回補維生素E對維生素E缺乏不孕大鼠妊娠結(jié)局的影響

郎楠，賀斌，王麗麗，王介東*

(1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京　100730；2. 國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京　100081)

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回補維生素E對維生素E缺乏不孕大鼠妊娠結(jié)局的影響

郎楠1，2，賀斌2，王麗麗1，2，王介東1，2*

(1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京100730；2. 國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京100081)

【摘要】目的研究在植入過程回補維生素E對維生素E缺乏不孕(VED)大鼠妊娠結(jié)局的影響。方法從出生后11 d開始喂養(yǎng)維生素E缺乏的食物，喂養(yǎng)6個月后建立VED大鼠模型。在模型大鼠交配后5.5 d、6.5 d、7.5 d分別灌胃500 mg/kg的維生素E回補，以非VED大鼠為對照組，在回補0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h和24 h觀察維生素E的濃度變化，并于交配后19.5 d統(tǒng)計大鼠子宮的著床點個數(shù)、活胎個數(shù)和胎鼠體重變化。結(jié)果VED大鼠在回補4 h后血漿中維生素E的濃度為13.54±3.81 μg/ml，達到正常水平；分別在交配后5.5 d、6.5 d、7.5 d 回補維生素E的VED大鼠妊娠率分別為80%、60%、40%(對照組均為100%)，著床點個數(shù)分別為9.3±1.1、8.5±0.5和8.4±1.4(對照組為12.7±0.5、13.0±2.2和12.7±1.2)，活胎個數(shù)分別為5.0±2.0、4.0±2.3和2.0±2.4(對照組為12.3±0.5、12.7±2.4和11.3±1.7)，均顯著低于對照組(P<0.05)；交配后5.5 d回補組胎鼠體重與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，交配后6.5 d和7.5 d回補組胎鼠體重顯著低于對照組(分別為1.74±0.55 g和1.63±0.68 g vs. 2.16±0.18 g和2.19±0.21 g)(P<0.01)。結(jié)論在植入過程回補維生素E可部分挽救由于維生素E缺乏所導(dǎo)致的不孕;隨著回補時間的延后，回補維生素E對妊娠結(jié)局挽救的效果明顯下降。

【關(guān)鍵詞】維生素E；妊娠結(jié)局；植入

(JReprodMed2016，25(1)：61-66)

Evans等[1]在上世紀(jì)20年代發(fā)現(xiàn)缺乏維生素E可以導(dǎo)致大鼠不孕。維生素E是一類妊娠過程不可或缺的營養(yǎng)元素，缺乏維生素E會引起早產(chǎn)、流產(chǎn)、先兆子癇和胎兒子宮內(nèi)生長受限[2-4]。維生素E在體內(nèi)的減少是一個非常緩慢的過程，建立維生素E缺乏的動物模型需要很長的時間[5]。研究維生素E最常用的動物是大鼠。維生素E缺乏導(dǎo)致不孕的雌性大鼠卵巢和排卵過程沒有受到影響，但在妊娠過程中出現(xiàn)吸收胎；而雄性大鼠的精子發(fā)生過程異常，導(dǎo)致精子減少或無精[6]。維生素E的研究一直主要圍繞生殖過程，但維生素E在妊娠過程中的作用階段及相關(guān)分子機制還不清楚，需要進一步研究探討。本研究以維生素E缺乏的不孕大鼠為研究對象，探究植入過程中回補維生素E對其妊娠結(jié)局的影響。

材料與方法

一、材料

1. 實驗動物：SPF級Wista幼鼠鼠齡為出生后10 d，共10窩，每窩10只；SPF級Wista雄鼠9～10周齡，共20只，購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。光周期調(diào)控：06：00～18：00光照，18：00～06：00黑暗，恒溫(21±1)℃、恒濕(55%±5%)條件下飼養(yǎng)，自由取食飲水。

