/20、1/10，即1.30、3.25、6.50 μmol/L，對照組為0.00 μmol/L。

1.3細(xì)胞增殖活性的測定MTT比色法檢測細(xì)胞活性。細(xì)胞消化后，接種于2×104個/孔的密度96孔板中，每孔100 μL，48 h 后加入含0(對照)、1.30、3.25、6.50 μmol/L 亞砷酸鈉的DMEM高糖培養(yǎng)基，分別作用24、48、72 h。待細(xì)胞培養(yǎng)至染毒終點時，每孔加入含0.5 mg/mL 的MTT 溶液10 μL；于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h 后，吸棄培養(yǎng)基，加入150 μL 的二甲基亞砜(DMSO)作用10 min后，用酶聯(lián)免疫檢測儀(酶標(biāo)儀)在490 nm波長處測定其光吸收值(OD490值)，OD值可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大活細(xì)胞數(shù)量越多。單一實驗重復(fù)3次，取均值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。細(xì)胞增殖抑制率(%)=1-不同濃度染毒組OD490值/對照組OD490值×100%

1.4角化相關(guān)基因mRNA表達(dá)的檢測

1.4.1總RNA的提取及檢測用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA。使用核酸蛋白檢測儀測定總RNA的濃度(ng/μL)和純度(A280/A260)，選擇A280/A260比值為1.8～2.0的RNA樣品進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4.2反轉(zhuǎn)錄按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件：42℃ 60 min，70℃ 5 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3實時熒光定量PCR應(yīng)用引物有K1、K10，PCR引物序列采用Primer Premier 6.0設(shè)計，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。實時熒光定量PCR根據(jù)Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明，在CFX96型序列檢測儀上進(jìn)行實時熒光定量PCR分析。擴增條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火1 min，40個循環(huán)。擴增完畢后進(jìn)行溶解曲線分析，每個標(biāo)本樣品重復(fù)3次。并以β-actin基因做為內(nèi)參基因，運用2-ΔΔCt法分析各基因的mRNA相對表達(dá)量，其中，ΔΔCt=[(Ct暴露組目的基因-Ct暴露組內(nèi)參基因)-(Ct對照組目的基因-Ct對照組內(nèi)參基因)]。

2結(jié)果

2.1HaCaT細(xì)胞形態(tài)變化HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，對照組(0.00 μmol/L)細(xì)胞生長良好，細(xì)胞多呈扁平狀梭形，細(xì)胞邊界清晰，融合率達(dá)70%左右，生長狀態(tài)佳；1.30 μmol/L亞砷酸鈉染毒48 h后，細(xì)胞生長密集，幾乎不見細(xì)胞空隙狀態(tài)較好；3.25 μmol/L亞砷酸鈉染毒48 h后，細(xì)胞無明顯增殖，有少量收縮細(xì)胞，但染毒72 h后細(xì)胞明顯收縮變圓變小，邊界模糊，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞質(zhì)流出，細(xì)胞邊緣參差不齊；6.50 μmol/L亞砷酸鈉染毒48 h后，細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞邊緣開始模糊，染毒至72 h，細(xì)胞明顯不貼壁，大量脫落(圖1)。

2.2HaCaT細(xì)胞活性變化染毒組與對照組細(xì)胞增殖率相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=90.60，P<0.05)；相同染毒濃度不同時間點之間細(xì)胞增殖率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=20.96，P<0.05)；時間和濃度的交互作用有統(tǒng)計學(xué)意義(F=15.74，P<0.05)。染毒24 h時各濃度組OD值均大于對照組，提示細(xì)胞增殖率均增高；1.30 μmol/L染毒組隨染毒時間的延長細(xì)胞增殖率上升；3.25 μmol/L 染毒組隨染毒時間的延長細(xì)胞增殖率上升但在72 h時開始下降；6.50 μmol/L染毒組隨時間延長，細(xì)胞增殖率明顯下降,見表1和圖2。

