米諾環(huán)素改善血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能障礙的機(jī)制研究

龐慧 劉怡 韓冰 付強(qiáng)

·基礎(chǔ)研究·

米諾環(huán)素改善血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能障礙的機(jī)制研究

龐慧 劉怡 韓冰 付強(qiáng)

目的探索米諾環(huán)素是否在血管性癡呆導(dǎo)致的認(rèn)知功能損害發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定的神經(jīng)保護(hù)作用，并進(jìn)一步分析參與其中的相關(guān)分子機(jī)制。方法SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和米諾環(huán)素治療組。結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈建立大鼠血管性癡呆模型，術(shù)后腹腔注射米諾環(huán)素（25，50 mg/kg），28 d后進(jìn)行水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)知變化，HE染色和Western blotting分析大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制。結(jié)果（1）水迷宮認(rèn)知功能測(cè)試顯示，米諾環(huán)素能夠顯著縮短血管性癡呆大鼠尋找平臺(tái)的潛伏期，并且明顯延長(zhǎng)在目標(biāo)象限的停留時(shí)間，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2）HE染色顯示米諾環(huán)素能夠顯著減輕模型組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷。（3）米諾環(huán)素治療組含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Caspase-3）蛋白表達(dá)水平及Bax/Bcl-2比值較模型組明顯下降，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（4）與模型組相比，米諾環(huán)素組磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）及磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）蛋白表達(dá)水平明顯升高，磷酸化糖原合酶激酶-3β（p-GSK-3β）蛋白表達(dá)卻顯著下降，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論米諾環(huán)素通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制該通路下游靶分子GSK-3β活性，減少海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，在神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)和改善認(rèn)知功能障礙中發(fā)揮重要作用。

米諾環(huán)素；血管性癡呆；磷脂酰肌醇-3激酶；蛋白激酶B；糖原合酶激酶-3β

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是目前繼老年性癡呆之后，臨床發(fā)病率排在第二位的認(rèn)知功能障礙性疾病[1]。米諾環(huán)素作為半合成的第二代四環(huán)素，由于其具有較高的脂溶性，易通過血腦屏障，故可用于治療多發(fā)性硬化癥、阿爾茲海默病、帕金森病和腦損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[2,3]，但是米諾環(huán)素對(duì)于血管性癡呆認(rèn)知功能障礙的影響目前尚不清楚。本研究以結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈制備血管性癡呆大鼠模型為基礎(chǔ)，從海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的角度，探索米諾環(huán)素是否在血管性癡呆導(dǎo)致的認(rèn)知功能損害發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定的神經(jīng)保護(hù)作用，并進(jìn)一步分析參與其中的相關(guān)分子機(jī)制。

材料與方法

一、大鼠血管性癡呆模型的制備

清潔級(jí)雄性200 g的SD大鼠（徐州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供）隨機(jī)分為三組，假手術(shù)組（Sham）、血管性癡呆模型組（VD）、米諾環(huán)素（Sigma，USA）治療組。SD大鼠術(shù)前禁食過夜，自由飲水，10%水合氯醛腹腔麻醉后結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈。術(shù)后腹腔注射米諾環(huán)素（25，50 mg/kg）每天給藥一次直至動(dòng)物被處死。術(shù)后28 d，進(jìn)行Morris水迷宮行為訓(xùn)練及測(cè)試，處死后取海馬組織，檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。

二、Morris水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

術(shù)后28 d進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練，連續(xù)4 d，每天訓(xùn)練4次，2次訓(xùn)練之間間隔15～20 min。Morris迷宮直徑180 cm、高60 cm、水深40 cm的水池，水溫保持在25±1℃。用攝像儀監(jiān)測(cè)游泳活動(dòng)，并通過相連接的計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

1.定位航行試驗(yàn)：每次均隨機(jī)從4個(gè)不同象限的中點(diǎn)將大鼠頭朝池壁放入水中，平臺(tái)設(shè)在第IV象限的中央，如大鼠60 s內(nèi)找到并爬上平臺(tái)，讓其在平臺(tái)上停留30 s。如60 s內(nèi)未能找到平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)者用工具將其引導(dǎo)至平臺(tái)，同樣讓其在平臺(tái)上停留30 s。逃避潛伏期為大鼠從入水到找到平臺(tái)的時(shí)間，取每天訓(xùn)練所記逃避潛伏期的平均值作為當(dāng)日的逃避潛伏期。

2.空間探索試驗(yàn)：訓(xùn)練4 d后撤除平臺(tái)，將大鼠從第IV象限對(duì)側(cè)象限的中點(diǎn)頭朝池壁放入水中，任其在水中自由游泳120 s，記錄大鼠在原站臺(tái)象限的停留時(shí)間，觀察受試大鼠的空間定位能力，及在空間探索過程中的變化規(guī)律。

