微球體的制備及其在修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷研究中的應(yīng)用

徐美玲 張魯中 王曉冬 陳 雪*

1(南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，江蘇 南通 226001)2(南通大學(xué)江蘇神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南通 226001)

微球體的制備及其在修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷研究中的應(yīng)用

徐美玲1張魯中2王曉冬1陳 雪1*

1(南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，江蘇 南通 226001)2(南通大學(xué)江蘇神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南通 226001)

利用組織工程技術(shù)制備神經(jīng)支架應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)已經(jīng)成為神經(jīng)系統(tǒng)再生研究領(lǐng)域的重點(diǎn)，其中利用生物材料以微球體形式，持續(xù)緩慢釋放活性物質(zhì)，有利于神經(jīng)系統(tǒng)再生的微環(huán)境改善，也是研究的熱點(diǎn)。本文就微球體制備的相關(guān)材料、制備方法、檢測(cè)及在神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)中的作用等進(jìn)行綜述，并進(jìn)行了總結(jié)和展望。

微球體；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；神經(jīng)系統(tǒng)損傷

引言

神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)一直是困惑人們的難題，尤其是針對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，而藥物治療，包括生物活性物質(zhì)的作用，常常是人們嘗試的方法。如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子能夠促進(jìn)神經(jīng)元的存活和軸突的生長(zhǎng)，并在體內(nèi)被證實(shí)能夠促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的再生[1]。然而，為了保證神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的安全與高效需要將它們局部、持續(xù)地遞送到神經(jīng)系統(tǒng)的損傷部位，這就需要借助藥物遞送系統(tǒng)。微球體因?yàn)榫哂休^高的表面與體積比、可控制的藥物釋放、較好的生物相容性及生物降解能力等特性已經(jīng)被廣泛地用于藥物遞送系統(tǒng)[2]。如Honorata等設(shè)計(jì)了包封NGF的膠原蛋白微球體(見(jiàn)圖1)，希望通過(guò)NGF的長(zhǎng)期緩慢釋放促進(jìn)神經(jīng)損傷組織的修復(fù)與再生[3]。采用乳化溶劑蒸發(fā)技術(shù)等方法制備出微球體，用來(lái)包封神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子并將其遞送到神經(jīng)系統(tǒng)的損傷部位，能在較長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)持續(xù)緩慢地釋放神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，為損傷的神經(jīng)組織提供良好的微環(huán)境，將有助于神經(jīng)組織的逐漸修復(fù)[4]。本文就微球體制備的相關(guān)材料、制備方法、檢測(cè)及在神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)中的作用等進(jìn)行綜述。

圖1 NGF包封到微球體中和NGF的釋放示意圖[3]Fig.1 Graphical representation of the NGF loading into spheres and NGF releasing[3]

1 材料

1.1 聚合物

用于制備微球體壁材的聚合物種類(lèi)雖然較多，主要包括天然高分子和合成高分子兩大類(lèi)。其中天然的聚合物主要包括殼聚糖(chitosan)、海藻酸鹽(alginate)等，而合成的聚合物主要包括聚乳酸(polylactic acid， PLA)、聚乳酸聚乙醇酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)等。

1.1.1 殼聚糖

由蟹、蝦的外殼及蠶蛹中提取出的甲殼素經(jīng)過(guò)脫乙酰作用后衍生得到殼聚糖[5]，它具有極好的生物相容性和生物降解能力，因而被廣泛地應(yīng)用于制備微球體。殼聚糖可溶于酸溶液，避免了使用危險(xiǎn)的有機(jī)溶劑制備微球體，減小了后期用于體內(nèi)研究可能產(chǎn)生的毒性風(fēng)險(xiǎn)[6]。且殼聚糖具有陽(yáng)離子性質(zhì)，它可以通過(guò)靜電作用與帶負(fù)電荷的多聚體及其他大分子緊密地結(jié)合在一起，形成微球體，并將攜帶的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子遞送到體內(nèi)合適的部位，使其保持穩(wěn)定的濃度，從而持續(xù)發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的生物活性[7]。Wen等制備了包封神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)的微球體，并將其固定到膠原蛋白-殼聚糖支架中，用于修復(fù)大鼠15mm長(zhǎng)的坐骨神經(jīng)缺損，發(fā)現(xiàn)損傷處的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維和感覺(jué)神經(jīng)纖維的數(shù)量明顯增加，表明了微球體持續(xù)緩慢的釋放NGF可能促進(jìn)了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)和感覺(jué)神經(jīng)的再生[8]。

