口蹄疫診斷技術(shù)的研究進展

特尼格爾，黃天鵬

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

口蹄疫診斷技術(shù)的研究進展

特尼格爾，黃天鵬

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

口蹄疫的準確診斷是有效控制疫情蔓延的重要環(huán)節(jié)。隨著生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，口蹄疫的診斷已經(jīng)不再局限于傳統(tǒng)方法。目前，常用的口蹄疫診斷方法包括血清學(xué)檢測、分子生物學(xué)診斷和病原學(xué)診斷，其中以血清學(xué)檢測的應(yīng)用最為廣泛。闡述了3種診斷方法的原理及優(yōu)缺點，并展望了口蹄疫診斷技術(shù)未來的發(fā)展方向。

口蹄疫；血清學(xué)檢測；分子生物學(xué)診斷；病原學(xué)診斷

口蹄疫（foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒 （foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）感染而引起的偶蹄動物（豬、牛、羊、駱駝、鹿等）最重要的傳染病之一［1］。其主要特征表現(xiàn)為患病家畜的無毛或者少毛部位，如乳房、蹄及口腔黏膜出現(xiàn)水泡和潰爛，人們往往基于這些特征對該病進行初步的診斷。然而，有時僅通過其臨床表現(xiàn)又難以與其他水泡性疾病，如水泡性口炎（vesicular stomatitis，VS）和豬水泡?。╯wine vesicular disease，SVD）等進行鑒別診斷，因此，必須利用更加有效的方法進行準確診斷，如實驗室診斷方法［2］。目前，國內(nèi)外已經(jīng)建立了多種FMD的實驗室診斷方法，主要包括血清學(xué)檢測、分子生物學(xué)診斷和病原學(xué)診斷3大類，這3大類方法的建立為FMD的科學(xué)診斷及有效預(yù)防提供了有力的技術(shù)保障。

1 血清學(xué)檢測

血清學(xué)檢測是指從動物機體分離出FMDV后，將分離的FMDV作為抗原，與患病動物的血清發(fā)生凝集反應(yīng)的試驗，主要包括免疫擴散試驗、補體結(jié)合試驗、病毒中和試驗、凝集試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗等。

1.1 免疫擴散試驗 （agar gel immunodiffusion，AGID） 應(yīng)用AGID技術(shù)不僅可以檢測FMDV抗原，而且還可以檢測FMDV抗體。其原理是當FMDV與相應(yīng)的抗體結(jié)合后，在某些電解質(zhì)參與的條件下經(jīng)過一定時間的反應(yīng)，出現(xiàn)肉眼可見的明顯的白色沉淀線，并能在48 h之內(nèi)觀察到試驗結(jié)果。AGID技術(shù)的主要用途有鑒定FMDV抗原的純度、檢測FMDV抗體的效價等，其操作步驟簡便、快捷，但其敏感性較低。

1.2 補體結(jié)合試驗 （complement fixation test，CFT） 自Brooksby在1952年發(fā)明了CFT技術(shù)以來，人們對該種方法的應(yīng)用已有半個多世紀的歷史。其工作原理是當FMDV抗原與相應(yīng)的抗體反應(yīng)形成抗原—抗體復(fù)合物后，該復(fù)合物能夠結(jié)合補體，在致敏紅細胞（溶血素）的作用下會引起紅細胞腫脹，進而出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，因此，人們往往通過是否出現(xiàn)溶血反應(yīng)來判定家畜是否感染FMDV［3］。該方法主要有如下優(yōu)點：應(yīng)用范圍廣、試驗結(jié)果顯而易見、對試驗條件的要求低等。然而該方法也存在著一些缺陷，如敏感性低、操作步驟繁瑣、反應(yīng)過程易受到外界因素的干擾等［4］。

1.3 病毒中和試驗 （virus neutralization test，VNT） VNT技術(shù)的原理為：FMDV與相應(yīng)的抗體結(jié)合后，使抗原失去吸附細胞的能力，從而失去了對易感動物的侵襲力。其操作方法是：用不同比例稀釋的FMDV陽性血清與FMDV均勻混合，在室溫條件下放置一段時間后接種細胞管。通過仔細地觀察細胞病變，以能保護半數(shù)細胞管中的細胞不被FMDV吞噬的血清稀釋比例為終點。中和抗體的特異性高，且在動物機體內(nèi)能夠維持很長一段時間，但需要培養(yǎng)單層細胞。目前，VNT技術(shù)對FMDV檢測的用途比較廣泛，主要有FMDV分離株的鑒定、FMDV疫苗免疫原性的研究、免疫血清的質(zhì)量評價、檢測實驗動物血清是否含有FMDV抗體等。

