新疆酸石榴皮提取物的體外抑菌實驗研究

田玉娥， 劉江杰， 王東東, 田　莉

(1武警兵團指揮部醫(yī)院，烏魯木齊　830063； 2新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院； 3新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)重點實驗室，烏魯木齊　830011)

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新疆酸石榴皮提取物的體外抑菌實驗研究

田玉娥1， 劉江杰1， 王東東2,3, 田莉2,3

(1武警兵團指揮部醫(yī)院，烏魯木齊830063；2新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院；3新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)重點實驗室，烏魯木齊830011)

摘要：目的研究石榴皮不同極性提取物的體外抑菌活性，尋找抗菌活性成分。方法采用微孔板法和稀釋法研究石榴皮不同極性提取物對變異鏈球菌和大腸桿菌生長及其生物膜形成的影響。結(jié)果石榴皮的不同極性提取物對變異鏈球菌和大腸桿菌的生長無明顯抑制作用，而對其生物膜形成有明顯抑制作用，石榴皮正丁醇、乙醇和水提取物對變異鏈球菌生物膜形成有明顯抑制作用，氯仿、乙酸乙酯和正丁醇提取物對大腸桿菌生物膜的形成有不同程度的抑制作用。結(jié)論石榴皮提取物對變異鏈球菌生長和大腸桿菌生物膜形成具有較好的抑制作用，值得進一步研究開發(fā)。

關(guān)鍵詞:石榴皮；提取物；體外抗菌活性；生物膜；稀釋法

石榴皮為石榴科(Punicaceceae)植物石榴(Punica granatum L.)的干燥果皮。該藥材收載于《中國藥典》和《維吾爾藥志》，具收具有澀腸、止血、殺蟲功效，用于治療各類痢疾、小兒消化不良、燒傷、炎癥等療效顯著[1-2]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，石榴皮具有抗菌、抗病毒、抗癌、降糖、免疫調(diào)節(jié)、改善心血管系統(tǒng)等作用[3]。新疆石榴品種好，栽培面積廣，資源豐富，利用石榴自然脫落的花瓣進行藥學(xué)研究，極具實用價值。本研究采用微孔板法和稀釋法進行石榴皮不同極性部位提取物體外抗菌實驗的初步研究，為石榴皮有效成分的成藥性研究提供實驗依據(jù)。

1儀器與材料

SPECTRAMAX 190酶標(biāo)儀(美國Molecu1ar Devices公司)，YJ-875A醫(yī)用凈化工作臺(蘇州金燕凈化設(shè)備廠)，DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)， 3110系列CO2培養(yǎng)箱(Thermo Scientific Water Jacketed Incubator，USA)，YXQ-LS-SI全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實業(yè)醫(yī)療設(shè)備廠)，XS105型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。石榴皮(Flos granati)購于新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)院，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院烏莉婭·沙衣提教授鑒定為石榴(Punica granatum L.)的干燥果皮。變異鏈球菌(ATCC 700610)、大腸桿菌(ATCC 35218)均購自中國藥品生物制品檢定所，BHI培養(yǎng)基(Brain Heart Infusion Broth，Dickinson and company，USA)，NB培養(yǎng)基(Nutrient Broth，Dickinson and company，USA)，結(jié)晶紫(上海研晶生物科技有限公司，CAS548-62-9)，去氧膽酸鈉(Sodium deoxycholate，SD ，Sigma-Aldrich公司)，所用試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1石榴皮提取物的制備精密稱取石榴皮粗粉200 g，用石油醚1.5 L回流提取1.5 h后，濾過，濾渣依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和水1.5 L回流提取2 h后濾過，均重復(fù)提取3次，濾液分別置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮減壓后得稠浸膏，再經(jīng)冷凍干燥成粉末，均密封冷藏備用。

2.2石榴皮提取物化學(xué)成分鑒別分別取石榴皮不同極性提取物適量，加入蒸餾水溶解，采用試管法進行化學(xué)成分的理化鑒別。結(jié)果石榴皮不同極性提取物中含有糖、苷類、酚類鞣質(zhì)、黃酮類、有機酸、氨基酸和蛋白質(zhì)等成分，見表1。

2.3抑菌實驗

2.3.1菌種復(fù)蘇與培養(yǎng)將變異鏈球菌(ATCC 25923)、大腸桿菌(ATCC 25922)標(biāo)準(zhǔn)菌種置于裝有2 mL培養(yǎng)基的有蓋試管中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16 h后，經(jīng)比濁法判斷試管變渾濁，表明菌種已復(fù)蘇。把滅菌培養(yǎng)皿和培養(yǎng)基倒平板，冷卻凝固后，用接種針挑取少許復(fù)蘇后的標(biāo)準(zhǔn)菌種劃線接種，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進行活化，使菌種有較強的活力。經(jīng)復(fù)蘇轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后，取新傳代大腸桿菌、變異鏈球菌置于已滅菌的裝有2 mL培養(yǎng)基的有蓋試管中，加入適量40%葡萄糖，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)液用肉湯培養(yǎng)基稀釋，充分震蕩后并用麥?zhǔn)媳葷峁芊ㄕ{(diào)整菌液濃度為109CFU/mL。