使用乳化溶劑蒸發(fā)技術(shù)制備殼聚糖微球體時(shí)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是通過(guò)物理學(xué)靜電作用包封到殼聚糖微球體中的，因此神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可能僅僅與殼聚糖鏈發(fā)生纏繞作用，一旦包封神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的微球體暴露到釋放介質(zhì)中，殼聚糖鏈與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子之間的物理纏繞就會(huì)很容易解纏繞，因?yàn)闅ぞ厶呛蜕窠?jīng)營(yíng)養(yǎng)因子都具有高度的親水性，從而導(dǎo)致最初顯著的爆發(fā)式釋放[9]。盡管在體外研究神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子從微球體中釋放的速率較快，不能滿足在體內(nèi)對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子長(zhǎng)期釋放的需求，但是將包封神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的微球體固定到神經(jīng)支架中，可能會(huì)顯著地減少最初爆發(fā)式釋放的特征，因此，將神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、微球體、神經(jīng)支架與靶細(xì)胞組合起來(lái)[10]，作為復(fù)合材料應(yīng)用到神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究中，將是未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)[11]。

1.1.2 海藻酸鹽

海藻酸鹽是從褐藻中提取出的陰離子線性多糖[12]，具有良好的生物相容性和生物降解能力，因此，常被作為載體包封材料用于藥物遞送系統(tǒng)[13]。使用海藻酸鹽制備的微球體具有pH敏感性，粒徑適宜，可防止突釋等優(yōu)點(diǎn)，海藻酸鹽為陰離子型高分子，遇到陽(yáng)離子時(shí)會(huì)產(chǎn)生凝膠層，阻滯藥物釋放，從而達(dá)到緩釋作用[14]。Tanihara等用肝素/海藻酸人工細(xì)胞外基質(zhì)包封堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)[15]，發(fā)現(xiàn)在體外生理?xiàng)l件下，該因子可以持續(xù)釋放一個(gè)多月，并且能夠保持較好的生物活性，將其埋置于大鼠體內(nèi)，可以促進(jìn)周?chē)M織中新的血管形成，有利于神經(jīng)系統(tǒng)再生[16]。

1.1.3 聚乳酸

PLA是以乳酸為主要原料聚合形成的聚合物，制備PLA的原料來(lái)源充足，且制備過(guò)程無(wú)污染，可以通過(guò)三羧酸循環(huán)的方式生物降解為二氧化碳和水，是較為理想的綠色高分子材料，因此，使用PLA制備微球體將是一種很好的選擇。Guan等采用乳化溶劑蒸發(fā)技術(shù)制備了包封洛伐他汀的PLA微球體，并證明了PLA微球體可以顯著地延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)存在的時(shí)間，顯著地提高藥物的生物藥效[17]。

