健步通絡熏蒸液對兔膝骨關節(jié)炎關節(jié)軟骨中細胞外信號調節(jié)激酶1/2表達的影響

劉紅杰　王鋼

摘要：目的 觀察健步通絡熏蒸液對兔膝骨關節(jié)炎關節(jié)軟骨中細胞外信號調節(jié)激酶1/2（ERK1/2）表達的影響，探討其關節(jié)軟骨保護作用機制。方法 26只新西蘭大白兔，隨機抽取6只作為空白組，余20只采用改良Hulth法制作骨關節(jié)炎模型，術后4周隨機抽取2只驗證造模是否成功，18只隨機分為模型組、熏洗組和降鈣素組。模型組采用自來水熏洗，熏洗組采用健步通絡熏蒸液熏洗，每次30 min，每日1次；降鈣素組給予降鈣素5 U/kg肌肉注射，每日1次，療程20 d。療程結束后行空氣栓塞致死，取關節(jié)軟骨觀察其大體形態(tài)，PCR檢測軟骨中ERK1/2含量。結果 與空白組比較，模型組關節(jié)面損傷嚴重，ERK1/2含量顯著升高；熏洗組和降鈣素組關節(jié)面損害較輕，且ERK1/2表達降低；熏洗組與降鈣素組比較，2組關節(jié)面損害及ERK1/2表達無明顯差異。結論 健步通絡熏蒸液對膝骨關節(jié)炎關節(jié)軟骨具有保護、抑制軟骨退變的作用，其機制可能與抑制ERK1/2表達有關。

關鍵詞：健步通絡熏蒸液；骨關節(jié)炎；關節(jié)軟骨；細胞外信號調節(jié)激酶1/2；兔

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.018

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）02-0063-04

Effects of Jianbu Tongluo Fumigation Fluid on Expression of ERK1/2 in Articular Cartilage of Rabbit Knee Osteoarthritis LIU Hong-jie1， WANG Gang2 （1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Affiliated Hospital of Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China）

Abstract： Objective To investigate the effects of Jianbu Tongluo Fumigation Fluid on the expression of extracellular signal-regulated kinase1/2 in articular cartilage of rabbit knee osteoarthritis； To discuss its related mechanism of action. Methods Six New Zealand white rabbits were randomly selected among 26 as blank group and 20 were made into osteoarthritis models by modified Hulth method. After four weeks， two rabbits were chosen to verify whether modeling was successful； 18 were randomly divided into model group， fumigation group and calcitonin group. The rabbits in model group and fumigation group were fumigated with water and Jianbu Tongluo Fumigation Fluid respectively， 30 min each time， 1 time a day. The rabbits in calcitonin group were treated with calcitonin intramuscular injection of 5 U/kg， 1 time a day. The treatment lasted twenty days. After twenty days， all rabbits were sacrificed through air embolism. The general configuration of articular cartilage was observed and PCR technique was used to detect the content of ERK1/2. Results Compared with the blank group， joint surface damage in the model group was more serious and the content of ERK1/2 increased. Joint surface damage in the fumigation group and calcitonin group was relative light， and the expression of ERK1/2 decreased in articular cartilage. Calcitonin group and fumigation group had no significant difference in joint surface damage and the expression of ERK1/2. Conclusion Jianbu Tongluo Fumigation Fluid can protect and inhibit the cartilage regression of knee osteoarthritis， and the mechanisms is associated with inhibition the expression of ERK1/2.

Key words： Jianbu Tongluo Fumigation Fluid； osteoarthritis； articular cartilage； extracellular signal-regulated kinase1/2； rabbits

基金項目：甘肅省自然科學研究基金計劃（1212RJZA087）

通訊作者：王鋼，E-mail：lhjtwq@163.com

骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種常見的老年性關節(jié)軟骨退行性改變的疾病，發(fā)病率逐年升高，膝關節(jié)最為常見。其中特征性、最基本的病理改變是關節(jié)軟骨的變性，加之骨贅形成、滑膜炎癥，從而導致一系列與之相關的臨床癥狀。OA屬中醫(yī)“痹證”“痿證”范疇。中醫(yī)治療OA歷史悠久，方法各異。健步通絡熏蒸液為甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院院內制劑，臨床觀察其具有治療OA的作用[1]。本實驗采用改良Hulth法制作OA模型，觀察健步通絡熏蒸液對關節(jié)軟骨細胞外信號調節(jié)激酶1/2（ERK1/2）表達的影響，探討其相關作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