2. 飼料配制及維生素E檢測：飼料委托北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司加工合成，經(jīng)第三方檢測機構(gòu)北京譜尼測試科技有限公司測試，正常飼料中維生素E含量是154 mg/kg，維生素E缺乏飼料中維生素E的含量<0.5 mg/kg。

正常飼料配方(%)：酪蛋白20，蛋氨酸0.3，葡萄糖67.5，豬油5(Corn Oil，tocopherol-stripped替代)，纖維素3，礦物鹽3.5，碳酸鈣0.35，復(fù)合維生素0.35。

維生素E缺乏飼料配方(%)：酪蛋白20，蛋氨酸0.3，葡萄糖67.5，豬油5(Corn Oil，tocopherol-stripped替代)，纖維素3，礦物鹽3.5，碳酸鈣0.35，復(fù)合維生素(缺維生素E)0.35[7]。

(天然型)維生素E軟膠囊(100 mg/粒，浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠)。

維生素E檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)

二、方法

1. 建立維生素E缺乏大鼠不孕模型：仔鼠出生后第11天開始給母鼠分別喂養(yǎng)正常飼料(對照組)和維生素E缺乏飼料(VED飼料組)，并對仔鼠進行稱重，每周稱重一次；第21天離乳后，兩組中的雌性仔鼠繼續(xù)喂養(yǎng)相應(yīng)的正常飼料和維生素E缺乏飼料，觀察生長過程中體重的變化；喂養(yǎng)24周后，兩組雌鼠與正常的雄鼠進行第一輪交配。在16：00將雌鼠和雄鼠放在交配籠里，次日8：00在交配籠下的托盤中看到陰栓，為交配成功，記為0.5 d。其中，交配成功沒有產(chǎn)下仔鼠的VED飼料組雌鼠定義為維生素E缺乏不孕大鼠(VED組)。

2. 維生素E回補實驗：對照組和VED組大鼠分別進行第二輪交配。在16：00將雌鼠和正常雄鼠放入交配籠中，次日8：00見陰栓為交配成功，記為0.5 d，進行以下處理：(1)對照組和VED不孕組孕鼠各隨機留取15只，分別在5.5 d、6.5 d和7.5 d(5只/d)處死，收集子宮角，計數(shù)著床點數(shù)目；(2)余下的VED不孕組孕鼠分別在5.5 d、6.5 d和7.5 d補充維生素E(500 mg/kg，灌胃)，每個時間點5只，稱為VED-E組；對照組孕鼠同期以1 ml無菌玉米油灌胃，稱為C-C組。灌胃時記為0小時(0 h)，在0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h和24 h尾靜脈取血，EDTA抗凝保存；在19.5 d處死孕鼠，收集孕鼠子宮角，計數(shù)子宮著床點(含吸收胎)和活胎數(shù)量，記錄胎鼠體重。

3. 血漿中維生素E的測定：靜脈血抗凝混勻放置后，3 500 r/min離心10 min，放入-70℃保存。使用維生素E檢測試劑盒進行維生素E濃度的測定。采用分光光度法，以聯(lián)苯菲啰啉為顯色劑，在波長533 nm處測定吸光度，濃度以μg/ml表示[8]。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果采用SPSS 20.0軟件進行分析。數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±SD表示，采用單因素方差分析，計量資料使用t檢驗，計數(shù)資料使用χ2檢驗；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、建立維生素E缺乏大鼠不孕模型

VED飼料組在喂養(yǎng)一周后，仔鼠體重比對照組少6.5 g，體重的差距隨著喂養(yǎng)時間的延長逐漸拉大，至18周VED飼料組仔鼠體重逐漸接近對照組仔鼠，喂養(yǎng)21周后兩組大鼠體重在240 g左右，無明顯差異(P>0.05)。

喂養(yǎng)24周后進行第一輪交配，觀察大鼠的妊娠情況。對照組產(chǎn)仔數(shù)為10.62±1.8只/窩；VED飼料組雌鼠見栓33只，僅有3只孕鼠產(chǎn)仔(窩仔數(shù)分別是3只、9只和10只，未納入第2輪交配)，余下的30只見栓雌鼠均未見有產(chǎn)仔，即為維生素E缺乏不孕大鼠(VED組)。