1.1.4 聚乳酸聚乙醇酸共聚物

PLGA是由乳酸和羥基乙酸兩種單體隨機(jī)聚合而成的無(wú)規(guī)共聚物，具有較好的生物相容性、生物降解能力和成囊性，被廣泛地應(yīng)用于生物工程與制藥工程[18]。不同的單體比例可以制備出不同類(lèi)型的PLGA，它們的降解速度也有較大差異，因而可以調(diào)控由PLGA制備的微球體的降解速度。PLGA的降解產(chǎn)物是乳酸和羥基乙酸，它們同時(shí)也是人體代謝的副產(chǎn)物，因而將PLGA制備成微球體用于蛋白質(zhì)遞送系統(tǒng)時(shí)，不會(huì)產(chǎn)生毒副作用[19]。Karal-Yilma等采用雙乳溶劑蒸發(fā)技術(shù)制備包封重組人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(recombinant human vascular endothelial growth factor，rhVEGF)的PLGA微球體，發(fā)現(xiàn)從微球體中釋放的rhVEGF能夠促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移，說(shuō)明釋放的rhVEGF的活性得到了保存[20]。Ralph 等設(shè)計(jì)了4種包封NGF的PLGA微球體，根據(jù)它們?cè)隗w內(nèi)的釋放曲線及其表面形態(tài)特征，選擇特性粘度為0.4 dL/g，由比例為50∶50的乳酸和乙醇酸組成的PLGA(50∶50 4A)制備的微球體用于大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型研究，效果較好[21]。

1.2 交聯(lián)劑

交聯(lián)劑是一種能夠使多個(gè)線型分子之間相互鍵合交聯(lián)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，它能夠調(diào)節(jié)或促進(jìn)聚合物分子鏈間共價(jià)鍵或離子鍵的形成。制備微球體常用的交聯(lián)劑主要有兩種：一種是物理交聯(lián)劑，例如三聚磷酸鈉(sodium tripolyphosphate，TPP)，這種交聯(lián)劑的交聯(lián)作用是可逆的；另一種是化學(xué)交聯(lián)劑，例如京尼平(genipin)、戊二醛(glutaraldehyde，GTA)，這種交聯(lián)劑在發(fā)揮交聯(lián)作用時(shí)會(huì)伴隨化學(xué)鍵的形成，因而它的作用是不可逆的。

1.2.1 三聚磷酸鈉

TPP是無(wú)毒的多聚陰離子，而殼聚糖是多聚陽(yáng)離子，因此它們可以通過(guò)靜電力發(fā)生相互作用[22]。TPP處理的殼聚糖微球體能夠提高它們?cè)谒幬镞f送系統(tǒng)中的穩(wěn)定性[23]。殼聚糖與TPP的不同質(zhì)量比例對(duì)制備微球體的形態(tài)大小和數(shù)量分布是有較大影響的，一般情況下選擇1∶4或者1∶3的質(zhì)量比例來(lái)制備微球體，因?yàn)檫@種比例制備出的微球體形態(tài)較好，且大小分布較為均勻，適用于遞送NGF等生物活性物質(zhì)[24]。

1.2.2 京尼平

京尼平是一種可從京尼平苷中獲取的天然水溶性雙功能交聯(lián)劑。與戊二醛相比，京尼平的細(xì)胞毒性要低很多，且具有很好的生物相容性，適用于局部藥物遞送系統(tǒng)[25]。Mangkorn等通過(guò)油包水型乳化溶劑擴(kuò)散方法，制備了京尼平交聯(lián)的包封牛血清白蛋白(albumin from bovine serum，BSA)的殼聚糖微球體，發(fā)現(xiàn)BSA的包封并不影響微球體的形狀，隨著京尼平濃度的增加，微球體的平均尺寸有輕微的增大，而當(dāng)交聯(lián)時(shí)間增加時(shí)，微球體的平均尺寸出現(xiàn)明顯變小[26]。

