高壓氧對腦外傷大鼠腦內興奮性氨基酸水平的影響

賀仕清 鄒云龍 雷北平

·基礎研究·

高壓氧對腦外傷大鼠腦內興奮性氨基酸水平的影響

賀仕清1鄒云龍1雷北平2

目的研究高壓氧對腦外傷大鼠腦內興奮性氨基酸水平的影響。方法通過制作大鼠腦外傷模型，設計隨機實驗分組：模型對照組、高氣壓組、高濃度氧組和高壓氧組給予腦外傷大鼠治療；同時設空白對照組。分別于第3天、第6天、第9天取大鼠全腦測量谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp）的含量。結果大鼠腦損傷后腦組織中Glu、Asp含量明顯升高，高壓氧可明顯下調Glu、Asp含量，與模型對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而高氣壓組、高濃度氧組不能明顯抑制Glu、Asp表達，與模型對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論高壓氧可以顯著抑制腦外傷大鼠腦組織中興奮性氨基酸釋放從而減輕腦外傷后繼發(fā)性腦損害，而高氣壓、高濃度氧不能明顯抑制興奮性氨基酸的釋放。

腦損傷；興奮性氨基酸；高壓氧治療

腦外傷是臨床常見急癥之一。腦外傷后有關腦組織繼發(fā)性損害的機制存在多種學說[1]：其中興奮性氨基酸（excitatory amino acids，EAA）的毒性作用是腦外傷繼發(fā)性腦損傷重要的致傷機制之一[2]；EAA主要是谷氨酸（glutamic acid，Glu）和天冬氨酸（aspartic acid，Asp）。近年來國內外學者對高壓氧（hyperbaric oxygen，HBO）治療腦缺血進行了廣泛的研究，且動物實驗多數顯示HBO有一定療效，但對其作用的機制尚不清楚[3]。本研究探討HBO在治療腦外傷大鼠中對抗興奮性氨基酸的興奮性神經毒性和改善預后方面的作用，為HBO在臨床治療腦外傷的應用提供實驗依據。

材料與方法

一、實驗動物

Wister大鼠98只，體質量280 g左右，SD大鼠購買于武漢大學動物部。隨機設空白對照組動物18只與模型對照組對照。

二、模型動物

用5%水化氯醛腹腔注射麻醉 （300 mg/kg體重），用BIM-Ⅲ型撞擊機撞擊頭部（頭部固定），重量800 g，高度30 cm，制作重型腦外傷動物模型。

三、實驗分組

取存活動物90只，按隨機數字表隨機分組設空白對照組、模型對照組、高氣壓組、高濃度氧組和高壓氧組，每組18只。各組標記。

四、分組處理

高壓氧組大鼠置于高壓氧艙內1次/d，純氧洗艙5 min，升壓10 min至0.1 MPa（2 ATA）后穩(wěn)壓，吸純氧60 min，穩(wěn)壓時保證艙內氧濃度為（85±5）%，減壓10 min出艙，總時間為85 min。高氣壓組大鼠置于高壓氧艙內1次/d，空氣洗艙5 min，氮氣升壓（不改變艙內氧分壓）10 min至0.1 MPa（2 ATA）后空氣穩(wěn)壓60 min，減壓10 min出艙。高濃度氧組大鼠置于高壓氧艙內1次/d，不升壓，純氧洗艙85 min。模型對照組大鼠制作腦外傷模型后不再做處理?？瞻讓φ战M不做處理，與模型對照組對照。

分別于第3天、第6天和第9天在各組中隨機斷頭處死每組6只大鼠，取腦組織稱重后，按20 mg/ml加入5%三氯醋酸，在冰浴下用玻璃組織勻漿機勻漿10 min，在0～4℃下以15 000 r/min離心15 min，去除蛋白，取上清液-20℃保存，待測。

五、高效液相色譜儀檢測興奮性氨基酸含量

40 μl氨基酸樣品加入100 μl氟化乙醛反應液振蕩15 s后25℃放置反應2 min，進樣20 μl，采用線性梯度洗脫，結果用色譜工作站處理 （外標法定量：先將標準品進行色譜分析，求得含量與色譜峰面積或峰高的關系，并將此關系繪制成定量校準曲線，然后將樣品進行色譜分析，根據其對應的峰面積或峰高求出樣品中的組分含量）。