二、回補維生素E對血漿維生素濃度的影響

C-C組維生素E濃度維持在11.77～13.54 μg/ml；VED-E組在回補維生素E 4 h后，維生素E濃度迅速由0.09±0.18 μg/ml升高至13.54±3.81 μg/ml，12 h時達到高峰，顯著高于C-C組(P<0.05)，24 h時回落至15.69±2.53 μg/ml，與C-C組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。顯示500 mg/kg的維生素E回補劑量可以達到正常生理水平(表1、圖1)。

三、回補維生素E對妊娠結(jié)局的影響

交配后5.5 d、6.5 d和7.5 d時子宮著床點檢查顯示，對照組(C組)的著床點分別為12.7±0.5、13.0±2.2、12.7±1.2，VED組的著床點個數(shù)分別為9.2±1.1、8.8±0.8、8.7±1.3，均顯著低于對照組(P<0.05)(圖2)，提示維生素E缺乏可影響胚胎著床。

表1回補維生素E后不同時間點血漿中維生素E的濃度變化(x-±s，μg/ml)

組 別回補維生素E后的時間(h)04812162024C-C12.31±2.1813.54±1.9112.31±2.0813.00±1.7011.77±1.5112.77±1.4611.85±1.75VED-E0.09±0.1813.54±3.8118.12±0.35*21.31±1.51*19.46±1.32*17.08±1.80*15.69±2.53

注：與C-C組比較，*P<0.05

與C-C組比較，*P<0.05圖1　回補維生素E后24 h內(nèi)血漿維生素E的濃度

與對照組(C組)比較，*P<0.05圖2　未回補維生素E的VED大鼠著床點數(shù)

回補維生素E后19.5 d時，在3個回補時間組(5.5 d、6.5 d和7.5 d)，C-C組的妊娠率均為100%，而VED-E組妊娠率分別為80%，60%和40%；C-C組的著床點分別為12.9±0.8、12.6±1.2、13±1.5，VED-E組著床點(含吸收胎)個數(shù)分別為9.3±1.1、8.5±0.5、8.4±1. 4，仍顯著低于C-C組(P<0.05)(圖3)，但與未回補維生素E的VED組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。提示在5.5～7.5 d回補維生素E不能有效改善胚胎著床。

VED-E組不同回補時間亞組的活胎數(shù)分別為5.0±2.0、4.0±2.3、2.0±2.4，顯著低于C-C組(分別為12.3±0.5、12.7±2.4、11.3±1.7)(P<0.05)(圖4)。提示5.5～7.5 d回補維生素E可部分挽救胚胎發(fā)育；6.5 d和7.5 d回補維生素E后的VED-E組胎鼠體重與C-C組相比明顯減輕(1.74±0.55 g、1.63±0.68 g vs. 2.16±0.18 g、2.19±0.21 g)(P<0.01)，且6.5 d和7.5 d時回補維生素E比5.5 d回補維生素E的胎鼠體重顯著下降(P<0.01)(圖5)。同時，VED-E組在不同時間點回補維生素E的妊娠率、活胎數(shù)量的結(jié)果也提示，隨著回補時間的延后，其補救效果逐漸減弱。

討論

維生素E是一類脂溶性的營養(yǎng)元素，參與整個生殖過程，尤其是早期妊娠過程[9]。維生素E和其它維生素不同，至今尚未發(fā)現(xiàn)維生素E的受體，維生素E如何進入細胞以及通過什么途徑起作用無從下手研究[10]。有研究發(fā)現(xiàn)維生素E降低卵泡內(nèi)的氧化壓與維持胚胎正常生長、胎盤形成/建立以及胎盤血管新生過程密切相關(guān)，但其作用機制尚不清楚[11-13]。

與C-C組比較，*P<0.05圖3　不同時間回補維生素E后孕19.5 d時大鼠著床點數(shù)