表1　石榴皮化學(xué)成分鑒別

2.3.2微孔板法篩選抑菌活性采用96孔微孔板進行抑菌活性的快速篩選[4]。分別取變異鏈球菌、大腸桿菌懸液用培養(yǎng)液50倍稀釋，混勻。把石榴皮不同極性提取物分別溶解在適宜溶劑中制成2 000 μg/mL的溶液，經(jīng)微孔濾膜除菌后，在96孔板上用肉湯培養(yǎng)基與大腸桿菌、變異鏈球菌作連續(xù)對倍稀釋，使含藥濃度分別為1 000、500、250、125、62.5 μg/mL。相同條件下，以純二甲亞砜作為溶劑對照，僅含菌液作為空白對照，以阿莫西林作為陽性對照，同一板重復(fù)3次，共置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18 h，以培養(yǎng)液透明為無菌生長的最低抑菌濃度(MIC值)。

2.3.3抑菌效果的測定用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定細(xì)菌的OD(Optical Density)值，將96孔板用蒸餾水清洗數(shù)遍，再用1%結(jié)晶紫染色15 min，用蒸餾水沖洗至透明后，加入2%的SD洗脫生物膜，再用酶標(biāo)儀于605 nm波長處測試生物膜的OD值。

抑菌率的計算方法：抑菌率(%)=(溶劑OD值-樣品OD值)/溶劑OD值。

2.3.4石榴皮不同極性提取物對變異鏈球菌的抑菌率石榴皮不同極性提取部位對變異鏈球菌的生長無明顯抑制作用；正丁醇、乙醇和水提取物對變異鏈球菌生物膜形成有明顯抑制作用，正丁醇、乙醇提取物濃度為250 μg/mL時，抑制率>50%，見表1、2。

表1石榴皮不同極性提取部位抑制變異鏈球菌生長的抑制率/%

稀釋度濃度/(μg/mL)氯仿乙酸乙酯正丁醇乙醇水1∶21000-122.21-17.97-15.97-35.70-117.791∶4500-25.19-7.52-9.30-14.79-50.581∶8250-13.418.6941.49-4.41-33.111∶16125-5.384.9138.87-6.93-10.121∶3262.5-4.331.7220.290.46-2.43

表2石榴皮不同極性提取部位抑制變異鏈球菌生物膜形成的抑制率/%

稀釋度濃度/(μg/mL)氯仿乙酸乙酯正丁醇乙醇水1∶21000-119.0138.7564.5553.3448.021∶4500-27.4431.7652.5854.5941.731∶825021.468.4251.0749.5741.041∶1612515.44-76.6246.3119.186.171∶3262.52.44-85.6514.65-44.02-72.60

2.3.5石榴皮不同極性提取物對大腸桿菌的抑菌率石榴皮不同極性提取部位對大腸桿菌的生長無抑制作用；氯仿、乙酸乙酯提取物對大腸桿菌生物膜的形成有不同程度的抑制作用，其中氯仿提取物濃度為250~500 μg/mL時，抑制率>50%，見表3、4。

2.3.6石榴皮不同極性提取物對受試菌的MIC依據(jù)MIC的判斷標(biāo)準(zhǔn)，確定石榴皮正丁醇提取物抑制變異鏈球菌生長的MIC為125 μg/mL，乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、水提取物抑制變異鏈球菌生物膜形成的MIC分別為500、125μ、250、250 μg/mL。石榴皮氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物抑制大腸桿菌生物膜形成的MIC分別為250、500、125 μg/mL。

表3石榴皮不同極性提取部位抑制大腸桿菌生長的抑制率/%

稀釋度濃度/(μg/mL)氯仿乙酸乙酯正丁醇乙醇水1∶21000-70.21-82.91-220.91-269.15-196.371∶4500-79.71-162.52-163.24-281.54-202.251∶8250-76.12-102.41-53.52-161.43-229.631∶16125-35.53-79.24-60.97-95.71-107.441∶3262.5-60.01-57.55-63.15-72.58-62.96

表4石榴皮不同極性提取部位抑制大腸桿菌生物膜形成的抑制率/%

稀釋度濃度/(μg/mL)氯仿乙酸乙酯正丁醇乙醇水1∶21000-2.9746.05-39.21-44.37-33.361∶450074.8336.87-26.89-42.64-25.811∶825069.7028.5134.44-7.0315.481∶161253.5910.1129.1217.5716.731∶3262.55.3719.8117.7830.5115.19