六、統(tǒng)計學分析

結果

一、隨機分組的SD大鼠體重

五組SD大鼠的平均體重進行了單因素方差分析，經統(tǒng)計分析五組大鼠平均體重差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

表1 五組SD大鼠平均體重比較（±s）

表1 五組SD大鼠平均體重比較（±s）

F=2.709，P=0.086

組別 例數 平均體重（g）空白對照組 18 273±4.09模型對照組 18 278±5.16高氣壓組 18 272±5.24高濃度氧組 18 266±4.63高壓氧組 18 270±3.98 F值 2.709 P值 ＞0.05

二、EAA在腦外傷大鼠腦內的表達

本研究用Glu和Asp結果作為興奮性氨基酸的代表。分別于第3天、第6天和第9天時在各組中隨機斷頭處死6只SD大鼠?？瞻讓φ战M、模型對照組、高氣壓組、高濃度氧組和高壓氧組組大鼠腦中EAA含量如表2～4所示。結果顯示：與空白對照組比較（第3天、第6天、第9天），大鼠腦損傷后其腦組織中Glu和Asp含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型對照組比較（第3天、第6天、第9天），經高氣壓、高濃度氧處理后氨基酸含量均有所下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），經高壓氧處理后顯著性下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表2、表3、表4）。

表2 腦外傷SD大鼠第3天腦內谷氨酸和天冬氨酸的含量（μmol/L，±s）

表2 腦外傷SD大鼠第3天腦內谷氨酸和天冬氨酸的含量（μmol/L，±s）

與空白對照組比較：cP＜0.05、eP＜0.05、gP＜0.05、iP＜0.05、dP＜0.05、fP＜0.05、hP＜0.05、jP＜0.05；與模型對照組比較：eP＞0.05、gP＞0.05、fP＞0.05、hP＞0.05，而iP＜0.05、jP＜0.05；與高氣壓組比較：gP＞0.05、hP＞0.05，而iP＜0.05、jP＜0.05；與高濃度氧組比較：iP＜0.05、jP＜0.05

興奮性氨基酸水平谷氨酸 天冬氨酸空白對照組 6 3 2.65±0.29a 1.05±1.02b模型對照組 6 3 13.72±2.27c 5.15±1.54d高氣壓組 6 3 12.34±1.95e 5.01±1.77f高濃度氧組 6 3 12.56±2.51g 4.98±1.82h高壓氧組 6 3 4.43±1.53i 2.03±1.05jF值 45.48 10.44 P值 ＜0.01 ＜0.01實驗分組 標本例數處理時間（d）

表3 腦外傷SD大鼠第6天腦內谷氨酸和天冬氨酸的含量（μmol/L，±s）

表3 腦外傷SD大鼠第6天腦內谷氨酸和天冬氨酸的含量（μmol/L，±s）

與空白對照組比較：mP＜0.05、oP＜0.05、qP＜0.05、sP＜0.05、nP＜0.05、pP＜0.05、rP＜0.05、tP＜0.05；與模型對照組比較：oP＞0.05、qP＞0.05、pP＞0.05、rP＞0.05，而sP＜0.05、tP＜0.05；與高氣壓組比較：qP＞0.05、rP＞0.05，而sP＜0.05、tP＜0.05；與高濃度氧組比較：sP＜0.05、tP＜0.05

興奮性氨基酸水平谷氨酸 天冬氨酸空白對照組 6 6 2.95±0.47k 1.54±1.38l模型對照組 6 6 14.28±2.67m 5.63±1.07n高氣壓組 6 6 13.94±2.56o 5.81±1.49p高濃度氧組 6 6 13.55±1.63q 5.43±1.99r高壓氧組 6 6 4.72±1.21s 2.74±1.67tF值 51.58 9.58 P值 ＜0.01 ＜0.01實驗分組 標本例數處理時間（d）

表4 腦外傷SD大鼠第9天腦內谷氨酸和天冬氨酸的含量（μmol/L，±s）

表4 腦外傷SD大鼠第9天腦內谷氨酸和天冬氨酸的含量（μmol/L，±s）

與空白對照組比較：wP＜0.05、yP＜0.05、#P＜0.05、*P＜0.05、xP＜0.05、zP＜0.05、$P＜0.05、**P＜0.05；與模型對照組比較：yP＞0.05、#P＞0.05、ZP＞0.05、SP＞0.05，而*P＜0.05、**P＜0.05；與高氣壓組比較：#P＞0.05、$P＞0.05，而*P＜0.05、**P＜0.05；與高濃度氧組比較：*P＜0.05、**P＜0.05