1.2.3 戊二醛

GTA在一定條件下能將線型高分子、單體或預(yù)聚物轉(zhuǎn)變成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。根據(jù)以前的研究，從殼聚糖微球體中釋放的藥物可以通過(guò)使用GTA交聯(lián)聚合物，從而被很好地控制釋放[27]。但GTA具有一定的毒性，可能與多肽和蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活，會(huì)對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生刺激作用，而且GTA交聯(lián)的微球體具有高爆發(fā)式釋放的作用[28]。鑒于GTA的這些缺點(diǎn)，Sun等將GTA和TPP共同作為交聯(lián)劑，采用兩步固定法，使用乳液交聯(lián)的方法制備包封5-氟尿嘧啶的殼聚糖微球體，使5-氟尿嘧啶的包封率達(dá)到78.5%，釋放總量達(dá)到58.7%[29]，說(shuō)明兩步固定法在藥物遞送系統(tǒng)中具有較好的實(shí)用性，可以考慮使用這種方法制備包封修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷相關(guān)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的微球體，以發(fā)揮較好的遞送功能。

1.3 表面活性劑

表面活性劑(surfactant)是指在溶液的表面能定向排列、具有固定的親水親油基團(tuán)的物質(zhì)，加入少量的該物質(zhì)到溶液體系中就能夠使溶液體系的界面狀態(tài)發(fā)生明顯的變化[30]。表面活性劑可分為離子型、非離子型和兩性型等[31]。Span80是非離子型表面活性劑，常常以乳化劑的形式在制備微球體中發(fā)揮作用。在乳化溶劑蒸發(fā)技術(shù)中，作為油溶性的乳化劑，Span80通過(guò)吸附到乳滴的表面增加了外部油相的粘性，使得較低比率的水從乳滴分散到外部的持續(xù)相中，穩(wěn)定了生成的乳滴，促進(jìn)了水/油(Water/Oil，W/O)乳液的形成[32]。

2 微球體的常用制備方法

微球體思路如圖2所示[3]。首先利用生物材料制備出球狀形態(tài)較好的微球體，再將生物活性物質(zhì)包封到微球體內(nèi)，最后進(jìn)入體內(nèi)并使活性物質(zhì)能長(zhǎng)期緩慢釋放出來(lái)，發(fā)揮活性作用，以達(dá)到促進(jìn)損傷組織或病變組織的再生與修復(fù)目的。

圖2 空心膠原蛋白微球體的制備和蛋白質(zhì)的裝載/釋放[3]Fig.2 Graphical representation of the fabrication of hollow collagen microspheres and protein loading/release[3]

2.1 乳化溶劑蒸發(fā)技術(shù)

近年來(lái)，用于制備微球體的乳化溶劑蒸發(fā)技術(shù)已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用[33]。利用該技術(shù)制備包封神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的微球體也取得了一定的進(jìn)展。Cao等采用乳化溶劑蒸發(fā)技術(shù)制備了PLGA微球體，發(fā)現(xiàn)空載的微球體表面形態(tài)光滑，而包封NGF的微球體表面相對(duì)粗糙且有小孔的存在[34]。Wen等將NGF添加到殼聚糖醋酸溶液中作為水相，含有表面活性劑的液體石蠟作為油相，制備出的NGF殼聚糖微球體表面形態(tài)相對(duì)粗糙、球狀、無(wú)空洞或者變形，這種方法制備出的殼聚糖微球體能夠緩釋有生物活性的NGF,且在體外研究中發(fā)現(xiàn)從微球體中釋放的NGF，能夠維持PC12細(xì)胞(pheochromocytoma cells, PC12)的存活及促進(jìn)其分化為神經(jīng)細(xì)胞的表型，這對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的再生與修復(fù)可能有很大幫助作用[24]。