1.4 間接紅細胞凝集試驗（indirect hemagglutination assay，IHA） 該技術(shù)由 Hirst等在 1941年發(fā)明，利用IHA技術(shù)可以對FMDV進行定性和定量檢測。將FMDV抗原用化學(xué)方法吸附在綿羊紅細胞載體上，形成致敏紅細胞，當致敏紅細胞在電解質(zhì)的環(huán)境下與被檢相應(yīng)抗體相遇時，會與其特異性抗體結(jié)合，發(fā)生肉眼可見的凝集反應(yīng)［5］。IHA技術(shù)包括2種，即正向與反向，分別用來檢測血清中的抗體及抗原水平。由于該反應(yīng)是通過抗原抗體特異性反應(yīng)而間接地帶動紅細胞的凝集，因此被稱為間接紅細胞凝集試驗。該方法的優(yōu)點是易于判定結(jié)果、操作步驟較為簡單且經(jīng)濟實用，但有時不能辨別FMDV 自然感染及免疫接種［6］。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） ELISA技術(shù)首次報道于1971年，是由Engvall和Perlman建立的。ELISA技術(shù)是目前應(yīng)用最為廣泛、發(fā)展最快的免疫學(xué)技術(shù)之一，其廣泛應(yīng)用于不同病原生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等疾病的診斷。其基本原理是將特異性的抗體包被于聚苯乙烯微量反應(yīng)板，加入待檢抗原，經(jīng)過37℃溫育與數(shù)次的洗滌后加入用特異性酶標記的抗體，再經(jīng)過孵育，洗滌除去游離的成分，最后用底物顯色。ELISA方法具有高靈敏度、高特異性、室溫下穩(wěn)定、操作方便、應(yīng)用范圍極為廣泛等優(yōu)點［7］。筆者主要介紹以下4種常用于檢測FMDV的ELISA方法。

1.5.1 液相阻斷ELISA （liquid phase blocking ELISA）：液相阻斷ELISA用于檢測FMDV衣殼蛋白的抗體，進而評估動物的免疫狀態(tài)［8］。其用途主要有2種：第1種是檢查待檢動物被FMDV感染的情況，目前被國際貿(mào)易機構(gòu)廣泛應(yīng)用；第2種是檢測免疫抗體，評估FMDV疫苗免疫動物抵抗病毒的能力［9］。1987 年，Hamblin 等創(chuàng)建了用于檢測 FMDV的液相阻斷ELISA方法，后經(jīng)試驗證明該方法具有敏感性高、結(jié)果準確、操作便捷等優(yōu)點，在普通實驗室條件下可以完成操作，因此在2004年該方法被OIE認可為標準化的FMD診斷技術(shù)［10］。該方法的缺點是假陽性結(jié)果的出現(xiàn)率較高，有時必須進一步通過VNT技術(shù)來對試驗結(jié)果進行驗證［6］。

1.5.2 間接夾心 ELISA（indirect sandwich ELISA）：間接夾心ELISA是利用FMDV抗體直接檢測FMDV，主要用途是鑒定FMDV的血清型，確定FMDV毒株與流行毒株的抗原譜關(guān)系。間接夾心ELISA的靈敏度相比于其他的ELISA方法更好，且檢測結(jié)果與病毒分離和電鏡檢測方法有著很高的符合率［11-13］。有研究報道，應(yīng)用該種方法進行病毒抗原檢測時，其檢測的靈敏度甚至超過了電鏡負染檢測方法［14］。利用該方法檢測FMDV的缺點是對試驗條件的要求較高，因此只能在專業(yè)實驗室中進行［6］。