4～6月齡新西蘭大白兔26只，雌雄不限，體質量2.0～2.5 kg，蘭州軍區(qū)總醫(yī)院動物實驗科，合格證號SCXK-（軍）2012-0020，分籠飼養(yǎng)，自由喂食。

1.2 藥物

健步通絡熏蒸液由透骨草20 g、伸筋草30 g、桑寄生30 g、杜仲30 g、羌活20 g、獨活20 g、川牛膝15 g、紅花15 g、當歸10 g、赤芍10 g、川芎15 g、乳香20 g、沒藥20 g、制川烏10 g、制草烏10 g、土鱉蟲10 g、山楂10 g、五味子15 g等組成，飲片由甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑科提供。降鈣素，山東綠葉制藥有限公司，批號2013075。

1.3 主要試劑與儀器

RT-RCR試劑盒（DBI公司），Trizol試劑（Invitrogen life technologies）。PCR儀（BIO-RAD S1000 Thermal Cycler公司），凝膠成像分析儀（Biobad），電泳儀（BIO-RAD公司），Q500微量紫外可見分光光度計（美國Quawell），HH.WZL.Cr42Ⅱ型電子恒溫三用水箱（汕頭市醫(yī)用設備廠），自制動物熏蒸裝置。

2 實驗方法

2.1 造模

采用改良Hulth法制作OA模型[2]。術前常規(guī)備皮，3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，取兔膝關節(jié)內側入路，切斷兔膝關節(jié)內側副韌帶和前交叉韌帶，切除內側半月板。術后連續(xù)1周予青霉素20萬U肌肉注射，1周后每日被動驅趕兔子活動30 min，連續(xù)4周。

2.2 分組

造模4周后，從20只造模的膝骨關節(jié)炎兔中隨機選取2只，行大體形態(tài)觀察及病理切片以驗證造模是否成功，余18只隨機分為模型組、熏洗組、降鈣素組，每組6只。另選6只作為空白組。

2.3 干預

空白組、模型組常規(guī)喂養(yǎng)，模型組、熏洗組均采用恒溫水箱進行熏洗，模型組采用自來水進行熏洗，熏洗組采用健步通絡熏蒸液進行熏洗。根據人和動物等量換算公式計算藥物用量。將每劑中藥治療前加水500 mL浸泡30 min后，放入電飯鍋加熱，煮沸后再煮15 min。然后將藥汁倒入電恒溫水箱內，將藥汁溫度控制在40 ℃，將預先準備的籠屜放在電恒溫水箱上預熱10 min，將兔放入籠屜中，熏洗組每次30 min，每日1次，共20 d。降鈣素組給予降鈣素5 U/kg肌肉注射，每日1次，共20 d。

2.4 標本采集

干預結束后各組動物行空氣栓塞法處死，切開右側后肢膝關節(jié)囊，顯露關節(jié)軟骨，取右后肢內側股骨髁關節(jié)面軟骨，軟骨標本生理鹽水沖洗表面血跡后立即放入液氮中備用。

2.5 觀察指標

2.5.1 關節(jié)軟骨組織大體形態(tài)觀察 肉眼觀察右后肢股骨髁關節(jié)軟骨的變化情況，參照Pelletier JP[3]標準進行評分。0分：關節(jié)面透明光整、色澤正常；1分：關節(jié)面粗糙，有小的裂隙且色澤灰黯；2分：關節(jié)面糜爛，軟骨缺損深達軟骨表層和中層；3分：關節(jié)面有潰瘍，缺損深達軟骨深層；4分：軟骨剝脫，軟骨下骨質暴露。

2.5.2 關節(jié)軟骨電鏡觀察 標本生理鹽水沖洗表面血跡后放入4%多聚甲醛溶液中，固定48 h，15%乙二胺四乙酸脫鈣液進行脫鈣（每周更換1次脫鈣液），28 d后，石蠟包埋，切片，HE染色，鏡下觀察關節(jié)軟骨變化。參照Mankin's評分標準評分，見表1。