24 h 0.00 μmol/L染毒組

24 h 1.30 μmol/L染毒組

24 h 3.25 μmol/L染毒組

24 h 6.5 μmol/L染毒組

48 h 0.00 μmol/L染毒組

48 h 1.30 μmol/L染毒組

48 h 3.25 μmol/L染毒組

48 h 6.50 μmol/L染毒組

72 h 0.00 μmol/L染毒組

72 h 1.30 μmol/L染毒組

72 h 3.25 μmol/L染毒組

72 h 6.50 μmol/L染毒組

圖1　亞砷酸鈉染毒HaCaT細(xì)胞不同時間后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化圖(×10)倍

注：同一時間點與對照組比較，*P<0.05； 同組各時間點與24 h比較,aP<0.05。

圖2　亞砷酸鈉不同時間不同濃度染毒HaCaT細(xì)胞趨勢圖

2.3HaCaT細(xì)胞K1 mRNA和K10 mRNA表達(dá)變化相同染毒濃度不同時間點HaCaT細(xì)胞中K1 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=23.62，P<0.05)；時間和濃度的交互作用差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=12.85，P<0.05)。染毒后細(xì)胞K1 mRNA表達(dá)總體呈上升趨勢。1.30 μmol/L染毒組K1 mRNA表達(dá)與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；3.25 μmol/L染毒組的K1 mRNA表達(dá)水平呈先上升后下降的趨勢并在48 h時表達(dá)最高，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意(P<0.05)；6.50 μmol/L染毒組的K1 mRNA表達(dá)水平隨著時間的增加而降低，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

相同染毒濃度不同時間點之間細(xì)胞中K10 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=40.41，P<0.05)；時間和濃度的交互作用有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.85，P<0.05)。1.30 μmol/L染毒組HaCaT細(xì)胞K10 mRNA表達(dá)水平均呈上升趨勢與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；3.25 μmol/L染毒組與6.50 μmol/L染毒組在72 h時K10 mRNA表達(dá)水平開始下降，各組K10 mRNA表達(dá)水平與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2　亞砷酸鈉染毒對HaCaT細(xì)胞中K1mRNA和K10 mRNA表達(dá)水平的影響(n=4, ±s)

注：同一時間點與對照組比較，*P<0.05；同組各時間點與24 h比較,aP<0.05。

3討論

HaCaT來源于正常成人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞，與正常皮膚細(xì)胞有許多相似特性，目前已被廣泛用于砷化物對皮膚的毒性效應(yīng)研究[5]。本研究結(jié)果顯示在低濃度時即1.30 μmol/L組可明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖；隨染砷濃度升高至3.25 μmol/L和6.50 μmol/L時，隨染毒時間的延長，細(xì)胞增殖率逐漸降低。即不同濃度的亞砷酸鈉對HaCaT細(xì)胞的增殖率具有雙向調(diào)節(jié)作用，這與一些研究結(jié)果相一致：如許熙國[6]研究發(fā)現(xiàn)≤2.5 μmol/L亞砷酸鈉染毒HaCaT細(xì)胞能使增殖率增加，其中染毒濃度為0.15 μmol/L時的增殖率增加最明顯；>2.5 μmol/L亞砷酸鈉染毒組HaCaT細(xì)胞增殖明顯抑制；吳順華[7]等發(fā)現(xiàn)亞砷酸鈉濃度為1.6 μmol/L時，對人表皮細(xì)胞的促增殖作用明顯，此后隨濃度增加促增殖作用呈遞減趨勢，濃度高于3.2 μmol/L時表現(xiàn)為生長抑制作用。有研究證實砷的這種促增殖作用與細(xì)胞生長因子有關(guān)[8]。但胡新欣[9]等研究發(fā)現(xiàn)亞砷酸鈉濃度在0.001~10.000 μmol/L時可明顯增強HaCaT細(xì)胞增殖力。這與本研究結(jié)論稍有出入，可能與亞砷酸鈉作用時間不同有關(guān)。