興奮性氨基酸水平谷氨酸 天冬氨酸空白對照組 6 9 3.17±0.82u 2.25±1.92v模型對照組 6 9 15.33±1.86w 1.37±1.98x高氣壓組 6 9 14.25±2.71y 7.31±1.64z高濃度氧組 6 9 13.55±2.03# 5.69±1.86$高壓氧組 6 9 4.84±1.95* 2.44±1.81**F值 51.07 11.47 P值 ＜0.01 ＜0.01實驗分組 標本例數處理時間（d）

討論

腦外傷是臨床常見急癥之一。腦外傷后有關腦組織繼發(fā)性損害的機制，也存在很多說法[1]：（1）EAA的毒性作用；（2）代謝過程的改變（包括高能量代謝、高分解代謝、糖耐受性降低等）；（3）單胺類神經遞質的改變（去甲腎上腺素、多巴胺及5-羫色胺等）；（4）神經肽的改變(神經降壓素及生長抑素等）；（5）內環(huán)境水、電解質的改變（Ca2+超載）[4]；（6）氧自由基等。其中EAA是腦外傷繼發(fā)性腦損傷重要的致傷機制之一[2]。

從表2～4可以看出EAA（Glu、Asp）在大鼠正常腦組織中低表達，但在腦外傷后腦組織中明顯高表達，隨著受傷時間的延長EAA較受傷第3天、第6天高呈稍高表達；經高氣壓、高濃度氧處理后第3天、第6天、第9天較模型對照組比較，EEA表達有所降低，但高氣壓組、高濃度氧組與模型對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。經高壓氧處理后第3天、第6天、第9天與空白對照組、模型對照組、高氣壓組、高濃度氧組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。高壓氧能有效抑制腦外傷大鼠腦內EEA在釋放；高壓氧組與空白對照組比較發(fā)現不能完全抑制EEA達到正常腦組內EEA的水平；研究已經證明：腦外傷后腦缺血、氧氧和糖源供應不足，腺苷三磷酸生成減少，誘導神經元和神經膠質細胞去極化，使突觸前膜電壓依賴性Ca2+通道開放，Glu大量釋放到突觸間隙；另外突觸前膜由于能量缺乏，對Glu的重攝取受到抑制，進一步增加了細胞外Glu的堆積。大量的Glu激活突觸后膜N-甲基-D-天冬氨酸受體，引起Ca2+大量內流，導致細胞內Ca2+超載，并啟動一系列神經細胞損傷的病理反應，如激活Ca2+依賴性蛋白溶解酶、核酸內切酶、磷脂酶、一氧化氮合酶等。其中激活的蛋白溶解酶能降解細胞骨架；激活的磷脂酶A2和環(huán)氧合酶可催化產生氧自由基，引起炎癥反應和細胞凋亡；激活的一氧化氮合酶催化產生過量的一氧化氮，能與超氧陰離子形成過氧亞硝酸根離子和輕自由基，損傷線粒體膜，使線粒體形成漏洞，開放線粒體轉換孔，致使離子平衡紊亂[5]；大量的Glu激活代謝型Glu受體，從而激活了與Ca2+蛋白相偶聯的磷脂酞肌醇信號轉導途徑，最終導致細胞通透性發(fā)生改變，使大量的Na+和C1-進入細胞內，水被動進入胞內引起細胞腫脹，誘導細胞壞死和凋亡[6]。因此，在腦損傷的過程中EAA的神經毒性作用既是損傷腦組織的啟動者又是執(zhí)行者[7]。