2.5.3 細胞外信號調節(jié)激酶1/2表達檢測 采用Trizol提取軟骨組織中總RNA，先后檢測RNA純度濃度，根據A260/A280比值為1.8～2.0及28 s、18 s的亮度比值，估測RNA質量。RNA反轉錄為cDNA包括RNA變性、反轉錄反應及PCR檢測基因片段。最終進行凝膠成像分析，應用Quantity one 4.61軟件分析系統(tǒng)進行灰度分析，計算相對灰度（目的基因灰度值÷β-actin灰度值×100%），分析所檢測基因的相對表達量。ERK1/2的引物設計由生工生物工程（上海）股份有限公司設計，見表2。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSSl7.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 大體形態(tài)觀察

空白組關節(jié)軟骨外觀正常，軟骨表面光滑，顏色正常，無關節(jié)面潰瘍及軟骨下骨質暴露；模型組可見關節(jié)軟骨表面粗糙不平，顏色偏黯，軟骨缺損糜爛并可見關節(jié)邊緣有大量骨贅形成；降鈣素組和熏洗組軟骨損害較模型組輕，軟骨表面欠光滑，個別區(qū)域顏色偏黯，可見少量骨贅。與空白組比較，造模組關節(jié)軟骨破壞程度嚴重（P<0.05）；與模型組比較，降鈣素組和熏洗組關節(jié)軟骨破壞較輕（P<0.05）；而降鈣素組與熏洗組比較，破壞程度無顯著差異（P>0.05）。結果見表3。

4.2 電鏡觀察結果

與空白組比較，模型組軟骨表面破損，裂隙四周可見大量細胞克隆現(xiàn)象，細胞數(shù)量減少且排列無序，基質染色非常不均，個別軟骨細胞核消失。熏洗組和降鈣素組關節(jié)軟骨的損傷程度介于二者之間，即軟骨表面不規(guī)則，變薄、粗糙，軟骨細胞數(shù)量正常、分布欠規(guī)則，基質染色比較均勻。結果見表4、圖1。

4.3 健步通絡熏蒸液對兔關節(jié)軟骨中細胞外信號調節(jié)激酶1/2表達的影響

模型組關節(jié)軟骨中ERK1/2 mRNA的表達明顯高于空白組（P<0.05）；與模型組比較，降鈣素組和熏洗組ERK1/2 mRNA表達降低（P<0.05），降鈣素組和熏洗組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結果見表5、圖2。

5 討論

健步通絡熏蒸液由伸筋草、制川烏、乳香、沒藥等組成，具有舒筋活血、補益肝腎、祛風除濕、活血消腫之功。其中伸筋草在《本草拾遺》中記載：“主人久患風痹，腳膝疼冷，皮膚不仁，氣力衰弱?！爆F(xiàn)代藥理研究表明，伸筋草具有免疫調節(jié)、清除自由基等作用，其復方制劑酊劑、乳膏劑均能治療關節(jié)炎等[4]。制川烏在《長沙藥解》中記載“其性疏利迅速，開通關腠，驅逐寒濕之力甚捷”?，F(xiàn)代藥理研究表明，川烏有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調節(jié)、抗腫瘤強心作用[5]。乳香、沒藥活血行氣止痛，現(xiàn)代藥理研究表明，二者配伍能抑制血小板聚集，增強活血化瘀的功效[6]。

本實驗結果顯示，空白組較模型組ERK1/2 mRNA 表達呈上升趨勢，提示ERK1/2參與OA關節(jié)軟骨的破壞。范氏等[7]亦發(fā)現(xiàn)，ERK參與軟骨細胞的增殖、分化及肥大，阻斷ERK通路可降低骨關節(jié)炎關節(jié)軟骨的破壞，抑制軟骨細胞的增殖，從而減輕軟骨損傷、鈣化和骨贅的形成，延緩病情的發(fā)展。本實驗采用健步通絡熏蒸液干預兔OA模型，發(fā)現(xiàn)其能抑制ERK1/2 mRNA表達，改善關節(jié)軟骨的損傷，延緩OA的病程進展。但本實驗的樣本量少，難以保證實驗的可靠性，在以后的研究中應擴大樣本量，提高實驗的科學性。OA發(fā)病機制十分復雜，受多種信號通路的影響，而ERK1/2只是其中之一。

參考文獻：

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（收稿日期：2015-03-24）

（修回日期：2015-04-27；編輯：華強）