2.2 油包水乳液溶劑擴(kuò)散的方法

絲素蛋白(silk fibroin，SF)是一種具有生物相容性和生物降解能力的纖維蛋白，被廣泛地應(yīng)用于組織工程和控制釋放藥物系統(tǒng)[35-36]。熱燒結(jié)方法[37]、噴霧干燥法[38]等已經(jīng)被報(bào)道可以用來(lái)制備SF微球體，但是這些方法在制備的過(guò)程中用酒精或加熱處理后，需要改變SF基質(zhì)從水溶性的隨機(jī)蜷曲形式轉(zhuǎn)變?yōu)樗蝗苄缘摩?折疊形式。油包水乳液溶劑擴(kuò)散的方法就用來(lái)制備疏水的可生物降解的聚合物。Baimark等采用油包水乳液溶劑擴(kuò)散的方法制備出具有球狀形態(tài)且表面比較光滑的絲素蛋白微球體，發(fā)現(xiàn)交聯(lián)過(guò)程誘導(dǎo)了SF構(gòu)象從隨機(jī)蜷曲形式轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊形式，而且當(dāng)SF的交聯(lián)度增加時(shí)，SF微粒的孔隙度減少，熱穩(wěn)定性增加[39],這種絲素蛋白微球體適用于包封神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等親水性的物質(zhì)，用于修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷。

3 微球體的檢測(cè)指標(biāo)

3.1 粒徑的尺寸

通過(guò)不同的方法制備出的微球體的尺寸分布范圍廣泛：從幾微米到幾十微米、甚至幾百微米大小的微粒[9, 21]。Zeng等制備出的絲素蛋白殼聚糖微球體的大小分布在70～150 μm，且該微球的顆粒尺寸分布近似高斯分布[40]。Wen等用干法粒度分析儀檢測(cè)出由不同濃度的TPP交聯(lián)制備的NGF殼聚糖微球體的平均大小是20.5～31.2 μm[24]。在成年大鼠脊髓橫斷損傷模型研究中，支架中通道的直徑較大時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的纖維邊緣，減少軸突的再生，支架中通道的直徑較小時(shí)，有益于軸突再生[41]。因此，用于脊髓損傷修復(fù)的支架尺寸一般控制在幾百微米范圍內(nèi)[42]。當(dāng)微球體的尺寸過(guò)小時(shí)，不適合包封大分子、蛋白質(zhì)等物質(zhì)；當(dāng)微球體的尺寸過(guò)大時(shí)，微球體可能會(huì)阻塞支架通道，阻礙軸突的生長(zhǎng)。因此在使用乳化溶劑蒸發(fā)技術(shù)制備微球體的過(guò)程中，會(huì)控制采用的溶液濃度和攪拌速度，以獲取適當(dāng)粒徑的微球體，用于進(jìn)一步研究其包封物質(zhì)的釋放機(jī)制[43]。

3.2 包封率

包封率(encapsulation efficiency，EE)指被包裹的物質(zhì)在微球體懸液中占投入的該物質(zhì)總量的百分比。蛋白質(zhì)或其他大分子物質(zhì)包封到微球體中，往往需要檢測(cè)微球體的包封率[44]。Huang等用TPP作為交聯(lián)劑制備了包封神經(jīng)生長(zhǎng)因子的殼聚糖微球體，使用NGF ELISA kit 檢測(cè)了包封率，發(fā)現(xiàn)隨著TPP濃度的增加，NGF在微球體中的裝載量和包封率降低，可能是因?yàn)樵谥苽湮⑶蝮w的過(guò)程中，帶負(fù)電荷的TPP首先與帶正電荷的殼聚糖反應(yīng)，當(dāng)TPP數(shù)量過(guò)多時(shí)，TPP就會(huì)與帶正電荷的NGF反應(yīng)，這會(huì)影響NGF摻合到殼聚糖中的過(guò)程[24]。這些都說(shuō)明TPP對(duì)微球體的包封率具有顯著的影響作用，可以通過(guò)控制TPP的使用量來(lái)選擇需要的包封率。

3.3 溶脹指數(shù)

微球體的溶脹指數(shù)(swelling index，SI)是通過(guò)浸泡到磷酸緩沖液中，采用重量分析方法獲得的。Liao等發(fā)現(xiàn)當(dāng)TPP與殼聚糖的質(zhì)量比例由1∶1上升至6∶1時(shí)，微球體的溶脹指數(shù)顯著下降。親水性聚合物的溶脹指數(shù)會(huì)嚴(yán)重影響它們的藥物釋放行為，而且包封藥物的聚合物支架的較大SI值通常與藥物最初的爆發(fā)釋放及隨后的快速釋放相關(guān)[7]。SI值過(guò)小時(shí)，微球體中包封的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子不容易釋放出來(lái)，SI值過(guò)大時(shí)，包封的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子會(huì)出現(xiàn)初期高爆發(fā)釋放，導(dǎo)致神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子大量流失，后期神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子供應(yīng)不足。