三、大鼠腦組織標(biāo)本制備及HE染色

大鼠麻醉后，開胸經(jīng)左心室插入灌流針并固定，切開右心耳，先灌注4℃生理鹽水，直到肝和肺臟顏色轉(zhuǎn)白及右心房流出液澄清，再灌注4℃的4%多聚甲醛，完畢后斷頭取腦，4%多聚甲醛浸泡固定24 h。常規(guī)梯度乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片。染色前，組織切片常規(guī)脫蠟，再經(jīng)由高濃度到低濃度酒精，最后入蒸餾水，即可HE染色，最后中性樹膠封片。

四、大鼠海馬組織中相關(guān)蛋白表達(dá)水平的Western blotting檢測(cè)

大鼠斷頭取腦，分離出的海馬組織與組織勻漿液混合后用玻璃勻漿器充分勻漿，4℃，1 500g離心5 min，取上清，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，-80℃凍存?zhèn)溆?。取總蛋白量一致的各樣品加入等體積的蛋白上樣緩沖液，置沸水浴中變性處理。變性蛋白質(zhì)樣品，經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，以半干轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。將硝酸纖維素膜置封閉液中室溫孵育后，加入一抗，4℃過夜，三乙醇胺緩沖鹽水溶液洗膜后加入堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜，水洗。使用BCIP/NBT顯色試劑盒顯色，流水洗滌終止反應(yīng)。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本均數(shù)間比較t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

水迷宮實(shí)驗(yàn)中VD大鼠尋找平臺(tái)的潛伏期明顯長(zhǎng)于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；米諾環(huán)素治療后大鼠尋找平臺(tái)潛伏期較VD組顯著縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）?？臻g探索試驗(yàn)中，VD大鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間顯著短于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；米諾環(huán)素治療組大鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間較VD組明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示米諾環(huán)素能夠減輕血管性癡呆大鼠記憶力的損害（圖1、2）。

二、大鼠海馬CA1區(qū)HE染色形態(tài)學(xué)觀察

假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞密度大，排列整齊緊密，細(xì)胞核大而圓，核仁清晰，染色質(zhì)豐富，胞漿清亮。血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)目減少，稀疏分布，排列散亂，層次不完整，細(xì)胞核體積變小、深染，呈核固縮表現(xiàn)，核仁消失，細(xì)胞質(zhì)呈強(qiáng)嗜酸性。米諾環(huán)素干預(yù)后海馬CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)變化較輕，病理改變輕微，個(gè)別神經(jīng)元變性、壞死（圖3）。

三、米諾環(huán)素對(duì)血管性癡呆大鼠海馬凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組大鼠相比較，VD大鼠Bax及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-3）蛋白表達(dá)水平顯著升高，而Bcl-2蛋白表達(dá)則明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。VD大鼠經(jīng)米諾環(huán)素治療后Bax及Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著下降，Bcl-2表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Bax/Bcl-2灰度比值，VD組高于假手術(shù)組，但米諾環(huán)素治療組Bax/Bcl-2比值較VD組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

四、米諾環(huán)素對(duì)血管性癡呆大鼠海馬PI3KAKT-GSK-3β蛋白表達(dá)的影響

VD組大鼠較假手術(shù)組大鼠磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）及磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-AKT）蛋白表達(dá)量顯著降低，糖原合成酶激酶 3β（glycogen synthase kinase-3，GSK-3β）蛋白表達(dá)量卻明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。米諾環(huán)素治療后，與VD組相比較，PI3K及p-AKT蛋白表達(dá)水平明顯升高，p-GSK-3β蛋白表達(dá)卻顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖5）。

圖1 米諾環(huán)素對(duì)血管性癡呆大鼠尋找平臺(tái)潛伏期的影響

圖2 米諾環(huán)素對(duì)血管性癡呆大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間的影響

圖3 大鼠海馬CA1區(qū)病理形態(tài)比較（HE染色，×400）

討論

血管性癡呆是一組獲得性智能損害的臨床綜合征，由于腦血管病和心血管病導(dǎo)致腦功能障礙慢性、進(jìn)行性顱內(nèi)、外血管的直接、間接病變，是腦動(dòng)脈硬化性癡呆[4]。近年來隨著血管性癡呆的發(fā)病率日益升高，現(xiàn)已嚴(yán)重威脅人類的健康。長(zhǎng)期慢性腦供血不足是血管性癡呆形成的重要因素之一，結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈是典型的通過慢性缺血制備血管性癡呆動(dòng)物模型，其中的海馬是缺血效應(yīng)最為敏感的腦區(qū)之一[5]。