與C-C組比較，*P<0.01圖4　不同時間回補維生素E后孕19.5 d時活胎數(shù)量

與C-C組比較，*P<0.01；與5.5 d比較，# P<0.01圖5　不同時間回補維生素E后孕19.5 d時胎鼠體重

維生素E不能在人體中合成，主要通過外源性補充。通過膽汁和胰液作用，維生素E嵌合到微膠粒中，經(jīng)非飽和的被動擴散方式被腸上皮細胞吸收[14]。大多數(shù)乳糜微滴通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被肝臟吸收。在肝細胞中維生素E結(jié)合到α-tocopherol transfer protein(α-TTP，一種維生素E的轉(zhuǎn)移蛋白)上，α-TTP介導(dǎo)維生素E轉(zhuǎn)移到極低密度脂蛋白上，從而使維生素E進入血液循環(huán)[14]。不能被吸收的維生素E通過膽汁排出體外或通過細胞色素P450介導(dǎo)的ω-氧化途徑形成α-2-(2-羧乙基)羥基苯并二氫吡喃(α-CEHC)，α-CEHC通過尿液排出體外[14]。維生素C-維生素E循環(huán)通過氧化還原作用重新合成維生素E，導(dǎo)致維生素E在體內(nèi)的消耗是一個非常緩慢的過程。因此本研究從11天齡的仔鼠開始缺乏維生素E，妊娠試驗驗證并建立了維生素E缺乏大鼠的不孕模型。人類口服維生素E會導(dǎo)致血漿中維生素E濃度差異性地增加，而這種個體差異是由維生素E的活性、代謝速率、脂質(zhì)的成分和含量、循環(huán)的維生素E的狀態(tài)和體內(nèi)環(huán)境條件引起的[15]。本實驗中回補維生素E后大鼠血漿中維生素E的濃度顯著性增加，標(biāo)準(zhǔn)差適中，沒有發(fā)現(xiàn)維生素E濃度的個體差異變化。本研究一次性給予VED組大鼠200 mg維生素E，回補4 h即顯著提高血漿維生素E濃度，12 h達到高峰并開始回落，24 h時與對照組沒有統(tǒng)計學(xué)差異，表明外源性維生素E能快速有效補充體內(nèi)維生素E。給維生素E缺乏大鼠回補200 mg維生素E，換算到人體中是800 mg，即1 200 IU，而≤1 600 IU的維生素E對于人體內(nèi)正常氧化壓是安全的[16-17]。因此，我們回補的維生素E對于大鼠來說是安全有效的。

維生素E缺乏不孕模型大鼠(VED組)和模型大鼠回補維生素E(VED-E組)的著床點個數(shù)比對照組少(P<0.05)，這說明長期維生素E的缺乏影響大鼠的著床，可能是因為維生素E影響卵或子宮肌層的運動，卵到子宮植入部位的運動不均衡導(dǎo)致著床點個數(shù)的減少[18]。大鼠的植入時間是在交配后5.5～6.0 d，而回補維生素E的時間是交配后5.5 d、6.5 d和7.5 d，此時子宮已經(jīng)為植入做好了準(zhǔn)備，因此VED組和VED-E組著床點個數(shù)上沒有統(tǒng)計學(xué)差異。維生素E缺乏雖然影響大鼠的著床，但是VED組和VED-E組還是有大約9個的著床點，提示維生素E對著床點的影響不是維生素E缺乏導(dǎo)致大鼠不孕的主要原因。