3.4 降解率

作為遞送系統(tǒng)的介質(zhì)，除了將需要的物質(zhì)遞送到特定的損傷部位外，微球體也需要以恰當(dāng)?shù)乃俣冉到?，為損傷的神經(jīng)系統(tǒng)提供較大的修復(fù)空間。作為制備微球體常用的聚合物，殼聚糖的降解速度較快，添加其他生物材料可以降低其降解速度，從而在體內(nèi)移植后的較長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，能夠控制神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的釋放數(shù)量，使神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在較長(zhǎng)的修復(fù)時(shí)間內(nèi)維持穩(wěn)定的濃度，持續(xù)發(fā)揮促進(jìn)損傷修復(fù)的作用[45]。此外，殼聚糖的降解產(chǎn)物是殼寡糖，殼寡糖也具有良好的神經(jīng)細(xì)胞的親和力，它能夠支持神經(jīng)細(xì)胞粘附，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的分化和神經(jīng)突起向外生長(zhǎng)[45]，這樣殼聚糖微球體就能夠?qū)π迯?fù)損傷的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮雙重功效。

3.5 包封因子的生物活性

微球體在使用之前要用環(huán)氧乙烷熏蒸滅菌，然后對(duì)其進(jìn)行毒性檢測(cè)。從微球體中釋放的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是否保持了原來(lái)的生物活性，是評(píng)價(jià)微球體功能非常重要的指標(biāo)之一[46]，因此，常常將微球體釋放的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，從而檢測(cè)釋放出的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的生物活性是否受損。Liao等通過(guò)對(duì)PC12細(xì)胞軸突生長(zhǎng)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)于釋放NGF培養(yǎng)液中的PC12細(xì)胞出現(xiàn)了分化，其軸突的生長(zhǎng)超過(guò)了胞體長(zhǎng)度，說(shuō)明NGF的活性得到了較好的保存[7]。

3.6 包封因子的緩釋

微球體包裝活性物質(zhì)的主要目的就是緩釋這些物質(zhì)，以達(dá)到保持較長(zhǎng)時(shí)間的特定濃度。Huang等使用NGF ELISA kit檢測(cè)出4種不同類(lèi)型的殼聚糖微球體中釋放的NGF，在12 d時(shí)累積釋放量達(dá)到了70%以上，且都出現(xiàn)明顯的最初爆發(fā)式釋放的特征[7]。這可能和神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)與再生需要的時(shí)間較長(zhǎng)不相符，但可以通過(guò)將微球體固定到神經(jīng)支架中，延緩NGF的釋放速率而改善這一缺點(diǎn)。Sun等檢測(cè)出NGF從PLGA微球體中的釋放可持續(xù)90 d，累計(jì)釋放量達(dá)到60%，這滿足了神經(jīng)系統(tǒng)再生周期長(zhǎng)的需求。體外研究發(fā)現(xiàn)，與直接將神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子加入到支架中相比，使用微球體作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的遞送介質(zhì)后，可以明顯減少最初爆發(fā)式釋放的數(shù)量[47]。由于神經(jīng)系統(tǒng)損傷往往需要較長(zhǎng)的修復(fù)時(shí)間，因此在這段時(shí)間內(nèi)，需要于損傷部位維持穩(wěn)定的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子濃度，以促進(jìn)靶細(xì)胞的增殖與遷移及神經(jīng)元的再生，從而對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)起到穩(wěn)定而長(zhǎng)效的促進(jìn)作用。因此用微球體包封神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，然后固定到支架中，作用于神經(jīng)系統(tǒng)的損傷部位將是一種較好的方案。