米諾環(huán)素現(xiàn)已證實(shí)對(duì)于多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有廣譜的抗炎、抗凋亡、抗氧化及血管保護(hù)作用[6]。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠皮層下缺血性血管性癡呆模型的早期和后期，米諾環(huán)素能促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞數(shù)目的增加，同時(shí)抑制成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的丟失。但在疾病中期，米諾環(huán)素卻明顯減少少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的數(shù)目，對(duì)成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞無明顯作用。由此可見，米諾環(huán)素對(duì)皮層下缺血性血管性癡呆后白質(zhì)損傷和認(rèn)知功能障礙的這種保護(hù)作用呈現(xiàn)階段依賴性[7]。另外，有報(bào)道指出米諾環(huán)素對(duì)于幼齡大鼠全腦照射誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡有顯著的抑制作用，減少照射后短期內(nèi)新生神經(jīng)細(xì)胞的丟失，同時(shí)還能改善全腦照射后導(dǎo)致的認(rèn)知功能損害，發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用[8]。淀粉樣蛋白β是阿爾茲海默病的主要致病物質(zhì)，它在腦內(nèi)過度產(chǎn)生和沉積，引起神經(jīng)元突觸功能障礙、Tau蛋白過度磷酸化和繼發(fā)炎性反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元變性死亡，最終產(chǎn)生癡呆。阿爾茲海默病小鼠經(jīng)米諾環(huán)素治療后，淀粉樣蛋白β的水平降低，繼發(fā)的炎性反應(yīng)被抑制，認(rèn)知功能障礙得到一定程度的改善，但是米諾環(huán)素對(duì)于降低Tau蛋白過度磷酸化療效不顯著[9]。

圖4 Western blotting檢測(cè)大鼠海馬凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

圖5 Western blotting檢測(cè)大鼠海馬PI3K-AKT-GSK-3β蛋白表達(dá)

本研究中水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)VD大鼠尋找平臺(tái)潛伏期延長(zhǎng)，空間探索試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示大鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間縮短，提示VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力較正常大鼠顯著下降。但米諾環(huán)素卻能在一定程度上改善VD大鼠的認(rèn)知功能障礙。海馬是大腦中主要負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)和記憶的區(qū)域，與記憶、壓力調(diào)節(jié)和空間導(dǎo)航密切相關(guān)。因此，海馬區(qū)功能損傷會(huì)嚴(yán)重影響人和動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶功能[10]。本研究通過檢測(cè)Bax、Bcl-2及Caspase-3蛋白表達(dá)水平，并同時(shí)結(jié)合Bax/Bcl-2的比值反應(yīng)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡傾向。與Bax、Bcl-2蛋白絕對(duì)表達(dá)水平相比，Bax/Bcl-2比值能夠更加準(zhǔn)確的反應(yīng)細(xì)胞凋亡。結(jié)果提示，VD大鼠的認(rèn)知功能障礙與海馬區(qū)細(xì)胞過度凋亡密切相關(guān)，而米諾環(huán)素能夠顯著抑制VD大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。由此筆者推斷，米諾環(huán)素改善VD大鼠的認(rèn)知功能障礙可能與它對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞的抗凋亡密切相關(guān)。

PI3K蛋白參與增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。PI3K為異源二聚體，由一個(gè)調(diào)節(jié)亞基和一個(gè)催化亞基組成。AKT為PI3K下游主要的效應(yīng)物，PI3K激活后產(chǎn)生第二信使磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸，進(jìn)而磷酸化 AKT蛋白的Ser308導(dǎo)致AKT活化?；罨腁KT通過磷酸化多種酶、激酶和轉(zhuǎn)錄因子等下游因子，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能[11]。GSK-3β是一種可磷酸化抑制糖原合成酶的絲/蘇氨酸蛋白激酶，是糖原合成的關(guān)鍵調(diào)控酶，腦內(nèi)分布廣泛，在皮層錐體細(xì)胞層、海馬錐體細(xì)胞層、齒回顆粒層、紋狀體及丘腦等區(qū)域分布較為密集。GSK-3β是PI3K/AKT和Wnt/β-catenin細(xì)胞信號(hào)通路的關(guān)鍵組成部分，參與細(xì)胞黏附功能調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化與增殖、細(xì)胞凋亡等[12]。

研究發(fā)現(xiàn)，VD組大鼠較假手術(shù)組大鼠PI3K及p-AKT蛋白表達(dá)量顯著降低，p-GSK-3β蛋白表達(dá)量卻明顯增高。米諾環(huán)素治療后，與VD組相比較，PI3K及p-AKT蛋白表達(dá)水平明顯升高，p-GSK-3β蛋白表達(dá)卻顯著下降。筆者由此推斷，米諾環(huán)素通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制該通路下游靶分子GSK-3β活性，減少海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，在神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)和改善認(rèn)知功能障礙中發(fā)揮重要作用。以上研究探索米諾環(huán)素抗菌作用外神經(jīng)保護(hù)的新領(lǐng)域，為治療血管性癡呆的新機(jī)制和防治的新策略提供一定的理論基礎(chǔ)。

[1]Cunningham EL,McGuinness B,Herron B,et al.Dementia[J]. Ulster Med J,2015,84(2):79-87.