角蛋白是表皮的主要結(jié)構(gòu)蛋白并顯示非常具體的上皮細(xì)胞類型和分化階段，對于維護(hù)上皮細(xì)胞的形態(tài)完整性及功能穩(wěn)定性發(fā)揮著重要作用[10]。在本研究中K1與K10的表達(dá)與對照組相比升高，這與多數(shù)研究結(jié)果一致：如Sun等[11]觀察到0.10 μmol/L NaAsO2處理20周的HaCaT細(xì)胞中K10與K1表達(dá)上調(diào)：韓冰等[12]和謝汝佳等[13]研究發(fā)現(xiàn)，燃煤污染型砷中毒患者血清角蛋白1和角蛋白10表達(dá)水平較對照組顯著上調(diào)。另外，K1是K10的合作伙伴，其參與到皮膚角化的過程中，是中間絲形成的重要成分，因此被認(rèn)為是皮膚正常開始角化的標(biāo)志。在本研究中K1與K10的表達(dá)上調(diào)并呈正相關(guān)(P<0.05)，這與二者特異性協(xié)同表達(dá)是一致的，表明K1與K10在砷致細(xì)胞角化中有同時異常表達(dá)，也提示K1與K10的表達(dá)升高可能與HaCaT細(xì)胞過度增殖有一定關(guān)聯(lián)。

目前一些研究認(rèn)為角質(zhì)形成細(xì)胞分化的改變繼發(fā)于表皮的過度增殖。角蛋白隨上皮終末分化的過程而改變，其過表達(dá)已被證實是角質(zhì)細(xì)胞過度增殖和過度角化的標(biāo)志。有研究發(fā)現(xiàn)K1的過表達(dá)是角質(zhì)細(xì)胞過度增殖的標(biāo)志，K10的過表達(dá)往往表明有上皮的過度分化和角化[14-15]。本研究顯示，K1、K10角蛋白表達(dá)升高，HaCaT細(xì)胞分化異常，同時HaCaT細(xì)胞增殖率也升高，提示HaCaT細(xì)胞的過度增殖、細(xì)胞分化改變和角蛋白表達(dá)上調(diào)這三者之間可能有聯(lián)系。隨染毒濃度的上升和染毒時間達(dá)到72 h，細(xì)胞增殖率下降，K1、K10的表達(dá)下降，說明一定濃度范圍內(nèi)的亞砷酸鈉可以刺激細(xì)胞生長，促進(jìn)皮膚細(xì)胞增殖，但超過一定劑量就會抑制細(xì)胞增殖。綜上所述，由于目前角蛋白在染砷后角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)情況的相關(guān)性研究還比較少，本研究只是作了初步探討，其具體作用還需要通過更系統(tǒng)更深入的研究來證明，期待以后角蛋白在皮膚角化中的作用研究有更大進(jìn)展。

參考文獻(xiàn):

[1]馬恒之, 王風(fēng)歧, 郭小娟,等. 內(nèi)蒙古自治區(qū)地方性砷中毒臨床調(diào)查[J].內(nèi)蒙古地方病防治研究, 1994, 19(增刊)：82-85.

[2]Ramms L, Fabris G, Windoffer R,et al.Keratins as the main component for the mechanical integrity of keratinocytes[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2013,110(46):18513-18518.

[3]Bragulla HH，Homberger DG．Structure and functions of keratin pmteinsin simple，stratified，keratinized and cornified epithelia[J]．J Anat，2009，214(4)：516-559．

[4]郝小軍, 高順強, 李真,等. 角蛋白17、 19在銀屑病皮損中的表達(dá)及意義[J]. 中國醫(yī)師進(jìn)修雜志, 2011, 34(36):20-22.

[5]Pachauri V, Srivastava P, Yadav A, et al. MiADMSA protects arsenic-induced oxidative stress in human keratinocyte HaCaT cells[J]. Biol Trace Elem Res, 2013, 153(1-3):396-402.

[6]許熙國. 氧化應(yīng)激在亞砷酸鈉誘導(dǎo)人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT)適應(yīng)性反應(yīng)中的意義[D]. 蘇州大學(xué), 2014.

[7]吳順華, 劉開泰, 楊曉燕, 等. 亞砷酸鈉對人皮膚細(xì)胞增殖作用的影響[J]. 新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2003, 26(1):6-8.