本研究發(fā)現(xiàn)，回補維生素E后VED-E組的妊娠率、活胎數(shù)有所恢復(fù)，但顯著低于只灌注溶劑的正常對照組(C-C組)，且隨著回補時間的延后，其補救效果逐漸減弱，說明交配后5.5～7.5 d回補維生素E只能部分挽救不孕，提示維生素E缺乏對胚胎生長發(fā)育過程具有重要影響。Evans等[6]研究結(jié)果顯示，斷奶后開始持續(xù)缺乏維生素E的成年不孕大鼠，在交配后5 d或6 d回補胚芽油(富含維生素E)可以產(chǎn)下活的仔鼠，也支持這一結(jié)果。α-TTP敲除后小鼠不孕提示維生素E對胎盤形成是必需的，影響胎盤的迷路區(qū)域[19]。胎盤形成過程中，快速的代謝要求組織具有強抗活性氧(ROS)能力，維生素E是主要的抗氧化劑之一，可能通過抵抗ROS而在維持胎盤的正常功能中發(fā)揮重要作用。但是α-TTP基因敲除小鼠補充α-生育酚能夠完全挽救妊娠結(jié)局[19]，與本研究中回補維生素E后可以部分挽救妊娠結(jié)局并不完全一致。有研究顯示大鼠喂食維生素E缺乏飼料12周，可導(dǎo)致肝臟α-TTP蛋白表達顯著降低，但高劑量維生素E并不能促使α-TTP蛋白表達增加[20]，提示維生素E對α-TTP的調(diào)控機制可能是兩者挽救結(jié)果差異的原因之一。有關(guān)維生素E和α-TTP的相互作用仍有待于深入研究。

通過維生素E的回補實驗，我們了解了維生素E影響植入過程并影響胚胎的生長發(fā)育。建議對妊娠早期孕婦可適當(dāng)補充維生素E，以滿足胚胎生長發(fā)育的需要。

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[編輯:羅宏志]

The effect of vitamin E supplement on the pregnancy outcomes of vitamin E-deficiency-associated infertile female rat

LANGNan1，2，HEBin2，WANGLi-li1，2，WANGJie-dong1，2*

1.GraduateSchool，PekingUnionMedicalCollege，Beijing100730

2.NationalResearchInstituteforFamilyPlanning，Beijing100081

【Abstract】

Objectives： To study the effect of vitamin E (VE) supplement during the implantation process on pregnancy outcome of VE deficiency-associated infertile female rat.

Methods： Female rats were on VE-deficient diet to establish the VE deficiency-associated infertility model (VED group). The model rats (VED group) were given VE (500 mg/kg) by intragastric administration on 5.5，6.5 and 7.5 days post-coitum (dpc) respectively，with the non-VED rat (on normal diet) supplemented with vehicle as control. Plasma VE levels were determined at 0 h，4 h，8 h，12 h，16 h，20 h and 24 h after supplement. The pregnancy outcomes were determined on 19.5 dpc，with number of implantation sites，live fetus and weight of fetus examined.

Results： Plasma VE levels in VED group reached the normal levels at 4 h after VE supplement. The pregnancy rates in VED group with VE supplement at 3 diferent time-points (subgroups 5.5，6.5 and 7.5 dpc) were 80%，60% and 40% respectively (100% in control)，the number of implantation sites were 9.3±1.1，8.5±0.5 and 8.4±1.4 respectively (in control，12.7±0.5，13.0±2.2 and 12.7±1.2)，and the number of live fetus were 5.0±2.0，4.0±2.3 and 2.0±2.4 respectively (in control，12.3±0.5，12.7±2.4 and 11.3±1.7). There was a significant difference in all observed parameters between VED group and control group at all subgroups (P<0.05). Compared with that in control group，fetus weight was significantly reduced in VED group with VE supplement at 6.5，7.5 dpc (1.74±0.55 g，1.63±0.68 g vs. 2.16±0.18 g，2.19±0.21 g) (P<0.01)，while no significant difference was found between VED subgroup of 5.5 dpc supplement and normal control(P>0.05).

Conclusion： VE supplement during the implantation process can partially rescue the infertility caused by VE deficiency in rat. The efficacy of rescue was getting lower with the time delayed.

Key words：Vitamin E；Pregnancy outcome；Implantation

【作者簡介】郎楠，女，河南南陽人，博士，細胞生物學(xué).(*通訊作者)

【基金項目】科技部十二五支撐計劃 (No.2012BAI31B06)

【收稿日期】2015-10-15；【修回日期】2015-11-25

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.1.012