通過研究已證實的EAA興奮性神經毒性機制與目前高壓氧治療腦外傷的作用機制，高壓氧抑制EAA釋放改善神經功能及愈后的機理推測如下：（1）高壓氧可以提高血氧含量及氧分壓，使血氧彌散能力增強，改善缺血部位周圍組織氧的供給[8]，可抑制突觸前膜電壓依賴性Ca2+通道過度開放，從而抑制Glu大量釋放到突觸間隙；另外，改善突觸前膜能量缺乏，可改善Glu的重攝取，進一步減輕細胞外Glu的堆積；最終挽救半暗帶區(qū)的細胞，對缺血腦組織起到極大保護作用，最終降低死亡率和致殘率。（2）高壓氧抑制大量的Glu釋放，因此未能激活代謝型Glu受體，從而抑制與Ca2+蛋白相偶聯的磷脂酞肌醇信號轉導途徑，最終穩(wěn)定細胞通透性，使大量的Na+和C1-未能進入細胞內，緩解細胞腫脹，最終減輕細胞壞死和凋亡。此外，高壓氧有a-腎上腺素樣的作用，可使腦血管收縮，腦血流量減少，阻斷腦缺氧、腦水腫的惡性循環(huán)，從而降低顱內壓，減輕腦水腫[9]。高壓氧可促進血管再生和側枝循環(huán)的建立，改善局部循環(huán)，減輕局部腦水腫；降低血液粘滯度，抑制血栓形成，從而改善腦的微循環(huán)和血液灌注[10]；減少中性粒細胞浸潤[11]，提高腦組織清除氧自由基的能力，降低細胞免受損害[12]。由此聯系臨床：早期應用高壓氧對顱腦損傷具有明顯療效；重癥顱腦損傷昏迷患者的最佳治療時機是創(chuàng)傷后7～30 d[13]；應嚴格掌握人艙治療指征，適當的時間段給予適量的高壓氧治療，否則容易產生高壓氧中毒[14]。治療過程中監(jiān)測顱內壓、腦灌注壓、腦血流量、腦組織氧分壓和腦溫等[15]。本研證實高壓氧能有效抑制EAA的釋放，從而減輕EAA的神經興奮性毒性作用對神經細胞的損傷；高氣壓、高濃度氧不能有效抑制EAA的釋放。高壓氧能有效抑制EAA的釋放的確切分子機制有待于進一步研究。

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Effects of hyperbaric oxygen on the level of excitatory amino acids in the brain of rats with brain injury

He Shiqing1,Zou Yunlong1,Lei Beiping2.1Department of Neurosurgery,Affiliated Nanhua Hospital of South China,Hengyang 421002,China;2Department of Neurosurgery,169 General Hospital of Chinese PLA,Hengyang 421002,China

Zou Yunlong,Email:13973422100@139.com

ObjectiveTo study the effect of hyperbaric oxygen on the level of excitatory amino acids in the brain of rats with brain injury.MethodsBy making the models of traumatic brain injury in rats and design randomized experimental group:model control group,high pressure group,high concentration oxygen group and hyperbaric oxygen group were treated with brain injury rats.The contents of glutamic acid（Glu)and aspartate（Asp)were measured in rats at third days,sixth days and ninth days respectively.The contents of glutamic acid（Glu)and aspartate（Asp)were measured in rats at third days,sixth days and ninth days respectively.ResultsThe content of Glu and ASP in the brain tissue of rats with brain injury increased significantly and hyperbaric oxygen can be significantly reduced content of Glu and ASP.Compared with model control group,there were significant differences（P＜0.05).The high pressure group and high concentration oxygen group could not significantly inhibit the expression of Glu and Asp.Compared with the model group had no significant difference（P＞0.05).ConclusionHyperbaric oxygen can significantly inhibit the release of excitatory amino acids in brain tissue of rats with traumatic brain injury and reduce the secondary brain damage after traumatic brain injury,while high pressure,high concentration of oxygen can not significantly inhibit the release of EAA.

Cerebral injury;Excitatory amino acids；Hyperbaric oxygen therapy

2016-04-30）

（本文編輯：張麗）

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2016.05.007

湖南省衛(wèi)生廳一般項目（B2010-056)

421002 衡陽，南華大學附屬南華醫(yī)院神經外科1；421002 衡陽，中國人民解放軍第一六九總醫(yī)院高壓氧科2

鄒云龍，Email：13973422100@139.com

賀仕清,鄒云龍,雷北平.高壓氧對腦外傷大鼠腦內興奮性氨基酸水平的影響[J/CD].中華神經創(chuàng)傷外科電子雜志,2016,2(5): 289-292.