1.5.3 間接 ELISA （indirect ELISA）：各類檢測FMDV的血清學(xué)方法當中，間接ELISA是目前應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一，其能夠?qū)MDV感染進行準確的診斷［15］。間接ELISA是通過FMDV的非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域（如2C、3AB及3ABC）來辨別自然FMDV感染動物與免疫動物的抗體［16］。用不同種抗原包被固相載體后，只需一種酶標記的二抗就可以鑒定多種抗體，因此，該方法在實踐中被廣泛應(yīng)用于各種病原生物抗體的檢測。但其操作過程較為繁瑣且極易受到外界條件的干擾而產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

1.5.4 固相競爭ELISA （solid phase competitive ELISA）：固相競爭ELISA的原理是以滅活的全病毒140S作為抗原，檢測FMDV抗體［17］。固相競爭ELISA方法不僅延續(xù)了液相阻斷ELISA的優(yōu)點，且其特異性超過99.5%，敏感性可達100%，因此更適用于大批血清的檢測［18］。由于該技術(shù)具有以上優(yōu)點，其在2004年被OIE指定為FMDV血清學(xué)檢測方法。林密等［19］利用固相競爭ELISA的方法對不同性質(zhì)的血清進行檢測，結(jié)果表明，A型及AsiaⅠ型疫苗株陽性血清并未出現(xiàn)陽性結(jié)果以及交叉反應(yīng)，證明了該方法的高度特異性。但固相競爭ELISA的洗滌過程比較多，有時可能會影響樣品檢測的速度，因此不適合快速地檢測大量樣品。

2 分子生物學(xué)診斷

FMDV的分子生物學(xué)診斷技術(shù)是通過各種分子生物學(xué)的方法來檢測待檢樣品是否含有FMDV的核酸序列，其應(yīng)用非常廣泛，可直接在牧場進行檢測并輔助完成病情的初步診斷。分子生物學(xué)技術(shù)具有很高的靈敏度，且能夠同時檢測多種樣品。分子生物學(xué)技術(shù)包括實時熒光PCR、核酸雜交、基因芯片、核酸雜交、等電點聚焦電泳、多重PCR等。

2.1 實時熒光PCR（real time RT-PCR） 實時熒光PCR主要應(yīng)用于FMDV的快速檢測，是目前國內(nèi)標準的FMDV檢測方法之一。實時熒光PCR技術(shù)誕生于20世紀90年代末，該技術(shù)利用熒光染料或熒光標記的特異性探針來跟蹤PCR擴增產(chǎn)物的熒光信號，從而定性或定量地分析初始模板中的FMDV及其含量［20］。實時熒光PCR反應(yīng)在帶有透明蓋的單個塑料小管中進行，有效地減少了樣品之間交叉污染的機會，因此適用于FMD暴發(fā)后大規(guī)模樣品的檢測［21］。李永東等［22］通過TaqMan技術(shù)優(yōu)化了利用RT-PCR檢測FMDV的方法，建立的方法對FMDV的檢測下限為0.01TCID50，具有超高的敏感性。

由于實時熒光PCR不僅能夠檢測出FMDV，還能鑒定FMDV的血清型 （至少能夠鑒定出6種FMDV的血清型），其特異性很強，且在1 h之內(nèi)能夠得到結(jié)果，因此，目前該技術(shù)的應(yīng)用主要集中在FMD的快速診斷［10］。缺點是其相關(guān)的試劑很昂貴，需要提取基因組RNA，且有時會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，因此只能在專業(yè)實驗室的條件下才能對FMD進行診斷。

2.2 基因芯片技術(shù) 盡管實時熒光PCR方法具有很強的特異性，但單次檢測FMDV基因的樣品數(shù)量很有限。當FMD暴發(fā)時，有必要通過一種方法來同時檢測大量靶基因的表達，迅速準確地在基因組水平上闡述FMDV基因轉(zhuǎn)錄本的變化規(guī)律。為了滿足這些需求，基因芯片技術(shù)隨之誕生。

基因芯片是利用機械臂把FMDV基因片段點在玻璃片上，再經(jīng)過物理吸附作用達到固定化（cDNA芯片）。利用已知的FMDV核苷酸序列作為探針，與大量的靶核苷酸序列進行雜交，以檢測眾多基因的表達調(diào)控情況。在短短的幾十年內(nèi)，基因芯片技術(shù)就得到了蓬勃的發(fā)展，這是由于其能夠快速、準確、自動化、高通量地檢測靶基因［23］。然而有些相關(guān)問題仍然有待解決：樣本制備成本很高，操作復(fù)雜；靈敏度較低，標記沒有統(tǒng)一標準；要求實驗員能夠熟練地掌握設(shè)備的操作等［24］。