[2]Szeto GL,Pomerantz JL,Graham DR,et al.Minocycline suppresses activation of nuclear factor of activated T cells 1 (NFAT1)in human CD4+Tcells[J].J Biol Chem,2011,286(13): 11275-11282.

[3]Ferretti MT,Allard S,Partridge V,et al.Minocycline corrects early,pre-plaque neuroinflammation and inhibits BACE-1 in a transgenic model of Alzheimer′s disease-like amyloid pathology [J].J Neuroinflammation,2012,9:62.

[4]Kalaria RN.Neuropathological diagnosis of vascular cognitive impairment and vascular dementia with implications for Alzheimer′s disease[J].Acta Neuropathol,2016,131(5):659-685.

[5]Choi DH,Lee KH,Lee J.Effect of exercise-induced neurogenesis on cognitive function deficit in a rat model of?vascular dementia [J].Mol Med Rep,2016,13(4):2981-2990.

[6]Garrido-Mesa N,Zarzuelo A,Galvez J.Minocycline:far beyond an antibiotic[J].Br J Pharmacol,2013,169(2):337-352.

[7]Ma J,Zhang J,Hou WW,et al.Early treatment of minocycline alleviates white matter and cognitive impairments after chronic cerebral hypoperfusion[J].Sci Rep,2015,5:12079.

[8]Zhang L,Li K,Sun R,et al.Minocycline ameliorates cognitive impairment induced by whole-brain irradiation:an animal study [J].Radiat Oncol,2014,9:281.

[9]Parachikova A,Vasilevko V,Cribbs DH,et al.Reductions in amyloid-beta-derived neuroinflammation, with minocycline, restore cognition but do not significantly affect tau hyperphosphorylation[J].J Alzheimers Dis,2010,21(2):527-542.

[10]Sun JH,Tan L,Yu JT.Post-stroke cognitive impairment: epidemiology,mechanisms and management[J].Ann Transl Med, 2014,2(8):80.

[11]Jha SK,Jha NK,Kar R,et al.p38 MAPK and PI3K/AKT signalling cascades in Parkinson's disease[J].Int J Mol Cell Med, 2015,4(2):67-86.

[12]Lazzara CA,Kim YH.Potential application of lithium in Parkinson′s and other neurodegenerative diseases[J].Front Neurosci, 2015,9:403.

Minocycline prevents cognitive impairment in a rat model of vascular dementia

Pang Hui,Liu Yi,Han Bing,Fu Qiang.Department of Cardiovascular Medicine,XuZhou Central Hospital,Xuzhou 221009,China

Pang Hui,Email:phui81@126.com

ObjectiveTo explore the neuroprotective effect of minocycline on cognitive impairment in a rat model of vascular dementia(VD)and its potential molecular mechanism.MethodsSD male rats were randomly divided into the sham-operation group,vascular dementia group and minocycline treated group.Rats were administered with minocycline by intraperitoneal injection after the surgery of bilateral common carotid artery occlusion.After 28 days,the Morris water maze test was carried out to test the spatial learning and memory ability of rats.The morphological changes of brain were observed by HE staining.Western blot was used to evaluate apoptosis mechanism of rat hippocampal neurons.Results(1) Minocycline treatment to VD rats significantly shortened the escape latency compared to the VD rats.In addition,Minocycline treated group spent more time in the target quadrant than the VD rats(P＜0.05).(2)HE staining showed that minocycline could obviously protect the hippocampal neurons against damage in VD rats.(3)The protein expression of caspase-3 and Bax/Bcl-2 ratio in the minocycline administration group were significantly lower than those of the VD group(P＜0.05).(4)Although minocycline decreased p-GSK-3β expression relatively to the VD group,the protein expression of PI3K and p-AKT in the minocycline treated group was significantly higher than that of the control group(P＜0.05).ConclusionMinocycline protects against apoptosis of hippocampal neurons via the activation of PI3K/AKT signaling pathway and the inhibition of downstream target protein GSK-3β activity.Minocycline can play an important role in the protection of hippocampal neurons and the improvement of cognitive dysfunction.

Minocycline；Vascular Dementia；PI3K；AKT；GSK-3β

2016-03-05）

（本文編輯：張麗）

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2016.04.008

221009徐州，徐州市中心醫(yī)院心內(nèi)科

龐慧，Email：phui81@126.com

龐慧,劉怡,韓冰,等.米諾環(huán)素改善血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能障礙的機(jī)制研究[J/CD].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志,2016,2 (4):223-227.