3討論

細(xì)菌生物膜(Biofilm)是細(xì)菌被包裹在自身分泌的多聚物中形成具高度分化結(jié)構(gòu)的特殊細(xì)胞群體結(jié)構(gòu)，是細(xì)菌的一種保護性生長模式，80%的細(xì)菌性感染與其有關(guān)[5]，主要有由革蘭陽性球菌導(dǎo)致的齲齒、革蘭陰性厭氧性口腔細(xì)菌導(dǎo)致的牙菌斑、腸道細(xì)菌引起的膽囊感染及大腸桿菌和其他革蘭陰性菌引起細(xì)菌性前列腺炎等[6]。本研究依據(jù)石榴皮對口腔和消化道的抗菌消炎功效選取口腔主要的致齲菌變異鏈球菌和腸道細(xì)菌大腸桿菌，考察石榴皮不同極性部位對供試菌的抑菌作用，為其成藥性研究提供藥效依據(jù)。

本研究經(jīng)化學(xué)鑒別預(yù)試驗檢出石榴皮中含糖、苷類、酚類鞣質(zhì)、黃酮類、有機酸、氨基酸和蛋白質(zhì)等成分。石榴皮不同極性提取物進行抑菌篩選時，發(fā)現(xiàn)有些提取物有促進細(xì)菌生長的趨勢，可能其所含糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸等成分為細(xì)菌生長提供了營養(yǎng)成分。石榴皮的不同極性提取物對變異鏈球菌和大腸桿菌的生長均無明顯抑制作用，而對二者生物膜的形成均有不同程度的抑制作用，石榴皮正丁醇、乙醇和水提取物對變異鏈球菌生物膜形成有明顯抑制作用，氯仿、乙酸乙酯和正丁醇提取物對大腸桿菌生物膜的形成有明顯的抑制作用。石榴皮中含有能有效抑制供試菌生物膜形成的活性成分，石榴皮的酚類和黃酮類成分具有明顯的抗菌活性[7]。陳雪珊等[8]研究表明，以石榴皮的提取液、濃縮液、 凍干粉

和軟膏對變異鏈球菌和大腸桿菌乙醇有明顯的抑菌作用，但未確定有效成分類別。因此，對其抑菌成分、機理以及對其他細(xì)菌的影響還有待于更進一步的研究。

參考文獻:

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[4]田莉,暢靜,田樹革.維藥材歐綿馬提取物的體外抑菌實驗研究[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2014,37(9):1108-1110.

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[8]陳雪珊,高曉黎.石榴皮提取液、濃縮液、冷干粉末及石榴皮軟膏的體外抑菌試驗[J]. 新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2009,32(5)：565-567.

(本文編輯施洋)

Study on the antibacterial test of pomegranate peel extracts in vitro

TIAN Yue1，LIU Jiangjie1， WANG Dongdong2,3, TIAN Li2,3

(1HospitaloftheArmedPoliceCorpsHedquarter,Urumqi830063,China；2CollegeofTCM,

XinjiangMedicalUniversity；3XinjiangKeyLaboratoryofFamousPrescriptionand

ScienceofFormula,Urumqi830011,China)

Abstract：ObjectiveTo study the antibacterial activities of the different solvent extracts from pomegranate peel and find antibacterial active components. MethodsMicrowell plate method and double dilution method were used to determine the influence of growth and biofilm formation about the different solvent extracts of pomegranate peel against streptococcus mutans and Escherichia col. ResultsThe extracts with different solvnts of pomegranate peel have no inhibition on the growth of stretopcoccus mutans and Escherichia col, ,but have obvious inhibitory effect on biofilm formation. .N-butanol extract, ethanol extract and water extract of pomegranate peel showed the obvious antibacterial activity on the biofilm formation of stretopcoccus mutans. Chloroform extract, ethyl acetate extract and n-butanol extract showed the different levels of antibacterial activity on the biofilm formation of Escherichia col. ConclusionThe extracts of pomegranate peel have obvious antibacterial activity on the growth of streptococcus mutans and biofilm formation of Escherichia col. which is worth researching and developing..

Keywords:pomegranate peel；extracts；antibacterial test in vitro；biofilm；dilution method

[收稿日期：2015-10-23]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.02.004

中圖分類號：R963

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1009-5551(2016)02-0142-04

作者簡介：田玉娥(1973-),女，本科，主治醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合皮膚病研究。通信作者：田莉，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥民族藥新制劑研究與開發(fā)，E-mail：tianli109@126.com。

基金項目：國家自然科學(xué)基金(81260668)；新疆醫(yī)科大學(xué)“ 天山英才工程” 專項基金(Y0382002)