2.3 核苷酸序列分析 核苷酸序列分析法結(jié)合了熒光定量PCR與核酸序列測定技術(shù)，通過對樣品進行序列分析后與數(shù)據(jù)庫中已知的序列進行比較，尋找FMDV目的基因功能位點的位置?？蒲腥藛T運用該方法能夠判斷毒株的序列是否與已報道的FMDV序列存在同源性，并能夠繪制毒株的遺傳系統(tǒng)進化樹［25］。目前，核苷酸序列分析技術(shù)主要應(yīng)用于FMDV的遺傳變異、比較不同毒株核酸序列的同源性及疫源追蹤研究［21］。

3 病原學(xué)診斷

應(yīng)用生物學(xué)技術(shù)檢測FMDV也是一種比較實用的方法，其原理是利用FMDV上清接種動物使得動物細胞產(chǎn)生病變，再從動物體內(nèi)分離出FMDV，從而證實FMDV的存在。FMDV可以在多種動物細胞中增殖，但對不同細胞的敏感性也不盡相同。例如，F(xiàn)MDV對初代小牛甲狀腺（CTY）細胞的敏感性極高，其次是幼倉鼠腎細胞系BHK-21等［26］。因此，通常利用初代小牛甲狀腺細胞與幼倉鼠腎細胞系等敏感細胞系進行FMDV分離試驗。其結(jié)果是以動物細胞是否發(fā)生病變?yōu)楦鶕?jù)：如果接種FMDV上清48 h內(nèi)產(chǎn)生了細胞病變，則判定為陽性；如果接種FMDV上清48 h后細胞依然未發(fā)生病變，則對細胞進行連續(xù)傳代再觀察細胞是否病變，如果仍沒有細胞病變，則判定為陰性。病原學(xué)診斷的優(yōu)點為結(jié)果準確、可靠，但靈敏度較低，且耗時、耗力。

4 展望

FMD是世界范圍內(nèi)嚴重影響畜牧業(yè)健康發(fā)展的惡性傳染病，一旦暴發(fā)后會對畜牧產(chǎn)業(yè)造成毀滅性的災(zāi)難［27-28］。因此，盡早診斷FMD并有效地實施患病動物的隔離是非常關(guān)鍵的。通過上述闡述不難發(fā)現(xiàn)，各種FMDV檢測方法均有各自的優(yōu)缺點，實際檢測時應(yīng)基于批量檢測工作的需要來選擇最合適的方法。目前，對FMDV檢測技術(shù)的研究集中在ELISA試劑盒的研發(fā)、應(yīng)用免疫膠體金技術(shù)來進行定量檢測、實時熒光定量PCR及檢測活畜IgA、IgM的pen-side法等領(lǐng)域［6］。近年來，隨著對FMDV的深入研究，F(xiàn)MD的診斷技術(shù)也在日益成熟，很多科研人員正在試圖將多種FMDV檢測方法結(jié)合起來取長補短，進一步完善其應(yīng)用價值。

總之，未來的FMDV檢測方法的研究熱點會集中在血清學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。高效、快速、便于操作并適合基層應(yīng)用的方法必將成為FMD診斷技術(shù)的發(fā)展趨勢。

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Research Progress on Diagnostic Techniques of Foot-and-mouth Disease

Tenigeer，HUANG Tian-peng
（College of Veterinary Medicine，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot010018，China）

The accurate diagnosis of foot-and-mouth disease is essential to control the spread of the disease.With the rapid development of biotechnology,the diagnosis of foot-and-mouth disease is no longer restricted to traditional methods.At present,the commonly used methods are including serological detection which has the widest application range,molecular biological diagnosis and etiological diagnosis.In this paper,a review is given on the principle as well as advantages and disadvantages of the 3 above-mentioned diagnostic techniques,and the future development of foot-and-mouth disease diagnostic techniques is prospected.

foot-and-mouth disease；serological detection；molecular biological diagnosis；etiological diagnosis

S854.4；S855.3

A文章順序編號1672-5190（2016）03-0102-04

2016－03－05

特尼格爾（1990—），男，碩士，主要研究方向為獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)。

（責任編輯：趙俊利）