4 結(jié)論及展望

近十幾年來(lái)，微球體作為藥物的遞送介質(zhì)，已經(jīng)有了較多的研究和報(bào)道[48]，但將神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子包封到微球體中，固定到支架上，持續(xù)緩慢釋放，發(fā)揮對(duì)靶細(xì)胞的增殖、分化與遷移等起調(diào)節(jié)作用，共同促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的再生與修復(fù)則是一個(gè)新的、需要進(jìn)一步探索的領(lǐng)域。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的生物活性保存條件十分苛刻，這是微球體緩釋的關(guān)鍵要素，而這一生物學(xué)活性的保護(hù)，涉及到因子與生物材料結(jié)合過(guò)程中的溫度、酸堿度及參與微球體形成和包封過(guò)程中使用的輔助化學(xué)試劑等對(duì)其的影響，也關(guān)系到因子與微球體的結(jié)合程度，能否保證持續(xù)緩慢釋放。所以，在因子與微球體結(jié)合的制作工藝中，就必須考慮到這些問(wèn)題，盡量避免引起蛋白質(zhì)失活的化學(xué)物質(zhì)及反應(yīng)環(huán)境。與此同時(shí)，因子緩釋的時(shí)間與劑量是另一個(gè)重要的指標(biāo)，如使用乳化溶劑蒸發(fā)技術(shù)制備殼聚糖微球體并用靜電作用包封神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子時(shí)，造成最初顯著的因子爆發(fā)式釋放，但如果將其再與組織工程材料支架結(jié)合，就能改善這種不利狀況。當(dāng)然，微球體的降解狀況也是需要注意的問(wèn)題，當(dāng)微球體以適宜的速度降解時(shí)，既能夠?yàn)樯窠?jīng)元的內(nèi)在延伸提供足夠的空間，又能長(zhǎng)時(shí)間控制釋放神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的時(shí)間，最終達(dá)到修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的目的。最后，要注意體外研究的緩釋效果，可能與體內(nèi)的實(shí)際情況大相徑庭，需要多方面、多指標(biāo)的驗(yàn)證?？傊挥谐浞值乜紤]制備微球體的各項(xiàng)條件，探索出最佳的方案，才能制備出具有較高實(shí)用價(jià)值的微球體，才能在最佳的修復(fù)時(shí)間內(nèi)，幫助損傷的神經(jīng)系統(tǒng)快速、高效地實(shí)現(xiàn)再生，這樣也才能使其在未來(lái)臨床應(yīng)用中發(fā)揮較好作用。

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Preparation of Microspheres and its Application in Nervous System′s Injury and Repair

Xu Meiling1Zhang Luzhong2Wang Xiaodong1Chen Xue1*

1(DepartmentofHistologyandEmbryology,MedicalCollegeofNantongUniversity,Nantong226001,Jiangsu，China)2(JiangsuKeyLaboratoryofNeuroregeneration,NantongUniversity,Nantong226001,Jiangsu，China)

Tissue engineering technology has been applied to prepare nerve conduits for repairing nervous system′s injury and has become the focus in the field of nervous system′s regeneration.Using biological materials in the form of microspheres has become main issues. Microspheres can release bioactive substances in a sustained and controlled manner,they improve the microenvironment of nervous system′s regeneration. This paper reviews candidate materials, fabrication techniques, and detection methods for preparing microspheres and discuss the role of microspheres in nervous system′s injury and repair.

microspheres; neurotrophin; nervous system′s injury

10.3969/j.issn.0258-8021. 2016. 04.011

2015-07-30， 錄用日期:2016-04-09

國(guó)家自然科學(xué)基金(81501610，81350030)

R318

A

0258-8021(2016) 04-0470-07

*通信作者(Corresponding author)， E-mail: biosnow@163.com