[8]孫鮮策, 孫貴范, 王路, 等. 亞砷酸鈉對角質(zhì)形成細(xì)胞增殖力和周期的影響[J]. 中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志, 2004, 22(3):219-220.

[9]胡新欣, 高彥輝, 張微, 等. 亞砷酸鈉對人皮膚永生化角質(zhì)形成細(xì)胞角化相關(guān)基因和核轉(zhuǎn)錄因子紅系相關(guān)因子2mRNA表達(dá)的影響[J]. 中國地方病學(xué)雜志, 2012,31(4):365-368.

[10]Farooq SH, Chandrasekharam D, Norra S, et al. Temporal variations in arsenic concentration in the groundwater of Murshidabad District, West Bengal, India?[J]. Environmental Earth Sciences, 2011,62(2):223-232.

[11]Sun Y, Pi J, Wang X, et al. Aberrant cytokeratin expression during arsenic-induc-ed acquired malignant phenotype in human HaCaT keratinocytes consistent with epidermal carcinogenesis?[J]. Toxicology, 2009,262(2):162-170.

[12]韓冰, 楊勤, 羅新華, 等. 燃煤污染型砷中毒患者血清差異蛋白的篩選[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2009,89(21):1450-1454.

[13]謝汝佳, 韓冰, 羅新華, 等. 燃煤污染型砷中毒肝損傷患者血清差異蛋白的篩選[J]. 中國地方病學(xué)雜志, 2010,29(6):604-607.

[14]胡新欣.角蛋白1轉(zhuǎn)運髓過氧化物酶在砷致皮膚損傷中的作用[D]. 哈爾濱：哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，2012.

[15]Bloor BK, Seddon SU. Morgan PR. Gene expression of differentiation-specific keratins (k4、K13、K1 and K10) in oral nondysplastic keuratoses and lichen planus[J]. Oral Pathol Med,2000, 29(8):376-384．

(本文編輯張巧蓮)

Effects of sodium arsenite on skinkeratinocytes related gene expression

LI Yu, WU Jun, CHEN Roujin, LIU Yuan, GE Long, LONG Man

(DepartmentofEnvironmentalHealth,CollegeofPublicHedlth,XinjiangMedicineUniversity,

Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of sodium arsenite on skin cell keratinocytes related gene expression and provide the basis for further elaboration for arsenic-caused skin keratinization mechanism. MethodsThe HaCaT cells were exposed to 0.00， 1.30， 3.25， 6.25 μmol/L sodium arsenite for 24 h, 48 h, 72 h, respectively. Then, cells growth status were measured with MTT colorimetric assay. Expression levels of K1 and K10 mRNA are detected from HaCaT cells by real-time fluorescence quantitative (Real-Time Quantitative PCR). Results(1) 1.30 μmol/L sodium arsenite can promote HaCaT cell proliferation. 3.25 μmol/L, 6.50 μmol/L sodium arsenite inhibited the growth of HaCaT cells after 48 h, and the difference was statistically significant (P<0.05) compared with the control group. (2) In 1.30 μmol/L sodium arsenite exposure group, HaCaT cells promoted K1 and K10 mRNA upregulation of expression after 24 h. 3.25 μmol/L, 6.50 μmol/L exposure of sodium arsenite in HaCaT cells, K1, K10 mRNA expression downregulated after 72h and the difference was statistically significant (P<0.05). ConclusionConcentration of sodium arsenite <1.30 μmol/L on human skin cells promoted proliferation significantly and promoted skin keratinization process. The upregulation of K1, K10 in skin cell proliferation and cornification process played a role.

Keywords:sodium arsenite； HaCaT cells； K1； K10

[收稿日期：2015-10-30]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.02.009

中圖分類號：R34

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1009-5551(2016)02-0164-05

作者簡介：李煜(1989-)，女，在讀碩士,研究方向：砷中毒與皮膚損傷。通信作者：吳軍，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：砷中毒與皮膚損傷，E-mail: wuj1997@sohu.com。

基金項目：國家自然科學(xué)基金(81560513)； 國家自然科學(xué)基金(81260410)； 教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點基金(20126517110002； 20126517120003)